胡 耀 宋 潔,2* 王麗芳 敖長(zhǎng)金**

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)高校動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(呼和浩特)，內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，呼和浩特 010031)

奶牛乳房炎發(fā)病率高，治療成本昂貴，給全球奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。乳房炎主要由細(xì)菌侵入奶牛乳腺所致。本課題組前期采集我國(guó)內(nèi)蒙古、黑龍江、山東、上海、河北5個(gè)奶業(yè)主產(chǎn)省區(qū)的患乳房炎奶牛乳樣，對(duì)引起乳房炎的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、克雷伯氏菌及無乳鏈球菌等病原微生物進(jìn)行了分離鑒定和耐藥性評(píng)估，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌分離率最高[1]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是大腸桿菌細(xì)胞壁上的主要毒力因子，當(dāng)乳腺內(nèi)發(fā)生大腸桿菌感染時(shí)，進(jìn)入乳腺的細(xì)菌釋放出LPS，損傷奶牛乳腺細(xì)胞，導(dǎo)致奶牛乳脂率、乳蛋白率等顯著降低，產(chǎn)奶量大幅度減少甚至停產(chǎn)。抗生素是目前治療奶牛乳房炎最有效的手段，但其殘留性和毒副作用對(duì)人體健康危害極大，在全球范圍內(nèi)被逐漸禁用[2-3]。近年來眾多研究表明，蒿屬植物在替代抗生素方面有顯著效果，黑沙蒿、艾蒿、豬毛蒿、褐苞蒿等蒿屬植物富含萜類、黃酮類、多糖類、精油、生物堿等生物活性物質(zhì)，能通過增強(qiáng)機(jī)體免疫水平、修復(fù)組織氧化損傷、調(diào)控細(xì)胞炎癥因子、抑制病原菌活性等途徑發(fā)揮抗炎、抗氧化和殺菌等生物學(xué)作用[4-7]。黃花蒿不僅具有顯著的抗炎抗氧化作用，同時(shí)，其有效成分青蒿素是目前最具療效的抗瘧藥物成分之一。本課題組前期研究表明，黃花蒿乙醇提取物(ethanol extract ofArtemisiaannua，AAE)能改善奶牛乳成分。在奶牛飼糧中添加AAE能顯著上調(diào)奶牛乳腺上皮細(xì)胞(bovine mammary epithelial cells，BMECs)中硬脂酰輔酶去飽和酶(SCD)、脂肪酸合成酶(FASN)等乳脂合成相關(guān)基因的表達(dá)量，從而調(diào)控乳中乳脂合成以及共軛亞油酸含量[8-9]。

牛乳蛋白主要成分為酪蛋白和乳清蛋白，酪蛋白是衡量牛奶品質(zhì)的一項(xiàng)重要指標(biāo)，對(duì)人體極具營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和Juns激酶(JAK)-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)信號(hào)通路可通過介導(dǎo)BMECs增殖、分化、促乳因子分泌，從而調(diào)控乳蛋白合成[10-12]。前人研究發(fā)現(xiàn)，LPS不僅能顯著降低BMECs增殖水平和乳蛋白分泌功能，還能明顯抑制BMECs中mTOR、核糖體S6蛋白激酶1(S6K1)、真核起始因子4E(EIF4E)及真核細(xì)胞翻譯啟動(dòng)因子4E結(jié)合蛋白1(EIF4EBP1)的基因表達(dá)量和磷酸化水平，這表明LPS可能通過抑制mTOR和JAK-STAT活化，從而降低乳蛋白率[13-14]。有研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿素一定程度上能緩解LPS對(duì)乳腺細(xì)胞的氧化損傷以及乳蛋白合成的抑制作用[15]。但目前關(guān)于AAE對(duì)奶牛LPS誘導(dǎo)損傷乳腺細(xì)胞乳蛋白合成影響的研究未見報(bào)道。鑒于此，本文通過BMECs體外培養(yǎng)技術(shù)，研究AAE對(duì)LPS誘導(dǎo)損傷BMECs活力以及乳蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)的影響，旨在對(duì)AAE調(diào)控大腸桿菌引起的奶牛乳房炎乳蛋白合成機(jī)制進(jìn)行探討，為生產(chǎn)上改善乳房炎奶牛乳品質(zhì)提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)當(dāng)日采集體況健康的奶牛乳腺組織，盡快帶回實(shí)驗(yàn)室。AAE活性成分參見王麗芳等[8]。

1.1.2 主要試劑

脂多糖、膠原酶Ⅱ、胎牛血清、0.25%胰酶細(xì)胞消化液、DMEM/F-12(1∶1)培養(yǎng)基、青鏈霉素、胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒鈉購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、氫化可得松、兩性霉素B、二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；總RNA提取試劑購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；戊二醛、無水乙醇、異丙醇、三氯甲烷購(gòu)自國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)分為5組，對(duì)照組：BMECs用基礎(chǔ)培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)15 h；模型組：BMECs用基礎(chǔ)培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)3 h+10 μg/mL LPS處理12 h；AAE+LPS組：BMECs分別用含3、6、12 μg/mL AAE的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)3 h+10 μg/mL LPS處理12 h。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 BMECs體外正常模型的構(gòu)建

BMECs原代培養(yǎng)、純化和傳代等步驟參見丹妮[16]。選用3～4代細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。通過免疫熒光技術(shù)，對(duì)BMECs進(jìn)行角蛋白-18免疫熒光鑒定，并繪制BMECs生長(zhǎng)曲線。

1.3.2 細(xì)胞活力檢測(cè)

細(xì)胞活力采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法進(jìn)行檢測(cè)，BMECs培養(yǎng)方法同1.2.1。第3代細(xì)胞復(fù)蘇后用胰酶細(xì)胞消化液消化下來，以9×104個(gè)/mL的細(xì)胞密度接入96孔板中，放入37 ℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。對(duì)照組：BMECs用基礎(chǔ)培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)15 h；模型組：BMECs用基礎(chǔ)培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)3 h，3 h后取出96孔板，吸取并棄掉上清液，每孔加入10 μg/mL LPS置于37 ℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中12 h；3個(gè)AAE+LPS組：BMECs分別用含有3、6、12 μg/mL AAE的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)3 h，3 h后取出96孔板，吸取并棄掉上清液，每孔加入10 μg/mL LPS置于37 ℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中12 h。

培養(yǎng)結(jié)束前4 h，取出所有96孔板，每孔加入20 μL MTT溶液，然后4 h后再次取出96孔板，棄去上清并每孔加入100 μL DMSO，振蕩培養(yǎng)10 min后使用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光值。以此初步篩選適宜的AAE添加濃度。

1.3.3 乳蛋白合成相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

將第3代BMECs接種到六孔板。試驗(yàn)分組同1.2.2。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒檢測(cè)β-酪蛋白、αs1-酪蛋白和總蛋白含量的測(cè)定。檢測(cè)方法參照ELISA試劑盒說明書，試劑盒購(gòu)自泉州市睿信生物科技有限公司。

1.3.4 乳蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)量的測(cè)定

將第3代BMECs接種到六孔板。試驗(yàn)分組同1.2.2。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上，去除上清后每孔分別加入1 mL的Trizol，具體方法參見石惠宇[17]的報(bào)道，進(jìn)行總RNA的提取和質(zhì)檢，然后使用第一鏈合成試劑盒(FastQuant RT Kit FastQuant cDNA)進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄。參照彩色熒光定量預(yù)混試劑盒說明進(jìn)行基因熒光定量，使用LightCycler 480Ⅱ熒光定量PCR儀，反應(yīng)程序?yàn)椋?5.0 ℃預(yù)變性30 s；進(jìn)行40個(gè)循環(huán)反應(yīng)，95.0 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72.0 ℃延伸20 s。使用2-ΔΔCt法計(jì)算乳蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)量。

表1 引物序列及參數(shù)Table 1 Primer sequences and parameters

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)先使用Excel 2016進(jìn)行初步整理，然后使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 BMECs生長(zhǎng)情況和鑒定

如圖1所示，純化傳代至第3代的BMECs在2～8 d細(xì)胞活力呈線性增長(zhǎng)，8 d以后細(xì)胞活力緩慢降低，這表明了傳代細(xì)胞具備正常增殖能力，但細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)保持在8 d以內(nèi)。如圖2所示，圖中紅色和藍(lán)色熒光部分分別表示角蛋白-18和細(xì)胞核，其中，角蛋白-18激發(fā)的紅色熒光清晰明亮，表明角蛋白-18在細(xì)胞核中表達(dá)量較大。證明已成功分離培養(yǎng)得到BMECs。

圖1 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線Fig.1 Cell growth curve

圖2 鑒定BMECs骨架蛋白CK-18 Fig.2 Identification of BMECs skeleton protein CK-18 (100×)

2.2 AAE對(duì)LPS誘導(dǎo)損傷BMECs活力的影響

由表2可見，與對(duì)照組相比，模型組的BMECs活力顯著降低(P<0.05)。與模型組相比，3 μg/mL AAE提高了LPS誘導(dǎo)損傷BMECs活力，但差異不顯著(P>0.05)；6和12 μg/mL AAE顯著提高了LPS誘導(dǎo)損傷BMECs活力(P<0.05)。

表2 AAE對(duì)LPS誘導(dǎo)損傷BMECs活力的影響Table 2 Effects of AAE on viability of injured BMECs induced by LPS

2.3 AAE對(duì)LPS誘導(dǎo)損傷BMECs中乳蛋白含量的影響

如圖3所示，與模型組相比，12 μg/mL AAE組總蛋白含量顯著增高(P<0.05)；3和6 μg/mL AAE組總蛋白含量有所增加，但差異不顯著(P>0.05)。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

如圖4所示，6、12 μg/mL AAE組β-酪蛋白含量顯著高于模型組(P<0.05)，且與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)；3 μg/mL AAE組β-酪蛋白含量與模型組無顯著差異(P>0.05)，且顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

圖4 AAE對(duì)LPS誘導(dǎo)損傷BMECs中β-酪蛋白含量的影響Fig.4 Effects of AAE on β-casein content ofinjured BMECs induced by LPS

如圖5所示，3、6、12 μg/mL AAE組αs1-酪蛋白含量均顯著高于模型組(P<0.05)。

圖5 AAE對(duì)LPS誘導(dǎo)損傷BMECs中αs1-酪蛋白含量的影響Fig.5 Effects of AAE on αs1-casein content of injured BMECs induced by LPS

2.4 AAE對(duì)LPS誘導(dǎo)損傷BMECs中乳蛋白合成基因表達(dá)的影響

由表2可見，與模型組相比，12 μg/mL AAE顯著增加了α-酪蛋白(CSN1S1)基因表達(dá)量(P<0.05)，3、6、12 μg/mL AAE顯著增加了β-酪蛋白(CSN2)、mTOR、STAT5、EIF4EBP1、S6K1、JAK2基因表達(dá)量(P<0.05)，6、12 μg/mL AAE顯著增加了EIF4E基因表達(dá)量(P<0.05)。

3 討 論

3.1 AAE對(duì)LPS誘導(dǎo)損傷BMECs活力的影響

奶牛乳房炎在全世界范圍內(nèi)均有極高的發(fā)病率，奶牛感染會(huì)出現(xiàn)不同程度泌乳機(jī)能損傷和生產(chǎn)性能下降。大腸桿菌是一種最常見的誘發(fā)乳房炎的環(huán)境病原菌之一，而LPS是大腸桿菌細(xì)胞壁外膜中的內(nèi)毒素，是主要的致病因子，能誘導(dǎo)多種細(xì)胞類型凋亡和炎癥，對(duì)BMECs的增殖有顯著的抑制作用。研究表明，LPS可抑制BMECs增殖水平，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL)等多種炎癥因子的產(chǎn)生[18]。另外，其他研究顯示，隨著LPS劑量的增大，毒性作用也隨之增強(qiáng)，且炎癥反應(yīng)水平也與LPS呈劑量依賴性[13]。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，模型組細(xì)胞活力顯著低于對(duì)照組，這與上述報(bào)道結(jié)果一致。植物提取物能增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)損傷BMECs的抗氧化作用，降低細(xì)胞炎癥水平，從而恢復(fù)炎癥損傷細(xì)胞活力[19-20]。研究表明，AAE中的黃酮類和多糖類活性成分呈現(xiàn)出一定的抗炎活性，可下調(diào)細(xì)胞炎癥因子的mRNA和蛋白表達(dá)水平[21-22]。在本試驗(yàn)中，AAE可提高LPS誘導(dǎo)損傷BMECs活力，這可能是AAE降低了LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，但具體機(jī)制尚不清楚，需進(jìn)一步研究。

3.2 AAE對(duì)LPS誘導(dǎo)損傷BMECs中乳蛋白含量的影響

牛乳中酪蛋白有αs1(40%)、β(36%)、αs2和κ 4種亞型，而每種亞型又因?yàn)榉g后的磷酸化修飾和糖基化修飾而形成了多種基因變體[14]。研究表明，αs1-酪蛋白不僅可以促進(jìn)動(dòng)物體內(nèi)鈣的沉積和鈣化以及其他礦物質(zhì)元素的吸收，還可以改善動(dòng)物機(jī)體免疫功能[23]。β-酪蛋白也能夠一定程度促進(jìn)機(jī)體對(duì)鈣、鋅等礦物質(zhì)的吸收，且β-酪蛋白在水解后會(huì)產(chǎn)生許多具有特殊生物學(xué)活性的物質(zhì)，如免疫調(diào)節(jié)和抗氧化作用的生物活性肽[24]。LPS對(duì)酪蛋白合成有顯著的抑制作用，其可能通過下調(diào)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)水平從而導(dǎo)致酪蛋白分泌水平顯著降低[13]。植物提取物活性成分豐富，對(duì)乳腺炎奶牛及健康奶牛乳蛋白率有顯著的改善作用。宋潔等[25]在乳腺炎奶牛飼糧中添加以黃酮類、脂質(zhì)類等為主要成分的復(fù)合植物提取物，結(jié)果顯示，該復(fù)合植物提取物能顯著提高乳腺炎奶牛的乳蛋白率。斯琴畢力格等[8]在體況相近的荷斯坦奶牛飼糧中添加AAE，結(jié)果顯示試驗(yàn)組乳蛋白含量與對(duì)照組相比有增加趨勢(shì)[8]。本試驗(yàn)中，10 μg/mL LPS顯著降低了BMECs中αs1-酪蛋白和β-酪蛋白含量，不同濃度的AAE能不同程度地提高LPS誘導(dǎo)損傷BMECs中總蛋白含量，6和12 μg/mL AAE顯著提高了LPS誘導(dǎo)損傷BMECs中β-酪蛋白含量，且3、6和12 μg/mL AAE時(shí)均能顯著提高LPS誘導(dǎo)損傷BMECs中αs1-酪蛋白含量。通過以上結(jié)果判斷，AAE可能通過提高受損傷BMECs中αs1-酪蛋白和β-酪蛋白的含量來使細(xì)胞總蛋白含量恢復(fù)正常水平，且能一定程度上調(diào)節(jié)酪蛋白組成成分。

3.3 AAE對(duì)LPS誘導(dǎo)損傷BMECs中乳蛋白合成基因表達(dá)的影響

CSN2和CSN1S1作為酪蛋白的主要組成部分，受催乳素和糖皮質(zhì)激素(HP)等促乳激素的調(diào)控，其基因表達(dá)量是衡量乳蛋白合成的重要指標(biāo)[26-27]。牛乳蛋白合成主要由JAK-STAT5和mTOR/S6K1/EIF4 2個(gè)信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)控，mTOR信號(hào)通路是一個(gè)將營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)、蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞生長(zhǎng)結(jié)合起來的重要通路[28]。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在蛋白質(zhì)合成過程中通過整合來自氨基酸、生長(zhǎng)因子、能量狀態(tài)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的上游信號(hào)和壓力，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用[29]。mTOR信號(hào)通路一旦激活，哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合靶點(diǎn)1(mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)開始磷酸化，并刺激下游蛋白S6K1和EIF4EBP1的表達(dá)，從而調(diào)控乳蛋白mRNA翻譯過程[12]。低磷酸化的4E結(jié)合蛋白(4E-bp1)與EIF4E結(jié)合，在mTORC1信號(hào)激活后，EIF4EBP1磷酸化與EIF4E分離[29-30]。催乳素和促生長(zhǎng)因子可通過酪氨酸激酶Janus激酶(Janus kinase，Jak)使STAT5磷酸化。磷酸化的STAT5形成二聚體，進(jìn)入細(xì)胞核與乳蛋白基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子結(jié)合，誘導(dǎo)其表達(dá)，從而促進(jìn)乳蛋白合成。有研究表明，真核起始因子5(EIF5)受到STAT5的調(diào)控，同時(shí)STAT5活性與EIF5表達(dá)量呈正相關(guān)[31]。

LPS可激活細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3(SOCS3)，活化后的SOCS3可抑制催乳素誘導(dǎo)的STAT5以及其下游蛋白的基因表達(dá)量[32]。較低濃度的LPS就能顯著下調(diào)JAK-STAT5和mTOR/S6K1/EIF4 2個(gè)信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)量[13]。研究表明，植物提取物可能通過促進(jìn)乳蛋白合成相關(guān)信號(hào)通路基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)和磷酸化水平來改善LPS誘導(dǎo)損傷BMECs中乳蛋白合成水平降低現(xiàn)象。必需脂肪酸、維生素A、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)素都能不同程度地影響B(tài)MECs中乳蛋白CSN2和CSN1S1等相關(guān)基因的表達(dá)，其可能通過介導(dǎo)mTOR通路和JAK2-STAT5通路增加氨基酸的吸收利用和BMECs的增殖分化過程，從而調(diào)控乳蛋合成[33-35]。占今舜等[15]研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿素能顯著上調(diào)LPS誘導(dǎo)損傷BMECs中mTOR、S6K1、JAK2、STAT5等乳蛋白合成相關(guān)通路基因的表達(dá)水平。

目前，有關(guān)AAE對(duì)LPS誘導(dǎo)損傷BMECs中乳蛋白合成及相關(guān)作用機(jī)制未見報(bào)道。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，CSN1S1基因表達(dá)量隨AAE濃度增加呈劑量依賴性提高，高濃度AAE能顯著上調(diào)CSN1S1基因表達(dá)量。相對(duì)于模型組，3 μg/mL AAE即能顯著增加CSN2基因表達(dá)量，且與LPS誘導(dǎo)損傷BMECs中αs1-酪蛋白和β-酪蛋白含量變化趨勢(shì)相近。本試驗(yàn)中，LPS誘導(dǎo)下調(diào)了乳蛋白合成信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)量，與前人研究結(jié)果一致。與LPS誘導(dǎo)損傷的模型組相比，AAE能上調(diào)mTOR、S6K1、EIF4E、EIF4EBP1、JAK2和STAT5基因表達(dá)量，表明AAE可能通過提高mTOR及JAK2-STAT5信號(hào)通路基因表達(dá)來促進(jìn)BMECs中乳蛋白合成。

4 結(jié) 論

① 10 μg/mL LPS可抑制BMECs活力和酪蛋白分泌，且能下調(diào)乳蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)量。

② AAE可提高LPS誘導(dǎo)損傷BMECs活力。

③ AAE可提高LPS誘導(dǎo)損傷BMECs中總蛋白、β-酪蛋白和αs1-酪蛋白含量，以及BMECs中乳蛋白合成相關(guān)基因mTOR、S6K1、JAK2、STAT5、CSN1S1、CSN2、EIF4EBP1、EIF4E的基因表達(dá)量。

④ 12 μg/mL AAE對(duì)LPS誘導(dǎo)損傷BMECs中乳蛋白合成有較好的預(yù)保護(hù)效果。