符振強(qiáng) 董揚(yáng)帆 湯上上 周 利 徐 暢 李二超

(海南大學(xué)海洋學(xué)院，海南省水產(chǎn)種業(yè)工程研究中心，海南省熱帶水生生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?570228)

凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)是全球三大養(yǎng)殖對(duì)蝦品種之一，因具有廣鹽性特征，能夠適應(yīng)0.5‰～50.0‰的鹽度環(huán)境，因此近年淡化養(yǎng)殖在內(nèi)陸不斷推廣[1-2]。但低鹽度養(yǎng)殖環(huán)境對(duì)凡納濱對(duì)蝦的生長[3]、肝胰腺免疫[4]、腸道菌群[5]等方面均會(huì)造成較大的負(fù)面影響。同時(shí)，不同水體條件下的凡納濱對(duì)蝦腸道菌群也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化，腸道微生物與機(jī)體的營養(yǎng)代謝、健康狀態(tài)和疾病爆發(fā)有著重要聯(lián)系[6]。而低鹽度養(yǎng)殖水體環(huán)境的菌群與正常海水之間本就存在差異[7]。在對(duì)蝦養(yǎng)殖中，添加飼料添加劑是減輕低鹽脅迫負(fù)面影響的一種有效方法[8]。為了滿足現(xiàn)代水產(chǎn)綠色發(fā)展的需要，通常會(huì)在水產(chǎn)飼料中添加功能性飼料添加劑，以此提高水產(chǎn)動(dòng)物的生長性能以及抗病能力，并能夠使宿主腸道菌群達(dá)到最佳的平衡狀態(tài)，從而維持水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)物種的健康，提高養(yǎng)殖產(chǎn)量[9]。α-硫辛酸(α-lipoic acid，α-LA)是一類天然的二硫醇抗氧化劑，又被稱為硫辛酸或辛酸，其在線粒體脫氫酶反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用，除了能幫助細(xì)胞將葡萄糖轉(zhuǎn)換為能量以外，還可起到解毒、抵御皮膚發(fā)炎和穩(wěn)定血糖等作用[10]。此外，α-LA作為一種強(qiáng)抗氧化劑，能夠清除體內(nèi)外的活性氮(RNS)和活性氧(ROS)[11]。有研究證實(shí)，一定劑量的α-LA對(duì)機(jī)體是安全、無毒的，因此可以用作飼養(yǎng)動(dòng)物的飼料添加劑[12-13]。到目前為止，α-LA在家養(yǎng)禽畜中得到廣泛的應(yīng)用，如雞[14-16]、豬[17]、羊[18]等；同時(shí)也在水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物如魚類[19-20]、蟹類[21-22]和貝類[23]中應(yīng)用并獲得良好的效果。盡管α-LA是一種通用抗氧化劑，但其對(duì)凡納濱對(duì)蝦的生理生化及腸道菌群影響的研究仍然十分有限，且對(duì)于凡納濱對(duì)蝦在抵抗低鹽脅迫中的應(yīng)用研究尚屬空白。因此，本研究旨在探討α-LA對(duì)低鹽度(3‰)環(huán)境飼養(yǎng)的凡納濱對(duì)蝦生長、抗氧化能力和腸道菌群的影響，以期為內(nèi)陸低鹽度凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖提供改善生長性能和減輕環(huán)境脅迫壓力的實(shí)用解決方案，提高凡納濱對(duì)蝦淡水養(yǎng)殖的產(chǎn)量和規(guī)模。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

α-LA，純度>99%。參照Li等[24]，配制以魚粉和豆粕作為蛋白質(zhì)源，以魚油、豆油、膽固醇和卵磷脂作為脂肪源，以小麥淀粉作為糖源的4種等氮等能、粗蛋白質(zhì)含量約為35%、粗脂肪含量約為9%的試驗(yàn)飼料。試驗(yàn)飼料組成見表1，營養(yǎng)水平見Li等[24]。飼料原料經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過80目網(wǎng)篩，將篩下物按飼料組成進(jìn)行配比并逐級(jí)充分混合均勻，在基礎(chǔ)飼料組成水平的基礎(chǔ)上分別稱量0、0.3、0.6、1.2 g/kg的α-LA并加入到飼料的油脂中，用玻璃棒攪拌均勻溶解后，倒入混勻的飼料原料中制成4種不同α-LA含量的試驗(yàn)飼料。與油脂混合后過20目網(wǎng)篩，將油脂團(tuán)打散后混合均勻，按照30%的比例添加雙蒸水，通過攪拌器攪拌均勻后通過雙螺旋壓條機(jī)(F-26，廣東華工光機(jī)電科技有限公司)擠壓成條，自然通風(fēng)處陰干至水分約為10%后，粉碎過20、16和12目的網(wǎng)篩，制成不同直徑的沉性顆粒料，標(biāo)記分裝于自封袋，放入-20 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

表1 試驗(yàn)飼料組成(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition of experimental diets (DM basis) g/kg

續(xù)表1原料Ingredientsα-LA含量 α-LA content/(g/kg)00.30.61.2礦物質(zhì)預(yù)混料 Mineral premix2)5.0 5.0 5.0 5.0 羧甲基纖維素鈉 Sodium carboxymethyl cellulose30.0 30.0 30.0 30.0 纖維素 Cellulose 11.2 10.9 10.6 10.0 α-硫辛酸 α-lipoic acid0.3 0.6 1.2 碳酸鈣 CaCO3 20.0 20.0 20.0 20.0 合計(jì) Total1 000.01 000.01 000.01 000.0

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

凡納濱對(duì)蝦取自海南省儋州市某幼蝦繁育基地。試驗(yàn)開始前對(duì)凡納濱對(duì)蝦幼蝦進(jìn)行為期2周的暫養(yǎng)，暫養(yǎng)期間將對(duì)蝦分成2部分，鹽度均保持在25‰。通過添加充分曝氣、紫外消毒的淡水到過濾消毒過的天然海水中，逐漸降低養(yǎng)殖水體鹽度，最終將對(duì)蝦的養(yǎng)殖水體鹽度分別控制為25‰和3‰。

選取體質(zhì)健壯、初始體重為(0.061±0.005) g的幼蝦1 000尾，分別按照暫養(yǎng)水體鹽度將幼蝦隨機(jī)平均分配到20個(gè)玻璃養(yǎng)殖箱(110 cm×80 cm×40 cm)內(nèi)，其中4個(gè)養(yǎng)殖箱水體鹽度為25‰，16個(gè)養(yǎng)殖箱水體鹽度為3‰。試驗(yàn)設(shè)置2個(gè)對(duì)照組(25‰海水對(duì)照組和3‰低鹽對(duì)照組)和3‰鹽度下3個(gè)α-LA添加水平(0.3、0.6、1.2 g/kg)的試驗(yàn)組，每組設(shè)置4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50尾幼蝦。

養(yǎng)殖過程中，25‰海水對(duì)照組和3‰低鹽對(duì)照組全程投喂基礎(chǔ)飼料，另外3個(gè)試驗(yàn)組在3‰水體鹽度下分別投喂含0.3、0.6、1.2 g/kg α-LA的試驗(yàn)飼料。試驗(yàn)期間，每日于08：00、14：00、20：00以5%對(duì)蝦重量定量投喂，殘餌和糞便及時(shí)用虹吸管進(jìn)行清理。試驗(yàn)周期為8周，每天定量更換1/3養(yǎng)殖水體，使水體保持pH為7.5～7.9，水溫為26～30 ℃，溶解氧含量≥6.4 mg/L，總氨氮含量<0.02 mg/L。

1.3 樣品采集

養(yǎng)殖結(jié)束后，對(duì)蝦禁食24 h后進(jìn)行冰浴麻醉，統(tǒng)計(jì)各個(gè)養(yǎng)殖箱內(nèi)對(duì)蝦數(shù)量、體長和體重，用以計(jì)算存活率(survival rate，SR)、增重率(weight gain rate，WGR)、和肥滿度(condition factor，CF)；快速分離對(duì)蝦肝胰腺組織并進(jìn)行稱重，以計(jì)算肝體指數(shù)(hepatosomatic index，HSI)；肝胰腺和腸道組織放入凍存管中經(jīng)液氮速凍，儲(chǔ)存于-80 ℃超低溫冰箱，用以生化分析及腸道菌群結(jié)構(gòu)分析。同時(shí)，于每個(gè)養(yǎng)殖箱中隨機(jī)抽取3只對(duì)蝦，收集中腸組織，使用4%多聚甲醛溶液固定，以備制作腸道組織切片，觀察腸道組織學(xué)響應(yīng)。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 生長性能

增重率、肝體指數(shù)、肥滿度和存活率采用下列公式進(jìn)行計(jì)算：

增重率(%)=100×(最終體重-
初始體重)/初始體重；
肝體指數(shù)(%)=100×濕肝胰腺重量/體重；
肥滿度(g/cm3)=體重/體長3；
存活率(%)=100×最終對(duì)蝦數(shù)量/初始對(duì)蝦數(shù)量。

1.4.2 抗氧化能力

隨機(jī)挑選凡納濱對(duì)蝦的肝胰腺樣本(n=4)，按比例(組織重量∶生理鹽水=1∶9)進(jìn)行組織勻漿，分別檢測(cè)超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脫氫酶(LDH)、過氧化氫酶(CAT)活性以及丙二醛(MDA)含量，以上指標(biāo)均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒，按說明書所述方法進(jìn)行測(cè)定。

1.4.3 腸道微生物分析

測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)，經(jīng)拼接、過濾掉干擾序列后得到有效數(shù)據(jù)。將樣本區(qū)分后以97%的一致性進(jìn)行操作分類單元(OTU)聚類和物種分類分析，并對(duì)其代表序列進(jìn)行物種注釋?；贠TU進(jìn)行alpha多樣性分析，并對(duì)不同樣本進(jìn)行beta多樣性分析。使用生物信息學(xué)軟件包PICRUSt預(yù)測(cè)腸道菌群的功能譜，并使用京都基因與基因組百科全書(KEGG)進(jìn)行注釋。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，運(yùn)用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)3‰低鹽度對(duì)比下的數(shù)據(jù)作單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏多重比較變量檢驗(yàn)；25‰鹽度與3‰鹽度處理對(duì)比的數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)(ttest)進(jìn)行分析，試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)”表示，P<0.05表示顯著差異，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 低鹽脅迫下飼料中添加α-LA對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長性能的影響

如圖1所示，3‰低鹽對(duì)照組的存活率極顯著低于25‰海水對(duì)照組(P<0.01)，顯著低于1.2 g/kg α-LA組(P<0.05)(圖1-A)。各組之間的增重率無顯著差異(P>0.05)(圖1-B)。3‰低鹽對(duì)照組和0.3、0.6、1.2 g/kg α-LA組的肝體指數(shù)均顯著低于25‰海水對(duì)照組(P<0.05)(圖1-C)。1.2 g/kg α-LA組的肥滿度顯著低于3‰低鹽對(duì)照組和25‰海水對(duì)照組(P<0.05)(圖1-D)。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。下圖同。

2.2 低鹽脅迫下飼料中添加α-LA對(duì)凡納濱對(duì)蝦抗氧化能力的影響

由圖2可知，與25‰海水對(duì)照組相比，3‰低鹽對(duì)照組和0.3、0.6 g/kg α-LA組的肝胰腺M(fèi)DA含量顯著增加(P<0.05)；1.2 g/kg α-LA組的肝胰腺M(fèi)DA含量與25‰海水對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)，但顯著低于3‰低鹽對(duì)照組(P<0.05)(圖2-A)。各組之間的肝胰腺CAT活性無顯著差異(P>0.05)(圖2-B)。與25‰海水對(duì)照組相比，3‰低鹽對(duì)照組和0.3 g/kg α-LA組的肝胰腺SOD活性極顯著降低(P<0.01)；與3‰低鹽對(duì)照組相比，0.6、1.2 g/kg α-LA組的肝胰腺SOD活性顯著升高(P<0.05)(圖2-C)。與25‰海水對(duì)照組相比，3‰低鹽對(duì)照組和0.3 g/kg α-LA組的肝胰腺LDH活性極顯著升高(P<0.01)；與3‰低鹽對(duì)照組相比，1.2 g/kg α-LA組的肝胰腺LDH活性顯著降低(P<0.05)(圖2-D)。

圖2 低鹽脅迫下飼料中添加α-LA對(duì)凡納濱對(duì)蝦抗氧化能力的影響Fig.2 Effects of dietary α-LA on antioxidant capacity of Litopenaeus vannamei under low salinity stress

2.3 低鹽脅迫下飼料中添加α-LA對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道組織學(xué)形態(tài)的影響

如圖3所示，25‰海水對(duì)照組、3‰低鹽對(duì)照組和1.2 g/kg α-LA組的腸道組織學(xué)形態(tài)存在明顯差異。與25‰海水對(duì)照組(圖3-A、圖3-B)相比，3‰低鹽對(duì)照組(圖3-C、圖3-D)的腸道黏膜上皮細(xì)胞與基底膜存在明顯剝離現(xiàn)象；與3‰低鹽對(duì)照組相比，1.2 g/kg α-LA組(圖3-E、圖3-F)的腸道壁較平滑。

2.4 低鹽脅迫下飼料中添加α-LA對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道菌群組成的影響

2.4.1 alpha多樣性分析

腸道微生物檢測(cè)共得到1 201 941條高質(zhì)量序列，平均每個(gè)樣本有85 028條序列，序列平均長度為412 bp。相似度在97%以上的序列聚類為OTU。如圖4-A所示，在腸道菌群豐度指數(shù)結(jié)果中，25‰海水對(duì)照組與3‰低鹽對(duì)照組的腸道菌群Chao1、ACE指數(shù)無顯著差異(P>0.05)，但是均顯著或極顯著低于1.2 g/kg α-LA組(P<0.05或P<0.01)。在腸道菌群多樣性指數(shù)結(jié)果中，3‰低鹽對(duì)照組的腸道菌群Simpson、Shannon指數(shù)最低，25‰海水對(duì)照組最高，且3‰低鹽對(duì)照組與1.2 g/kg α-LA組差異顯著(P<0.05)；25‰海水對(duì)照組與3‰低鹽對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)，與1.2 g/kg α-LA組差異顯著(P<0.05)。

A：25‰海水對(duì)照組(100×)；B：25‰海水對(duì)照組(400×)；C：3‰低鹽對(duì)照組(100×)；D：3‰低鹽對(duì)照組(400×)；E：1.2 g/kg α-LA組(100×)；F：1.2 g/kg α-LA組(400×)。

2.4.2 beta多樣性分析

基于Unweighted Unifrac來進(jìn)行主坐標(biāo)分析(PCoA)，并選取貢獻(xiàn)率最大的主坐標(biāo)組合進(jìn)行作圖，如圖4-B所示，25‰海水對(duì)照組(紅色正方形)與3‰低鹽對(duì)照組(藍(lán)色圓形)、1.2g/kg α-LA組(綠色三角形)用不同色塊區(qū)別開，在主成分1(PC1)方向上所代表的25‰海水對(duì)照組與其他2組疑似影響因素占41.15%，表明群落結(jié)構(gòu)差異較大；在主成分2(PC2)方向上3‰低鹽對(duì)照組與1.2 g/kg α-LA組相聚較近，疑似影響因素僅占12.68%，群落結(jié)構(gòu)差異不明顯。PCoA結(jié)果表明，低鹽處理因素對(duì)腸道菌群的影響要高于飼料中添加α-LA對(duì)腸道菌群的影響。

2.4.3 Venn圖分析

如圖4-C所示，由凡納濱對(duì)蝦腸道菌群Venn圖分析可知，25‰海水對(duì)照組、3‰低鹽對(duì)照組、1.2 g/kg α-LA組的OTU數(shù)目分別為307、317、399個(gè)，其中，3個(gè)試驗(yàn)組共同含有196個(gè)相同的OTU，占25‰海水對(duì)照組、3‰低鹽對(duì)照組和1.2 g/kg α-LA組的比例分別為63.84%、61.83%、49.12%。25‰海水對(duì)照組、3‰低鹽對(duì)照組、1.2 g/kg α-LA組特有的OTU數(shù)目分別為60、16、89個(gè)，分別占總OTU數(shù)目的19.54%、0.05%、22.31%。

圖4 25‰海水對(duì)照組、3‰低鹽對(duì)照組和1.2 g/kg α-LA組凡納濱對(duì)蝦腸道菌群多樣性差異圖Fig.4 Diversity difference map of intestinal microflora of Litopenaeus vannamei in 25‰ seawater control group, 3‰ low salt control group and 1.2 g/kg α-LA group

2.4.4 腸道菌群群落組成分析

如圖5-A所示，25‰海水對(duì)照組腸道中占主導(dǎo)的優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門(76.03%)和擬桿菌門(20.72%)；3‰低鹽對(duì)照組腸道中占主導(dǎo)的優(yōu)勢(shì)菌門為擬桿菌門(68.17%)和變形菌門(25.91%)；1.2 g/kg α-LA組腸道中占主導(dǎo)的優(yōu)勢(shì)菌門為擬桿菌門(61.24%)和變形菌門(29.77%)，上述優(yōu)勢(shì)菌門總和均占到對(duì)應(yīng)腸道總細(xì)菌門類的90%以上。如表2所示，與25‰海水對(duì)照組相比，3‰低鹽對(duì)照組的腸道中擬桿菌門相對(duì)豐度顯著升高(P<0.05)，變形菌門和梭桿菌門相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05)。與3‰低鹽對(duì)照組相比，1.2 g/kg α-LA組的腸道中厚壁菌門、放線菌門相對(duì)豐度顯著升高(P<0.05)。

表2 25‰海水對(duì)照組、3‰低鹽對(duì)照組和1.2 g/kg α-LA組凡納濱對(duì)蝦腸道菌群門水平組成Table 2 Composition of intestinal microflora at phylum level of Litopenaeus vannamei among 25‰ seawater control group, 3‰ low salt control group and 1.2 g/kg α-LA group %

如圖5-B所示，25‰海水對(duì)照組腸道中占主導(dǎo)的優(yōu)勢(shì)菌屬分別為魯杰氏菌屬、Celeribacter、Tenacibaculum和Roseivivax；3‰低鹽對(duì)照組腸道中占主導(dǎo)的優(yōu)勢(shì)菌屬分別為Algoriphagus、副球菌屬、Rheinheimera；1.2 g/kg α-LA組腸道中對(duì)占主導(dǎo)的優(yōu)勢(shì)菌屬分別為Algoriphagus、副球菌屬、黃桿菌屬和溶桿菌屬。如表3所示，1.2 g/kg α-LA組的腸道中黃桿菌屬、Actibacter、Tropicimonas、Shinella相對(duì)豐度顯著高于25‰海水對(duì)照組(P<0.05)，Algoriphagus相對(duì)豐度顯著低于3‰低鹽對(duì)照組(P<0.05)。3‰低鹽對(duì)照組的腸道中魯杰氏菌屬、Celeribacter、Tenacibaculum、Roseivivax、Sungkyunkwania、Roseovarius、Hoppeia、Shimia、假交替單胞菌屬、Tamlana相對(duì)豐度顯著低于25‰海水對(duì)照組(P<0.05)，Algoriphagus、副球菌屬、Rheinheimera、Defluviimonas相對(duì)豐度顯著高于25‰海水對(duì)照組(P<0.05)。1.2 g/kg α-LA組的腸道中黃桿菌屬、Shinella和Actibacter相對(duì)豐度顯著高于3‰低鹽對(duì)照組(P<0.05)。

表3 25‰海水對(duì)照組、3‰低鹽對(duì)照組和1.2 g/kg α-LA組凡納濱對(duì)蝦腸道菌群屬水平組成Table 3 Composition of intestinal microflora at genus level of Litopenaeus vannamei among 25‰ seawater control group, 3‰ low salt control group and 1.2 g/kg α-LA group %

如圖6所示，根據(jù)全部樣本在腸道菌群屬水平的豐度信息及物種注釋，篩選豐度在前35的菌屬，根據(jù)其在每個(gè)樣本中的豐度信息，從樣本和物種2個(gè)層面進(jìn)行聚類，繪制成熱圖。與3‰低鹽對(duì)照組相比，1.2 g/kg α-LA組的腸道中希瓦氏菌屬、紅桿菌屬、墨氏菌屬相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05)，而Donghicola、Haloferula、Xanthomarina、Marivita等菌屬相對(duì)豐度顯著增加(P<0.05)。

2.4.5 PICRUSt腸道菌群功能預(yù)測(cè)

通過PICRUSt預(yù)測(cè)，3‰低鹽對(duì)照組和1.2 g/kg α-LA組的腸道具有顯著差異的細(xì)菌的相關(guān)基因功能列于表4。具有顯著差異的腸道微生物富集的KEGG通路分為六大類：新陳代謝(metabolism)、細(xì)胞過程(cellular processes)、生物體系統(tǒng)(organismal systems)、人類疾病(human diseases)、環(huán)境信息處理(environmental information processing)以及未分類的(unclassified)。其中，腸道菌群編碼的大多數(shù)差異基因與新陳代謝有關(guān)。值得一提的是，與3‰低鹽對(duì)照組相比，1.2 g/kg α-LA組的腸道微生物編碼的基因中與加壓素調(diào)節(jié)的水重吸收(vasopressin-regulated water reabsorption)、胞吞作用(endocytosis)以及FcγR介導(dǎo)的吞噬作用(Fc gamma R-mediated phagocytosis)有關(guān)的KEGG途徑顯著富集(P<0.05)。

表4 低鹽脅迫下飼料中添加α-LA對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道菌群功能預(yù)測(cè)的相對(duì)豐度的影響Table 4 Effects of dietary α-LA on relative abundance of intestinal microflora function prediction of Litopenaeus vannamei under low salinity stress

3 討 論

3.1 低鹽脅迫下飼料中添加α-LA對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長性能的影響

有研究表明，在3‰低鹽脅迫下飼養(yǎng)的凡納濱對(duì)蝦的增重率和存活率較正常鹽度下要低[24]。本研究中，3‰低鹽對(duì)照組對(duì)蝦的存活率降低驗(yàn)證了以上觀點(diǎn)，而添加了α-LA組中的對(duì)蝦存活率較3‰低鹽對(duì)照組相比增加，與5‰海水對(duì)照組相比略低但不存在顯著差異。與5‰海水對(duì)照組相比，低鹽脅迫下的所有組別的肝體指數(shù)均顯著下降，這可能是低鹽脅迫造成的結(jié)果[1]。攝入含0.3、0.6 g/kg α-LA飼料的凡納濱對(duì)蝦生長性能表現(xiàn)良好，飼喂含1.2 g/kg α-LA飼料的凡納濱對(duì)蝦肥滿度與5‰海水對(duì)照組和3‰低鹽對(duì)照組相比均顯著降低，這可能是由于高添加量的α-LA導(dǎo)致，但其他生長指標(biāo)并未受到顯著影響，這與此前有研究提出的1.2 g/kg α-LA會(huì)抑制草魚的食物攝入從而降低最終體重的結(jié)果相悖[25]。除卻試驗(yàn)對(duì)象不同可能導(dǎo)致的作用劑量差異這一原因以外，低鹽脅迫下的養(yǎng)殖環(huán)境使得飼料中的α-LA發(fā)揮抗氧化作用從而出現(xiàn)不同的結(jié)果或許是另一原因。除此之外，有報(bào)道稱在甲殼類動(dòng)物中華絨螯蟹的飼料中添加1.2或2.4 g/kg α-LA能夠使蟹獲得最佳的生長性能，且更高劑量的α-LA添加量則會(huì)抑制其生長[22]；在皺紋盤鮑的研究中也同樣得到了類似結(jié)論[23]。因此，本研究結(jié)果得出，飼料中添加1.2g/kgα-LA并未對(duì)凡納濱對(duì)蝦的攝食造成抑制，且能夠提高凡納濱對(duì)蝦在低鹽脅迫下的存活率和生長性能。試驗(yàn)中的α-LA高添加量并未與低添加量形成顯著差異，因此1.2 g/kg的α-LA添加量可能仍未達(dá)到可提升生長表現(xiàn)的最大劑量，但具體的適宜添加量仍需要進(jìn)一步的探討。

Protecobacteria：變形菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Firmicutes：厚壁菌門；Actinobacteria：放線菌門；Acidobacteria：酸桿菌門；Verrucomicrobia：疣微菌門；Chloroflexi：綠彎菌門；Planctomycetes：浮霉菌門；Fusobacteria：梭桿菌門；unidentified_Bacteria：未知菌門；Ruegeria：魯杰氏菌屬；Lysobacter：溶桿菌屬；Paracoccus：副球菌屬；Shewanella：希瓦氏菌屬；Flavobacterium：黃桿菌屬；Others：其他。

3.2 低鹽脅迫下飼料中添加α-LA對(duì)凡納濱對(duì)蝦抗氧化能力的影響

凡納濱對(duì)蝦在低鹽脅迫下會(huì)被誘導(dǎo)氧化產(chǎn)生過量的ROS，導(dǎo)致對(duì)蝦的細(xì)胞和組織被破壞[1,26-27]。由于對(duì)蝦生理結(jié)構(gòu)簡單，因此抗氧化酶在清除過量ROS過程中起到至關(guān)重要的作用。α-LA作為一類天然的抗氧化劑，具有非常出色的抗氧化能力[10,28]。為了研究α-LA對(duì)凡納濱對(duì)蝦低鹽脅迫下的保護(hù)作用，本試驗(yàn)篩選了SOD、CAT作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。SOD是一類機(jī)體天然存在的超氧自由基清除因子，并且是重要的內(nèi)源性抗氧化劑，能夠?qū)⒊踝杂苫D(zhuǎn)化為過氧化氫，而CAT則能夠?qū)⑦^氧化氫立即分解成完全無害的水，因此SOD和CAT活性增高在清除ROS中起重要作用，可抵抗低鹽脅迫帶來的氧化應(yīng)激。Wang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，α-LA的添加極大提高了肉雞的SOD活性；Xu等[21-22]的研究也充分證實(shí)了一定劑量的α-LA能夠提升中華絨螯蟹的SOD活性。而本研究結(jié)果與上述報(bào)道相似，飼喂0.6、1.2 g/kg α-LA的凡納濱對(duì)蝦肝胰腺SOD活性顯著高于3‰低鹽對(duì)照組。值得一提的是，本研究中α-LA的添加未能使凡納濱對(duì)蝦的肝胰腺CAT活性有顯著變化，但與3‰低鹽對(duì)照組相比有降低的趨勢(shì)，這與此前Zhang等[23]對(duì)幼鮑飼喂α-LA的研究結(jié)果一致。MDA含量是反映機(jī)體抗氧化能力的重要參數(shù)，可以反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化速率和強(qiáng)度，也能間接反映組織過氧化損傷程度。Bast等[29]研究發(fā)現(xiàn)，束縛應(yīng)激下的大鼠在服用α-LA后，組織MDA含量顯著降低至正常水平；在中華絨螯蟹[21]中也得到相似的結(jié)果。本研究結(jié)果與上述報(bào)道類似，1.2 g/kg α-LA組的凡納濱對(duì)蝦肝胰腺M(fèi)DA含量相比低鹽脅迫下的其他組別降低。此外，LDH作為廣泛存在于水生動(dòng)物機(jī)體組織的一種重要同工酶，組織受損時(shí)其活性升高[30]。Hernández-Palomares等[31]報(bào)道了凡納濱對(duì)蝦在缺氧脅迫下肝胰腺LDH活性會(huì)顯著升高，但添加了α-LA后肝胰腺LDH活性沒有發(fā)生變化。本研究中，凡納濱對(duì)蝦肝胰腺LDH活性在低鹽脅迫下升高，可知肝胰腺組織在低鹽脅迫下會(huì)造成損傷，但在飼喂了α-LA后，肝胰腺LDH活性得到升高，因此，α-LA能夠緩解低鹽環(huán)境對(duì)凡納濱對(duì)蝦的負(fù)面效應(yīng)。

Actinobacteria：放線菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Protecobacteria：變形菌門；Verrucomicrobia：疣微菌門；unidentified_Bacteria：未知細(xì)菌門；Ruegeria：魯杰氏菌屬；unidentified_Rhodobacteraceae：未鑒定的紅桿菌屬；unidentified_Bacteria：未知細(xì)菌；Rhodobacter：紅桿菌屬；Erythrobacter：赤細(xì)菌屬；Flavobacterium：黃桿菌屬；Paracoccus：副球菌屬；Microbacterium：微桿菌屬；Cytophaga：噬細(xì)胞菌屬。

以上結(jié)果表明，飼料中添加α-LA能夠提高凡納濱對(duì)蝦抗氧化酶的活性和抗氧化能力，從而減輕其在低鹽脅迫下的氧化壓力。但α-LA調(diào)節(jié)凡納濱對(duì)蝦應(yīng)對(duì)低鹽脅迫的具體的作用機(jī)制尚未完全清楚，仍需進(jìn)一步的深入研究。

3.3 低鹽脅迫下飼料中添加α-LA對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道組織學(xué)形態(tài)和菌群結(jié)構(gòu)的影響

腸道是凡納濱對(duì)蝦行使消化和營養(yǎng)物質(zhì)吸收的主要器官，完整的腸道組織結(jié)構(gòu)對(duì)機(jī)體保持良好的消化性能至關(guān)重要。環(huán)境因素能夠直接影響對(duì)蝦的腸道組織學(xué)，一旦腸道結(jié)構(gòu)被破壞，可能會(huì)增加病原體入侵宿主的風(fēng)險(xiǎn)。本研究證實(shí)，低鹽脅迫會(huì)導(dǎo)致凡納濱對(duì)蝦腸道皺襞細(xì)胞受損，腸上皮細(xì)胞變短，肌肉層變薄。1.2 g/kg α-LA組的凡納濱對(duì)蝦腸道對(duì)比3‰低鹽對(duì)照組，并沒有出現(xiàn)組織空泡現(xiàn)象，但其他特征并無明顯差異。因此，凡納濱對(duì)蝦在攝入含有α-LA的飼料后，能夠?qū)Φ望}脅迫下對(duì)蝦造成的腸道組織損傷起到一定的修復(fù)作用。

腸道微生物的菌群結(jié)構(gòu)組成與宿主的免疫反應(yīng)、營養(yǎng)吸收密切相關(guān)，能夠參與宿主各項(xiàng)生命機(jī)能的調(diào)節(jié)[32]。凡納濱對(duì)蝦腸道菌群的構(gòu)成受環(huán)境、生長階段以及飼料等多重因素的影響，健康平衡的腸道菌群有益于對(duì)蝦的健康生長[33]。王元等[34]的研究表明，凡納濱對(duì)蝦在海水和淡水2種養(yǎng)殖模式中呈現(xiàn)的腸道菌群存在較大差異。而在本研究中，與25‰海水對(duì)照組相比，3‰低鹽對(duì)照組的菌群豐度并無顯著差異，但菌群多樣性降低。Jones等[35]研究表明，腸道菌群多樣性降低可能會(huì)破壞菌群結(jié)構(gòu)穩(wěn)態(tài)，增加機(jī)體致病風(fēng)險(xiǎn)；這是低鹽養(yǎng)殖下對(duì)蝦產(chǎn)量受到制約的因素之一。值得一提的是，飼喂添加了1.2 g/kg α-LA飼料的凡納濱對(duì)蝦的腸道菌群豐度和多樣性均較3‰低鹽對(duì)照組有所提升，使得腸道微生態(tài)環(huán)境保持相對(duì)平衡，一定程度上緩解了低鹽脅迫導(dǎo)致的腸道菌群氧化應(yīng)激。在張蓉等[36]關(guān)于小鼠的研究中，也發(fā)現(xiàn)α-LA具有調(diào)整腸道氧化還原狀態(tài)的功效。

根據(jù)先前的報(bào)道，變形菌門是海水蝦的優(yōu)勢(shì)腸道菌群[37-38]。然而在本研究中發(fā)現(xiàn)，低鹽脅迫使得25‰海水對(duì)照組和3‰低鹽對(duì)照組間的腸道菌群群落結(jié)構(gòu)差異巨大，25‰海水對(duì)照組占主導(dǎo)地位的變形菌門在低鹽脅迫后被擬桿菌門所取代，腸道菌群結(jié)構(gòu)的失衡使得條件致病菌，如黃桿菌屬和希瓦氏菌屬等相對(duì)豐度上升，極易導(dǎo)致凡納濱對(duì)蝦受到病害侵襲。值得一提的是，在飼喂1.2 g/kg α-LA之后，凡納濱對(duì)蝦腸道中的希瓦氏菌屬相對(duì)豐度相比3‰低鹽對(duì)照組顯著下降，黃桿菌屬相對(duì)豐度顯著升高。黃桿菌屬是潛在的致病菌，常常造成養(yǎng)殖魚類的死亡[39]，目前尚未清楚α-LA與黃桿菌屬之間的聯(lián)系，還需要進(jìn)一步的研究。此外，研究表明，Donghicola有很大潛力被用作益生菌[40]；Marivita同樣被證明能夠有效降低條件致病菌弧菌的相對(duì)豐度和種類[41]。并且根據(jù)這項(xiàng)研究產(chǎn)生的屬水平熱圖發(fā)現(xiàn)，1.2 g/kg α-LA組中這2種菌株顯著聚集。本研究從腸道菌群的角度探討了α-LA對(duì)凡納濱對(duì)蝦的影響，但α-LA影響腸道菌群的機(jī)制尚未明晰，仍需要進(jìn)一步的探究。

3.4 低鹽脅迫下飼料中添加α-LA對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道菌群功能預(yù)測(cè)的影響

PICRUSt分析顯示，在胞吞作用調(diào)節(jié)途徑中，3‰低鹽對(duì)照組與1.2 g/kg α-LA組之間存在顯著差異，由于低鹽脅迫下的對(duì)蝦更容易感染病害，并且胞吞作用還能夠通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞過程將細(xì)菌吸收到細(xì)胞中，然后在脂質(zhì)體中將其破壞以充當(dāng)針對(duì)細(xì)菌的防御機(jī)制，因此胞吞作用對(duì)甲殼類動(dòng)物的抗病毒免疫非常重要[42]。據(jù)此，本研究推測(cè)，α-LA能夠通過控制微生物介導(dǎo)的功能從而參與胞吞作用的調(diào)節(jié)。此外，1.2 g/kg α-LA組中加壓素調(diào)節(jié)的水重吸收的功能途徑顯著增加，因此，本研究推測(cè)α-LA也能夠?qū)C(jī)體的滲透壓進(jìn)行調(diào)節(jié)從而使對(duì)蝦適應(yīng)3‰鹽度的低鹽脅迫。此外，F(xiàn)cγ受體參與多個(gè)免疫系統(tǒng)作用，例如吞噬細(xì)胞的吞噬作用、炎癥介質(zhì)釋放和抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性等[43]。吞噬作用主要是由Fcγ受體在白細(xì)胞與吞噬顆粒接觸的位點(diǎn)聚集而觸發(fā)，它是先天免疫反應(yīng)的重要組成部分，通過對(duì)感染性病原體的吞噬和破壞，在宿主防御機(jī)制中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[44]。本研究中，1.2 g/kg α-LA組別與3‰低鹽對(duì)照組相比，F(xiàn)cγR介導(dǎo)的吞噬作用的預(yù)測(cè)通路顯著富集，因此，本研究推測(cè)，α-LA能夠通過刺激對(duì)蝦腸道菌群的Fcγ受體功能聚集從而增強(qiáng)其在低鹽脅迫下的免疫能力。

4 結(jié) 論

在3‰鹽度的低鹽脅迫下，凡納濱對(duì)蝦腸道組織受損，腸道菌群組成改變。飼料中添加0.6 g/kg α-LA可以提高低鹽脅迫下凡納濱對(duì)蝦的存活率和抗氧化能力，對(duì)腸道損傷具有一定的修復(fù)作用，并能夠提高腸道菌群組成多樣性和功能。因此，α-LA能夠作為凡納濱對(duì)蝦低鹽養(yǎng)殖環(huán)境下的有效飼料添加劑，緩解低鹽養(yǎng)殖的負(fù)效應(yīng)。