魏 宇 魯康樂 王 玲 宋 凱 張春曉

(集美大學水產(chǎn)學院，廈門市飼料檢測與安全評價重點實驗室，廈門 361061)

高脂飼料是一種脂肪含量相對較高的高能飼料，可發(fā)揮“節(jié)約蛋白質(zhì)”效應[1]，以緩解魚粉等蛋白質(zhì)源的短缺，還可以減少養(yǎng)殖魚類的氨氮排放，起到降低飼料成本和維持養(yǎng)殖環(huán)境的重要作用。特別是隨著高密度集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，高脂飼料被廣泛使用。然而高脂飼料的長期使用會加劇肝臟等部位的脂肪沉積，是誘發(fā)養(yǎng)殖魚類脂肪肝的首要因素[2]。魚類脂肪肝早期癥狀隱匿，隨之發(fā)展會導致生長與飼料利用率下降，一旦遭受病原感染和環(huán)境應激極易發(fā)生群體死亡，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。因此，篩選適當?shù)娘暳咸砑觿Ω咧暳蠈е卖~類脂肪沉積進行調(diào)控非常有必要。

黃連素又稱鹽酸小檗堿，是從黃連、黃柏等植物中提取出來的生物堿，具有多種重要的生理功能，可有效調(diào)節(jié)脂肪代謝、改善脂肪肝癥狀和氧化應激等[3]。陳青青[4]研究發(fā)現(xiàn)，團頭魴高脂飼料中添加黃連素可以改善其免疫功能和抑制肝細胞凋亡，從而緩解高脂飼料導致的脂肪肝發(fā)生。黃連素來源廣、成本低、副作用小、使用安全、易被吸收，是一種非常有潛力的用于調(diào)控脂肪沉積的物質(zhì)，但其在海水魚上的作用卻未見報道。

花鱸又稱海鱸、七星鱸，其肉質(zhì)鮮美，具有較高的營養(yǎng)價值，是一種養(yǎng)殖量較高的海水魚類，根據(jù)《中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒》的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2019年我國花鱸養(yǎng)殖產(chǎn)量已達18.02萬t[5]。然而，花鱸的腹腔體積較大，使用配合飼料養(yǎng)殖的花鱸常導致脂肪在肝臟與腹腔大量沉積，易誘發(fā)脂肪肝，嚴重危害花鱸養(yǎng)殖的健康發(fā)展。據(jù)文獻報道，花鱸對飼料脂肪的需求量為8%～10%[6]；然而，實際生產(chǎn)中為了追求高產(chǎn)量與快速生長，花鱸飼料的脂肪含量普遍高達12%～14%。因此，本試驗以花鱸為研究對象，研究了在高脂飼料下添加黃連素對花鱸生長、脂肪沉積與脂肪代謝的影響，旨在探討黃連素調(diào)控脂肪沉積的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

本試驗選用魚粉、豆粕、谷朊粉為主要蛋白質(zhì)源，魚油、豆油、卵磷脂為脂肪源，配制4種飼料，分別為低脂飼料(LFD組)、低脂飼料+100 mg/kg黃連素(LFD+BBR組)、高脂飼料(HFD組)和高脂飼料+100 mg/kg黃連素(HFD+BBR組)，試驗飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis) %

3)營養(yǎng)水平均為實測值。Nutrient levels were measured values.

將各種原料粉粹后，按照表1稱取各原料后，逐級、充分混勻，加適量的水進行制粒，制作了粒徑分別為1.5和2.5 mm的2種顆粒飼料，將制粒后的飼料用烘箱烘干后，用自封袋保存于-20 ℃冰箱中待用。

1.2 試驗魚與飼養(yǎng)管理

試驗所用花鱸魚苗購于漳州詔安一家花鱸育苗場，養(yǎng)殖試驗在集美大學水產(chǎn)學院龍舟池養(yǎng)殖實驗場的室內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)中進行。將花鱸魚苗運至實驗場后，先暫養(yǎng)于養(yǎng)殖池中1個月，在此期間投喂商品飼料。待魚苗適應試驗環(huán)境后，開始分組進行養(yǎng)殖試驗。

挑選360尾體質(zhì)健壯、規(guī)格均一的花鱸[初始體重為(2.18±0.01) g]，隨機分到12個循環(huán)水養(yǎng)殖缸中，每缸30尾，用4種飼料投喂花鱸，每種飼料投喂3缸。養(yǎng)殖試驗周期為8周，養(yǎng)殖試驗前2周投喂1.5 mm粒徑的飼料，養(yǎng)殖試驗后6周投喂2.5 mm粒徑的飼料。每天飽食投喂2次(08:30和17:30)。記錄每缸魚的攝食量，養(yǎng)殖試驗期間保持以下條件：水溫27～32 ℃，溶氧含量≥5 mg/L，鹽度25.0～28.0 g/L，氨氮含量<0.1 mg/L，pH為7.5～8.5。

1.3 樣品采集與分析

養(yǎng)殖試驗結束后，將魚饑餓24 h后用丁香酚麻醉將魚麻醉(1∶10 000)，撈出稱量并計數(shù)。每缸隨機取6尾對其進行尾靜脈采血，離心分離血清后-80 ℃保存，用于檢測血清生化指標；將魚體置于冰上，用剪刀剪開魚體腹部，隨即取出內(nèi)臟團，用鑷子將肝臟和腹脂剝離，分別獲得整個肝臟組織和腹腔脂肪組織(腹脂)，并稱量腹脂的重量以計算腹脂率，隨后將肝臟和腹脂液氮速凍后于-80 ℃冰箱保存。將每缸剩余的魚體稱重后保存在-20 ℃冰箱中，用作分析魚體全體組成。

血清總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)含量采用南京建成生物工程研究所的試劑盒，按照試劑盒說明書的操作步驟進行測定。

肝臟和腹脂的基因表達按照以下步驟進行：

1)總RNA提取與反轉錄。使用TRIzol試劑(TaKaRa)提取-80 ℃凍存的肝臟和腹脂組織總RNA，用NanoDrop ND-2000分光光度計測定提取的RNA濃度，并通過瓊脂糖凝膠電泳確認RNA的完整性。然后使用Prime ScriptRT試劑盒(TaKaRa)將總RNA反轉錄為cDNA，-20 ℃冰箱保存待用。

2)實時熒光定量PCR。用Premier 5.0軟件進行引物序列設計，引物合成工作由金唯智生物科技有限公司完成，引物序列如表2所示。加樣上機，使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒(南京諾唯贊)和QuantStudioTM6 Flex熒光定量PCR儀(ABI)進行實時熒光定量PCR，熒光定量PCR擴增體系為20 μL，包括10 μL ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(2×)、0.4 μL PCR Forward Primer (10 μmol/L)、0.4 μL PCR Reverse Primer(10 μmol/L)、2.0 μL cDNA 模板、7.2 μL ddH2O。反應程序為95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 62 s，95 ℃ 15 s。

表2 實時熒光定量PCR引物序列Table 2 Primer sequences used for RT-qPCR

續(xù)表2基因名稱Gene names引物序列Primer sequence(5'—3')退火溫度Tm/℃乙酰輔酶A氧化酶AOXF:ATACGTGGTCTGGGAGCCTAR:AGCTGGCTTGGCCTACATTC60脂肪甘油三酯脂肪酶ATGLF:CTTCCTCTCCGCAACAAGTCR:TGGTGCTGTCTGGAGTGTTC60線粒體E3泛素連接酶1Mul1F:GCTGCCGTGATACGAGTCATR:ACGTTGGACAAGGACTGGAC60自噬相關基因5Atg5F:TCAGTCGCTGCCATTAGAGCR:TCTCGTCACCTGCGAAAACT60PTEN誘導激酶1PINK1F:CTGTGAAAGCCCGGTACACTR:TGATGTGGAACTTTGGGGCA60β-肌動蛋白β-actinF:CGCCGCACTGGTTGTTR:TTTGGGGTTCAGGGGG60

1.4 指標計算

增重率(WGR,%)=100×(Wt-W0)/W0；
特定生長率(SGR, %/d)=100×(lnWt-lnW0)/t;
飼料系數(shù)(FCR)=Wf/(Wt-W0)；
蛋白質(zhì)效率(PER)=(Wt-W0)/Wp；
腹脂率(%)=100×Wa/W。

式中：W0為初始魚總重量(g)；Wt為終末魚總重量(g)；W為單尾魚重量(g)；Wf為攝入的飼料總量(干物質(zhì)基礎，g)；Wp為攝入飼料蛋白質(zhì)總量(g)；Wa為腹脂重(g)；t為飼喂天數(shù)(d)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 22.0分析軟件進行雙因素方差分析(two-way ANOVA)，采用Tukey檢驗法進行多重比較，差異水平定為P<0.05。試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差(mean±SD)來表示。

2 結果與分析

2.1 黃連素對花鱸生長及飼料利用的影響

黃連素對花鱸生長及飼料利用的影響如表3所示，脂肪水平和黃連素對花鱸的生長性能有顯著影響(P<0.05)，但無顯著交互作用(P>0.05)。HFD組魚體的末體重、增重率、特定生長率和飼料系數(shù)顯著高于LFD組(P<0.05)；在LFD或HFD組飼料中添加黃連素均顯著降低了魚體的末體重、增重率、特定生長率、飼料系數(shù)和蛋白質(zhì)效率(P<0.05)，說明黃連素對魚體生長有一定的副作用。此外，各組間攝食量、肝體比和存活率均無顯著差異(P>0.05)。

表3 黃連素對花鱸生長及飼料利用的影響Table 3 Effects of berberine on growth and feed utilization of L. maculatus

2.2 黃連素對花鱸脂肪沉積的影響

黃連素對花鱸脂肪沉積的影響如表4所示，與LFD組相比，HFD組花鱸的腹脂率、血清TG和TC的含量顯著升高(P<0.05)。然而，飼料中添加黃連素顯著降低了花鱸的腹脂率(P<0.05)。

表4 黃連素對花鱸脂肪沉積的影響Table 4 Effects of berberine on fat deposition of L. maculatus

2.3 黃連素對花鱸肝臟基因表達的影響

黃連素對花鱸肝臟脂肪分解相關基因表達的影響如圖1所示。肉堿棕櫚酰轉移酶 Ⅰ(CPTⅠ)、乙酰輔酶 A 氧化酶(AOX)、過氧化物酶體增殖受體 α(PPARα)和脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)均是與脂肪分解相關的基因。與LFD組相比，HFD組AOX和PPARα基因相對表達量顯著下調(diào)(P<0.05)、CPTⅠ基因相對表達量有下調(diào)的趨勢但差異不顯著(P>0.05)。與HFD組相比，飼料中添加黃連素后顯著上調(diào)了CPTⅠ、AOX、PPARα和ATGL基因相對表達量(P<0.05)。

黃連素對花鱸肝細胞凋亡基因表達的影響如圖2所示。與LFD組相比，HFD組的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(Caspase9)和Bcl2 關聯(lián) X 蛋白(Bax)的基因相對表達量顯著上調(diào)(P<0.05)。與HFD組相比，飼料中添加黃連素后顯著下調(diào)了Caspase3和Bax基因相對表達量(P<0.05)。

2.4 黃連素對花鱸脂肪組織基因表達的影響

黃連素對花鱸脂肪組織凋亡基因表達的影響如圖3所示。與LFD組相比，HFD組Bax的基因相對表達量顯著下調(diào)(P<0.05)。飼料中添加黃連素后顯著上調(diào)了Caspase9和Bax的基因相對表達量(P<0.05)。

黃連素對花鱸脂肪組織自噬基因表達的影響如圖4所示。與LFD組相比，HFD組的PTEN 誘導激酶1(PINK1)、自噬相關基因5(Atg5)和線粒體E3 泛素連接酶1(Mul1)的基因相對表達量顯著下調(diào)(P<0.05)，飼料中添加黃連素后則上調(diào)了PINK1和Atg5的基因相對表達量(P<0.05)。

3 討 論

脂肪是魚類重要營養(yǎng)素，飼料中脂肪不足會影響魚體的生長，還會導致必需脂肪酸缺乏癥[7-8]。適當?shù)奶岣唢暳现兄镜暮坑欣诖龠M魚體的生長，本試驗結果也表明，將飼料中的脂肪含量提高到14%顯著提高了花鱸的增重率。然而過高的脂肪水平也會對魚體產(chǎn)生一些不利的影響，會出現(xiàn)脂肪過度沉積等現(xiàn)象[9-11]。Wang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，高脂飼料會導致軍曹魚腹腔和肌肉脂肪沉積。凌仕誠[13]研究發(fā)現(xiàn)，過量的脂肪會導致黃顙魚腸系膜脂肪沉積。本試驗結果也證實，HFD組花鱸腹部脂肪沉積提高。

研究表明，黃連素可以降低機體脂肪沉積[14]。為了緩解高脂飼料導致的魚體脂肪過度沉積，本試驗探究飼料中添加黃連素對花鱸生長及脂肪沉積的影響。由生長性能的數(shù)據(jù)看出，相較于HFD組，添加黃連素顯著降低了花鱸的增重率。各組的攝食量變化不大，因此，黃連素降低花鱸增重率的原因并非是通過影響攝食，可能是通過促進分解代謝、增加能量消耗而導致的。

CPTⅠ：肉堿棕櫚酰轉移酶Ⅰ carnitine palmitoyl transferase Ⅰ；AOX:乙酰輔酶A氧化酶 acetyl-coa oxidase；PPARα：過氧化物酶體增殖受體α peroxisome proliferators activated receptor alpha；ATGL：脂肪甘油三酯脂肪酶 adipose triglyceride lipase。

Caspase3：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 cysteinyl aspartate specific proteinase 3；Caspase9：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9 cysteinyl aspartate specific proteinase 9；Bax：Bcl2關聯(lián)X蛋白 Bcl2-associated X；Bcl-2：B細胞淋巴瘤-2 B-cell lymphoma-2。下圖同 the same as below。

圖3 腹脂中凋亡相關基因的相對表達Fig.3 Relative expression of apoptosis related genes in abdominal fat

陳青青[4]在團頭魴上的研究表明黃連素具有促進脂肪分解代謝的作用，與本試驗所得到的高脂飼料中添加黃連素后花鱸脂肪沉積顯著降低結果相似。因此，本研究探討了黃連素對花鱸肝臟脂肪代謝的影響。結果表明，高脂飼料會下調(diào)AOX和PPARa的基因相對表達量，而添加黃連素之后顯著上調(diào)了CPTⅠ、AOX、PPARa和ATGL的基因相對表達量。CPTⅠ是脂肪酸β-氧化過程中的限速酶，對脂肪代謝具有重要的調(diào)控作用，其表達水平升高有助于脂肪分解代謝，降低脂肪沉積[15-16]。過氧化物酶體增殖物激活受體家族成員PPARα是CPTⅠ的上游調(diào)控因子[17]，PPARα可通過調(diào)控CPTⅠ來調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[18]。這與在團頭魴[19]中的研究結果一致，說明黃連素可能通過上調(diào)PPARα基因相對表達量，從而調(diào)節(jié)CPTⅠ的表達加快脂肪氧化分解，最終緩解了脂肪沉積。AOX是過氧化物酶體β-氧化的限速酶，有研究表明，AOX活性降低導致過氧化物酶體β-氧化速率下降[20]；ATGL是甘油三酯水解的限速酶，是催化甘油三酯第1步水解的重要酶，在脂肪分解中發(fā)揮著重要的作用[21]。在本試驗中，黃連素的添加可能是通過提高CPTⅠ、PPARα、AOX的活性，從而提高脂肪酸的氧化速率，并且促進了TG的降解，從而緩解脂肪的沉積。這也提示了黃連素可能會增加機體對能量的消耗，而使得體重降低。

PINK1：PTEN誘導激酶1 PTEN induced putative kinase 1；Atg5：自噬相關基因5 autophagy related gene 5； Mul1：線粒體E3泛素連接酶1 mitochondrial E3 ubiquitin ligase 1。

肝臟脂肪的過度沉積往往會損傷肝細胞，常導致肝細胞凋亡[22-23]。凋亡主要包括外源性的死亡受體途徑和內(nèi)源性的線粒體途徑，Caspase等蛋白水解酶是細胞凋亡過程中的重要效應因子，Caspase可在線粒體途徑中被激活而誘發(fā)凋亡，因此Caspase被稱之為促凋亡因子[24]。本試驗結果可知，高脂飼料組花鱸肝臟Caspase3、Caspase9和Bax的基因相對表達量上調(diào)，說明HFD組肝細胞的凋亡被激活，肝細胞凋亡增多。而添加黃連素后，花鱸肝臟Caspase3和Bax的基因相對表達量顯著下調(diào)，說明黃連素緩解了高脂飼料導致的花鱸肝細胞凋亡，起到了保護肝細胞的作用。

由本研究可知，黃連素有效降低了花鱸腹脂的含量。因此，本試驗還探討了黃連素降低腹脂的分子機制。結果表明，高脂飼料可以顯著降低脂肪細胞的凋亡和自噬相關基因的表達。據(jù)有關文獻可知，脂肪細胞凋亡后導致脂肪細胞的總數(shù)減少了，從而導致脂肪沉積的減少[25-26]。此外，高脂飼料可以顯著降低脂肪細胞自噬相關基因的表達。細胞自噬是一種真核生物中高度保守的代謝過程，可降解脂類等生物大分子物質(zhì)以供細胞重新利用[27]。因此，自噬深度參與脂肪細胞的細胞分化與能量代謝，若自噬被抑制會導致脂肪的沉積，被激活則脂肪沉積會減少。在本試驗研究中，HFD組添加黃連素后提高了PINK1和Atg5基因相對表達量。PINK1被認為是線粒體轉運的分子開關，參與線粒體自噬調(diào)控過程[28]；Atg5是形成自噬復合體的關鍵基因，影響細胞自噬活性，對細胞的自噬調(diào)控有著重要作用。有研究表明，敲除或沉默Atg5可導致脂肪沉積的發(fā)生[29]。因此，高脂飼料抑制了花鱸脂肪細胞的自噬，而黃連素的添加激活了脂肪細胞的自噬，最終緩解了脂肪的沉積。

4 結 論

綜上所述，高脂飼料會導致花鱸的脂肪過度沉積并損傷肝細胞，添加黃連素通過促進脂肪細胞的凋亡與自噬而緩解脂肪沉積，且黃連素還可以上調(diào)肝臟脂肪分解基因的表達，從而促進了脂肪分解；但黃連素會降低花鱸的生長速度和飼料轉化率。