尹夢潔 汪水平 冉 濤 陳 凱 楊大盛 劉 勇 湯少勛* 黃 棋 張永康 譚支良

(1.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，動物營養(yǎng)生理與代謝過程湖南省重點實驗室，畜禽養(yǎng)殖污染控制與資源化技術(shù)國家工程實驗室，亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，長沙 410125；2.西南大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，重慶 402460)

非結(jié)構(gòu)性碳水化合物(nonstructural carbohydrate，NSC)是反芻動物重要的能量來源之一。幼齡反芻動物的健康狀況與成年畜生產(chǎn)水平密切相關(guān)，由于其瘤胃發(fā)育尚不完善，對纖維物質(zhì)的消化能力較弱，其主要依靠降解NSC獲取能量。NSC主要包括可溶性糖和淀粉。根據(jù)淀粉的分子結(jié)構(gòu)，可將其分為直鏈淀粉和支鏈淀粉[1]。直鏈淀粉易老化形成抗性淀粉，阻止內(nèi)源淀粉酶接近，難以被機體直接利用，但能被消化道微生物降解，從而有益于腸道健康[2]。支鏈淀粉在瘤胃內(nèi)降解速率快，能迅速為機體提供能量，有效促進(jìn)瘤胃上皮發(fā)育。但是，支鏈淀粉進(jìn)食量過高，會使揮發(fā)性脂肪酸(VFA)快速累積，可能引起瘤胃pH下降，誘發(fā)亞急性或急性瘤胃酸中毒，進(jìn)而危害瘤胃健康，反而不利于瘤胃上皮發(fā)育[3]。因此，通過調(diào)控飼糧中淀粉結(jié)構(gòu)的組成比例，進(jìn)而調(diào)節(jié)瘤胃發(fā)酵過程以促進(jìn)羔羊瘤胃發(fā)育、維持和提升瘤胃功能的穩(wěn)定是動物營養(yǎng)學(xué)家關(guān)注的焦點之一。研究表明，當(dāng)飼糧直鏈/支鏈淀粉比例從0.12增加到0.48時并不影響羔羊瘤胃細(xì)菌多樣性、均勻度和豐度[4]。而給斷奶前羔羊補飼直鏈/支鏈淀粉比例為0.11～0.44的飼糧時，會顯著降低羔羊瘤胃上皮乳頭長度及上皮各層的厚度[5]。Wang等[2]發(fā)現(xiàn)，給山羊飼喂高直鏈淀粉飼糧，不僅會改善瘤胃pH及VFA濃度與組成，還可改善機體葡萄糖代謝、氮代謝及健康狀況。進(jìn)一步提高飼糧直鏈淀粉比例是否會改善瘤胃功能及其上皮形態(tài)目前并不清楚。因此，本試驗以高直鏈玉米淀粉(簡稱高直玉米)替代正常玉米淀粉，配制3種不同直鏈/支鏈淀粉比例的飼糧，研究其對斷奶羔羊瘤胃液物理特征、瘤胃細(xì)菌組成、瘤胃發(fā)酵及其上皮乳頭形態(tài)特征等的影響，以明晰直鏈淀粉對斷奶羔羊的營養(yǎng)生理作用，并為飼糧配制提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用試驗羊及高直鏈淀粉分別由瀏陽某研發(fā)中心和海南某科技有限公司提供。

1.2 試驗動物及飼養(yǎng)管理

選取27頭體況良好、體重為(8.97±0.19) kg的3月齡湘東黑山羊斷奶羔羊，將其隨機分為3組，每組9頭，其中公羔4頭，母羔5頭。所有試驗羊統(tǒng)一驅(qū)蟲，單籠飼養(yǎng)，每日飼喂2次(09:00和17:00)，自由飲水。試驗期間密切觀察試驗羊采食規(guī)律、行為表現(xiàn)及健康狀況。

1.3 試驗飼糧

試驗飼糧配方與陳凱等[6]的研究相同，飼糧精粗比設(shè)為60∶40，直鏈/支鏈淀粉比例分別約為0.263、0.611和1.833，飼糧精料組成與營養(yǎng)水平見表1。粗料為苜蓿干草，鍘短，長度為1～2 cm；精料經(jīng)2.5 mm篩粉碎。試驗羊自由采食，根據(jù)當(dāng)日剩料量調(diào)整后1 d的投料量。

表1 精料組成與營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of concentrates (DM basis) %

1.4 試驗設(shè)計

采用單因子隨機區(qū)組試驗設(shè)計，將3種飼糧隨機分配給3組試驗羊。試驗期共35 d，其中1～7 d為預(yù)試期，8～35 d為正試期。預(yù)試期內(nèi)，在同一飼養(yǎng)管理條件下，將飼糧逐步過渡到試驗羊各自的試驗飼糧。

1.5 樣品采集及預(yù)處理

在正式期結(jié)束的第2天晨飼前，對所有試驗羊處以安樂死，取出的瘤胃液經(jīng)4層紗布過濾后立即測定瘤胃液Zeta電位、電泳速率及表面張力。同時，從瘤胃腹側(cè)、背側(cè)、前部、后部及中間5個位點共取內(nèi)容物約100 g，立即用4層紗布過濾，濾液裝入1.5 mL無菌無酶管，濾渣裝入50 mL無菌無酶管，迅速放入液氮速凍后，-80 ℃保存待測。從瘤胃頂部、中部及底部分別剪取1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm大小的組織塊放入事先準(zhǔn)備好的固定液(賽維爾生物技術(shù)公司生產(chǎn)，主要成分為多聚甲醛和磷酸鹽緩沖液)中固定。

1.6 指標(biāo)測定

1.6.1 瘤胃液表面張力與電化學(xué)指標(biāo)

用JYW-200B全自動界面張力儀(承德市科承試驗機器有限公司)測定瘤胃液表面張力。用Zeta電位分析儀(Brookhaven Instruments company)測定瘤胃液Zeta電位與電泳速率等電化學(xué)指標(biāo)。

1.6.2 瘤胃液微生物酶活性

參照試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)提供的方法測定瘤胃液中性蛋白酶、α-淀粉酶、中性木聚糖酶及纖維素酶等微生物酶活性；參照試劑盒(南京建成生物工程研究所)提供的方法測定瘤胃液蛋白質(zhì)含量。

中性蛋白酶活性單位(U)定義為30 ℃、堿性條件下每分鐘每毫克蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生1 μmol酪氨酸的量為1個酶活性單位。α-淀粉酶活性單位(U)定義為40 ℃、中性條件下每分鐘每毫克蛋白質(zhì)催化產(chǎn)生1 mg還原糖的量為1個酶活性單位。中性木聚糖酶活性單位(U)定義為50 ℃、pH 6.0下每分鐘每毫克蛋白質(zhì)水解木聚糖產(chǎn)生1 μmol還原糖的量為1個酶活性單位。纖維素酶活性單位(U)定義為40 ℃、中性條件下每分鐘每毫克蛋白質(zhì)催化產(chǎn)生1 μg還原糖的量為1個酶活性單位。

1.6.3 瘤胃內(nèi)容物微生物qPCR定量

采用Light Cycler 480 Ⅱ?qū)崟r熒光定量PCR儀[羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司]測定瘤胃內(nèi)容物濾液中總細(xì)菌、真菌、產(chǎn)甲烷菌、黃色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、反芻獸新月形單胞菌、棲瘤胃普雷沃氏菌、普雷沃氏菌屬及嗜淀粉瘤胃桿菌等微生物的數(shù)量。參照Yu等[7]的方法提取細(xì)菌DNA。引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成，質(zhì)粒DNA提取試劑盒購于艾科瑞生物工程有限公司，實時定量PCR試劑盒購于北京全式金生物技術(shù)有限公司，具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。質(zhì)粒構(gòu)建和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作參照焦金真等[8]的方法進(jìn)行。微生物qPCR引物序列見表2。

表2 微生物qPCR引物序列Table 2 Microbial qPCR primer sequences

稱取約3 g瘤胃內(nèi)容物濾渣，用20 mL生理鹽水洗滌，振蕩30 s，350 r/min離心5 min，沉淀物用20 mL含15%吐溫80的生理鹽水在0 ℃環(huán)境下振蕩2.5 h，4 ℃、15 000 r/min離心15 min后棄去上清液，沉淀物用于測定上述微生物的數(shù)量，操作方法與步驟相同。

1.6.4 瘤胃液VFA的含量

參考Wang等[13]的方法測定VFA含量。發(fā)酵結(jié)束后，取2 mL發(fā)酵液，在15 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min后，取1 mL上清液于1.5 mL離心管，加入0.1 mL 25%偏磷酸固定，靜置15 min。使用1 mL注射器抽取0.8 mL液體過水系0.22 μm濾膜(天津市科億隆實驗設(shè)備有限公司)后裝入上機瓶中，利用液體進(jìn)樣氣相色譜儀(安捷倫7890A，美國)測定發(fā)酵液中各VFA含量。

1.6.5 瘤胃乳頭形態(tài)特征

委托武漢塞維爾生物科技有限公司對瘤胃組織樣品進(jìn)行包埋和切片。使用BX51正置熒光顯微鏡(Olympus Corporation)觀察瘤胃乳頭高度、寬度及絨毛面積。每張切片選取4個形態(tài)較好的瘤胃乳頭進(jìn)行觀測，將瘤胃3個部位的所有數(shù)據(jù)歸類取平均值進(jìn)行統(tǒng)計。

1.7 統(tǒng)計分析

用Excel 2010軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行基本處理，結(jié)果采用SPSS 19.0軟件中的GLM模塊進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗，采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，P≤0.05表示差異顯著，0.05

2 結(jié)果與分析

2.1 瘤胃液表面張力與電化學(xué)指標(biāo)

由表3可知，飼糧直鏈/支鏈淀粉比例對斷奶羔羊瘤胃液表面張力及瘤胃液Zeta電位與電泳速率等電化學(xué)指標(biāo)均無顯著影響(P>0.05)。

表3 飼糧直鏈/支鏈淀粉比例對斷奶羔羊瘤胃液表面張力與電化學(xué)指標(biāo)的影響Table 3 Effects of dietary amylase/amylopectin ratio on surface tension and electrochemistry parameters of rumen fluid in weaned lambs

2.2 瘤胃液微生物酶活性

由表4可知，改變飼糧直鏈/支鏈淀粉比例對瘤胃液中性蛋白酶、α-淀粉酶及纖維素酶活性無顯著影響(P>0.05)。提高飼糧直鏈/支鏈淀粉比例顯著提高中性木聚糖酶活性(P<0.05)，飼糧直鏈/支鏈淀粉比例為1.833時，其瘤胃液中性木聚糖酶活性分別比飼糧直鏈/支鏈淀粉比例為0.611和0.263的組高341%和518%。

表4 飼糧直鏈/支鏈淀粉比例對斷奶羔羊瘤胃液微生物酶活性的影響Table 4 Effects of dietary amylase/amylopectin ratio on microbial enzyme activities of rumen fluid in weaned lambs U/mg prot

2.3 瘤胃內(nèi)容物細(xì)菌數(shù)量

由表5可知，飼糧直鏈/支鏈淀粉比例對斷奶羔羊瘤胃內(nèi)容物液相總細(xì)菌、真菌、產(chǎn)甲烷菌、黃色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、反芻獸新月形單胞菌、普氏菌屬及嗜淀粉瘤胃桿菌等微生物數(shù)量均沒有顯著影響(P>0.05)。飼糧直鏈/支鏈比例對斷奶羔羊瘤胃內(nèi)容物固相細(xì)菌菌群的影響與液相相似，但提高飼糧直鏈/支鏈比例時，固相內(nèi)容物中棲瘤胃普雷沃氏菌數(shù)量會顯著下降(P<0.05)。

表5 飼糧直鏈/支鏈淀粉比例對斷奶羔羊瘤胃內(nèi)容物微生物數(shù)量的影響Table 5 Effects of dietary amylase/amylopectin ratio on microbial population of rumen digesta in weaned lambs lg(copy/g)

2.4 瘤胃液VFA組成

由表6可知，提高飼糧直鏈/支鏈淀粉比例對斷奶羔羊瘤胃液總VFA的濃度以及乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸濃度和乙酸/丙酸均無顯著影響(P>0.05)。

表6 飼糧直鏈/支鏈淀粉比例對斷奶羔羊瘤胃液VFA組成的影響Table 6 Effects of dietary amylose/amylopectin ratio on VFA composition of rumen fluid in weaned lambs

2.5 瘤胃上皮乳頭形態(tài)特征

由圖1和表7可知，飼糧直鏈/支鏈淀粉比例對斷奶羔羊瘤胃乳頭高度、寬度與表面積均無顯著影響(P>0.05)，但飼糧直鏈/支鏈淀粉比例為1.833時，瘤胃上皮乳頭寬度相對飼糧直鏈/支鏈淀粉比例為0.611組提高17.0%(P=0.010)。

表7 飼糧直鏈/支鏈淀粉比例對斷奶羔羊瘤胃乳頭形態(tài)特征的影響Table 7 Effects of dietary amylase/amylopectin ratio on morphological characteristics of rumen papilla in weaned lambs

圖1 斷奶羔羊瘤胃上皮乳頭形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of rumen epithelial in weaned lambs (200×)

3 討 論

3.1 瘤胃液表面張力與電化學(xué)指標(biāo)

表面張力是液體物質(zhì)的特性，其大小對瘤胃發(fā)酵、微生物活性及酶活性及微生物的黏附能力都有影響[14-15]，并受兩相界面中離子濃度的影響，一般隨溶質(zhì)濃度的增加而降低，而且乙酸、丙酸、丁酸等有機酸都有降低溶液表面張力的作用[16]。本試驗發(fā)現(xiàn)，3組試驗羊的瘤胃液表面張力在48.8～51.1 mN/m，略低于瘤胃液正常表面張力范圍(50～69 mN/m)[17]，這可能與本研究飼糧中淀粉含量較高、生成較多的有機酸(如乙酸、丙酸、丁酸等)有關(guān)，進(jìn)而降低了瘤胃液的表面張力。張芳芳[4]采用精料淀粉含量為44%左右的飼糧飼喂斷奶羔羊35 d時，瘤胃液總VFA濃度(44～47 mmol/L)低于本研究采用精料淀粉含量為50%～55%的飼糧飼喂斷奶羔羊35 d的結(jié)果(53～57 mmol/L)。由于可供參考的文獻(xiàn)相當(dāng)少，引起瘤胃液表面張力降低的具體原因還需更多研究加以證實。本研究中改變飼糧直鏈/支鏈淀粉比例對瘤胃液表面張力無顯著影響，產(chǎn)生這種結(jié)果可能與本試驗各組均采用相同的粗飼料，而精飼料中的淀粉含量相同，進(jìn)而3組試驗羊瘤胃液總VFA濃度相近有關(guān)。微生物表面界面電動勢，即Zeta和電泳速率，表示微生物表面固液界面上電勢差，是反映微生物表面物理化學(xué)特性的因素之一，它與微生物的黏附過程及生物膜的形成有關(guān)[18]。Zeta電位絕對值越高，則微生物聚集程度越低，體系越穩(wěn)定，并且死亡細(xì)菌的Zeta電位絕對值更低[19]。本試驗結(jié)果表明，改變飼糧直鏈/支鏈淀粉比例不會影響瘤胃微生物體系的穩(wěn)定性，同時也說明3組的微生物體系的穩(wěn)定性相近。

3.2 瘤胃內(nèi)容物微生物數(shù)量及酶活性

飼糧化學(xué)成分及其攝入量是影響瘤胃微生物區(qū)系的關(guān)鍵因素。嗜淀粉瘤胃桿菌、棲瘤胃普雷沃氏菌及反芻獸新月形單胞菌是主要的淀粉降解菌，瘤胃球菌與產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌是主要的纖維降解菌。棲瘤胃普雷沃氏菌是瘤胃數(shù)量較多的一類細(xì)菌，具有降解淀粉、植物細(xì)胞壁多糖及蛋白質(zhì)的能力[15]。本試驗中，飼糧直鏈/支鏈淀粉比例對瘤胃液相內(nèi)容物優(yōu)勢菌種數(shù)量無顯著影響，這可能與本試驗中3組飼糧的蛋白質(zhì)與纖維等的含量與來源都比較一致有關(guān)。但當(dāng)飼糧直鏈/支鏈淀粉比例提高到0.611以上時顯著降低瘤胃固相內(nèi)容物中棲瘤胃普雷沃氏菌的數(shù)量，棲瘤胃普雷沃氏菌的數(shù)量主要與底物蛋白質(zhì)含量和能量水平有關(guān)[20]。本試驗中發(fā)酵底物蛋白質(zhì)含量差異較小，故引起棲瘤胃普雷沃氏菌數(shù)量差異的主要原因可能是飼糧直鏈/支鏈淀粉比例超過0.611的組別其總淀粉含量比0.263組低(表1)。由于試驗中酶活性的測定條件與瘤胃環(huán)境條件不一致，其降解飼糧養(yǎng)分的酶活性可能不完全能反映其真實的活性，但由于3組瘤胃液酶活性是在相同條件下進(jìn)行測定的，因此研究結(jié)果在一定程度上可以反映飼糧直鏈/支鏈淀粉比例對瘤胃液酶活性的影響。

飼糧中營養(yǎng)物質(zhì)的降解效率的高低很大程度上受瘤胃內(nèi)酶活性的影響，本試驗中提高飼糧直鏈/支鏈淀粉比例對瘤胃液中性蛋白酶、α-淀粉酶及纖維素酶活性無顯著影響，可能與3組間瘤胃內(nèi)容物中合成上述酶相關(guān)微生物，如嗜淀粉瘤胃桿菌、瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和普氏菌屬等的數(shù)量變化較小有關(guān)；另外，1.833組的試驗羊瘤胃液中性木聚糖酶活性較其余2組要高。這可能與該組瘤胃固相內(nèi)容物中含有產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌數(shù)量較多有關(guān)，其產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌數(shù)量相對其他2組高4.67%。此外，淀粉的降解程度以及酶的可及性與其結(jié)晶度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，結(jié)晶度越高淀粉的抗性越強[2]。直鏈淀粉含有大量氫鍵，可在淀粉分子表面形成致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，增加表面疏水性，降低淀粉溶解性，阻礙底物與酶的結(jié)合。Stevneb?等[21]對不同直鏈淀粉含量的大麥淀粉水解特性的研究表明，含高直鏈(36.0%～49.0%)或中等直鏈淀粉(23.1%～29.4%)的大麥淀粉的水解率比低直鏈淀粉(0～3.3%)的低34%～54%。本研究中，飼糧直鏈/支鏈淀粉比例為1.833組的直鏈淀粉含量較其余2組高(1.833組相對0.263組和0.611組直鏈淀粉含量分別高22.1%和13.4%)，進(jìn)而淀粉的水解也低于其他2組。Huang等[22]發(fā)現(xiàn)，底物快速降解組分的終產(chǎn)物濃度與微生物纖維降解酶活性間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，增加可溶性碳水化合物組分，會使纖維降解酶活性降低，這可能也是直鏈/支鏈淀粉比例為1.833組的瘤胃液木聚糖酶活性高于其他2組的原因之一。飼糧直鏈/支鏈淀粉比例為1.833組的中性洗滌纖維及酸性洗滌纖維消化率最高(分別為80.45%、72.90%)也可能與該組瘤胃液中性木聚糖酶活性較高有關(guān)[6]。本試驗中，雖然3組間瘤胃液α-淀粉酶活性差異不顯著，但其活性隨飼糧直鏈/支鏈淀粉比例的提高而降低，與前人的研究結(jié)果相同，說明直鏈淀粉對淀粉酶的降解有抗性作用，不易被瘤胃微生物降解。

3.3 瘤胃上皮乳頭形態(tài)特征

瘤胃壁凸起的乳頭可增大上皮與內(nèi)容物的接觸面積，提高育肥羊瘤胃乳頭長度、寬度和密度等組織形態(tài)結(jié)構(gòu)可提高育肥性能、屠宰性能和營養(yǎng)物質(zhì)消化率[23]。在本試驗中，雖然3組間瘤胃乳頭高度無顯著差異，但提高飼糧直鏈/支鏈淀粉比例為0.611時瘤胃乳頭高度相對0.263組和1.833組，分別提高了18.6%和10.2%，可能與該組瘤胃液中啟動瘤胃上皮發(fā)育的關(guān)鍵性短鏈脂肪酸-丁酸的濃度較高有關(guān)[24]，相對0.263組和1.833組，0.611組瘤胃液丁酸濃度分別提高了32.2%和41.5%。另外，飼糧直鏈/支鏈淀粉比例提高到1.833時斷奶羔羊瘤胃上皮乳頭寬度相對0.263組和0.611組分別提高了8.12%和17.00%，同時，飼糧直鏈/支鏈淀粉比例提高到0.611或1.833時斷奶羔羊瘤胃乳頭表面積相對0.263組分別提高13.7%和20.3%，更有利于斷奶羔羊瘤胃對營養(yǎng)的吸收，這也可能是我們前期研究中發(fā)現(xiàn)飼糧直鏈/支鏈淀粉比例為0.611和1.833時羔羊平均日增重顯著高于0.263組的原因之一[6]，同時，結(jié)果說明適當(dāng)提高飼糧直鏈淀粉比例可促進(jìn)斷奶羔羊瘤胃乳頭發(fā)育。Zhao等[25]通過飼喂4種含不同淀粉來源的飼糧后發(fā)現(xiàn)，提高飼糧直鏈/支鏈淀粉比例可增大哺乳羔羊瘤胃乳頭面積，與本試驗結(jié)果相近。孫大明等[5]提高開食料直鏈/支鏈淀粉比例減少了哺乳羔羊瘤胃乳頭高度與面積，與本試驗結(jié)果不一致。上述試驗結(jié)果不同，可能與羊只生長階段、飼糧結(jié)構(gòu)、營養(yǎng)組成及直鏈/支鏈淀粉設(shè)置比例等因素有關(guān)。

4 結(jié) 論

改變飼糧中直鏈/支鏈淀粉比例不會影響斷奶羔羊瘤胃微生物體系穩(wěn)定性和瘤胃液表面張力；適當(dāng)提高飼糧直鏈/支鏈淀粉比例可促進(jìn)斷奶羔羊瘤胃上皮發(fā)育；提高瘤胃直鏈/支鏈淀粉比例會提高瘤胃液木聚糖酶活性；在湘東黑山羊斷奶羔羊飼糧中直鏈/支鏈淀粉比例不超過0.611較為適宜。