李 敏 趙圣國 鄭 楠 王加啟*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學動物科技學院動物醫(yī)學院，武漢 430070；2.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京 100193)

瘤胃微生物蛋白合成量的估測方法主要分為2類，包括外源標記物和內(nèi)源標記物[1]。外源標記物主要包括磷-32(32P)、硫-35(35S)、氮-15(15N)，內(nèi)源標記物主要包括三磷酸腺苷(ATP)、嘧啶、嘌呤和核酸。嘌呤衍生物法相比于其他方法不僅節(jié)約成本，且方法簡單、快速、不需瘺管動物。飼糧中核酸進入瘤胃被微生物降解成核苷酸、核苷、堿基，這些底物作為前體物質(zhì)合成微生物核酸，微生物核酸進入小腸后被降解成嘌呤核苷和堿基，其中一小部分被利用合成組織核酸，而未被利用的嘌呤則以嘌呤衍生物形式進入血液，最終隨尿液、唾液和奶排出體外。嘌呤衍生物包括次黃嘌呤、黃嘌呤、尿囊素和尿酸，其含量受動物品種、采食量和飼糧蛋白質(zhì)水平的影響[2]。由于奶牛腸道黏膜內(nèi)含有較高活性的黃嘌呤氧化酶，因此奶牛的嘌呤衍生物只有尿囊素和尿酸。目前，人們普遍認為血漿、乳或尿中嘌呤衍生物含量是衡量十二指腸可利用微生物蛋白的指標[3-6]。雖然在嘌呤衍生物含量與微生物蛋白產(chǎn)量關(guān)系的研究已獲得很大進步，但影響嘌呤衍生物含量的因素仍然沒有弄清楚，尤其是奶牛個體生理因素對嘌呤衍生物含量影響的相關(guān)研究尚未報道[7]。由于血液更容易采集，通過研究血漿嘌呤衍生物含量的變化，可為基于嘌呤衍生物的微生物蛋白合成量預測模型提供優(yōu)化依據(jù)。鑒于此，本試驗以284頭荷斯坦奶牛為研究對象，探討了奶牛的產(chǎn)奶性能、瘤胃發(fā)酵參數(shù)以及血漿生化指標對血漿嘌呤衍生物含量的影響，為提高嘌呤衍生物評估微生物蛋白產(chǎn)量的準確度提供建議。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

選取284頭同一牧場2胎次的健康泌乳前期荷斯坦奶牛，并根據(jù)牛場原有記錄剔除乳房炎病牛，同時記錄奶牛的泌乳日齡(24～77 d)、產(chǎn)奶量[(46.93±7.09) kg]。所有試驗奶牛散欄式飼養(yǎng)，飼喂同一全混合日糧(TMR)，飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1，飼糧的15N豐度為0.55‰。所有奶牛自由采食和飲水，每日飼喂3次，擠奶3次。

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the diet (DM basis) %

1.2 樣品采集與分析測定

1.2.1 奶樣采集與產(chǎn)奶性能測定

分別在05：00、14：00、17：00利用轉(zhuǎn)盤式擠奶臺進行機械擠奶。記錄奶牛產(chǎn)奶量的同時采集奶樣，共采集3次奶樣，并按照早中晚比例4∶3∶3混合均勻，取樣50 mL添加防腐劑(北京嘉源科技有限公司提供，主要成分為溴硝丙二醇)，4 ℃保存送至當?shù)貦z測中心利用近紅外光譜儀進行乳蛋白、尿素氮含量檢測。

1.2.2 瘤胃液采集與瘤胃發(fā)酵參數(shù)測定

晨飼后2 h內(nèi)使用瘤胃采集器經(jīng)口腔采集瘤胃液，將抽取的前100 mL瘤胃液舍棄，采集到的瘤胃液分裝于15 mL離心管中，置于液氮中冷凍保存。待檢前，將凍存瘤胃液解凍，取2 mL瘤胃液，4 ℃、13 000×g離心5 min，取600 mL瘤胃上清液，加入50 μL 25%偏磷酸，12 000×g離心20 min，上清液置于-20 ℃保存。氨態(tài)氮含量采用苯酚-次氯酸鈉比色法測定[8]。揮發(fā)性脂肪酸含量使用氣相色譜儀測定(安捷倫7890A)[9]。

1.2.3 血樣采集與血漿生化指標測定

晨飼后2 h內(nèi)使用肝素抗凝管采集尾靜脈血10 mL，4 000×g離心5 min，血漿分裝置于-20 ℃保存。采用全自動生化儀(AU 5800，貝克曼)檢測血漿尿酸、肌酐、β-羥丁酸、游離脂肪酸、葡萄糖、尿素氮、乙酰乙酸含量。游離氨基酸含量使用總氨基酸測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)檢測。采用雙抗體夾心法在450 nm處測定血漿尿囊素含量(上海科淘生物科技中心)。嘌呤衍生物含量是尿酸含量與尿囊素含量之和。參照賀媛媛[10]的檢測方法，用Isoprime 100元素分析-同位素比率質(zhì)譜儀(英國Isoprime公司)分別測定飼糧和血漿的15N豐度。Δ15N是血漿15N豐度與飼糧15N豐度之差，它可以克服個體層面的差異，尤其適用于大群體奶牛，有效地評估氮利用率[11]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用Excel 2010對數(shù)據(jù)進行初步整理，計算各指標的平均值、標準差、中位數(shù)、最大值、最小值以及變異系數(shù)。利用GraphPad Prism 7.0進行單因子方差分析和線性回歸分析，同時進行皮爾遜相關(guān)性分析，P<0.05表示顯著相關(guān)，P<0.01表示極顯著相關(guān)。

2 結(jié) 果

2.1 奶牛的血漿嘌呤衍生物含量、產(chǎn)奶性能、瘤胃發(fā)酵參數(shù)和血漿生化指標

表1列出了284頭荷斯坦奶牛的產(chǎn)奶性能、瘤胃發(fā)酵參數(shù)和血漿生化指標。由表可知，奶牛血漿中尿酸含量的平均值為38.23 μmol/L，最大值為80 μmol/L。尿囊素含量的平均值為0.30 μmol/L，最大值為0.46 μmol/L。嘌呤衍生物含量的平均值為38.53 μmol/L，最大值為38.53 μmol/L。尿酸、尿囊素和嘌呤衍生物的變異系數(shù)分別為35.91%、24.36%、35.59%。

2.2 血漿嘌呤衍生物含量與奶牛產(chǎn)奶性能的相關(guān)性

由表2可知，血漿尿酸含量與泌乳日齡、乳蛋白產(chǎn)量均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與產(chǎn)奶量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，而與乳尿素氮、乳蛋白含量無顯著相關(guān)性(P>0.05)。血漿尿囊素含量與泌乳日齡、乳蛋白含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01，圖1)，與乳尿素氮含量、產(chǎn)奶量、乳蛋白產(chǎn)量無顯著相關(guān)性(P>0.05)。血漿嘌呤衍生物含量與泌乳日齡、乳蛋白產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與產(chǎn)奶量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，而與乳尿素氮、乳蛋白含量無顯著相關(guān)性(P>0.05)。上述相關(guān)性多屬于弱相關(guān)，在統(tǒng)計分析上呈顯著性。

表2 奶牛的血漿嘌呤衍生物含量、產(chǎn)奶性能、瘤胃發(fā)酵參數(shù)和血漿生化指標Table 2 Plasma purine derivative contents, milk performance, rumen fermentation parameters and plasma biochemical indices of dairy cows

圖1 泌乳日齡與血漿尿囊素含量散點圖Fig.1 Scatter plot of lactation days withplasma allantoin content

2.3 血漿嘌呤衍生物含量與瘤胃發(fā)酵參數(shù)的相關(guān)性

由表3可知，血漿尿酸和嘌呤衍生物含量與瘤胃丁酸含量呈顯著正相關(guān)(P<0.01)，與瘤胃異戊酸含量呈極顯著負相關(guān)(P<0.01)；血漿尿囊素含量與瘤胃異戊酸含量呈顯著負相關(guān)(P<0.05)，而與瘤胃丁酸含量無顯著相關(guān)性(P>0.05)。除此之外，血漿尿酸、尿囊素、嘌呤衍生物含量與瘤胃乙酸、丙酸、異丁酸、氨態(tài)氮含量及乙酸/丙酸均無顯著相關(guān)性(P>0.05)。上述相關(guān)性多屬于弱相關(guān)，在統(tǒng)計分析上呈顯著性。

表3 血漿嘌呤衍生物含量與奶牛產(chǎn)奶性能的相關(guān)性Table 3 Correlations of plasma purine derivative contents with milk performance of dairy cows

2.4 血漿嘌呤衍生物含量與血漿生化指標的相關(guān)性

由表4可知，血漿尿酸含量與Δ15N、血漿肌酐含量呈極顯著負相關(guān)(P<0.01)，與血漿游離脂肪酸、葡萄糖含量呈極顯著或顯著正相關(guān)(P<0.01或P<0.05)，但與血漿β-羥丁酸、尿素氮、乙酰乙酸、游離氨基酸含量無顯著相關(guān)性(P>0.05)。血漿尿囊素含量與血漿肌酐、乙酰乙酸、尿素氮含量呈極顯著或顯著正相關(guān)(P<0.01或P<0.05，圖2)，與血漿游離脂肪酸、葡萄糖含量呈極顯著或顯著負相關(guān)(P<0.01或P<0.05)，而與Δ15N及血漿β-羥丁酸、游離氨基酸含量無顯著相關(guān)性(P>0.05)。血漿嘌呤衍生物含量與Δ15N、血漿肌酐含量呈極顯著負相關(guān)(P<0.01)，與血漿游離脂肪酸、葡萄糖含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，但與血漿尿素氮、乙酰乙酸、游離氨基酸含量無顯著相關(guān)性(P>0.05)。上述相關(guān)性多屬于弱相關(guān)，在統(tǒng)計分析上呈顯著性。

圖2 血漿乙酰乙酸含量與血漿尿囊素含量散點圖Fig.2 Scatter plot of plasma acetoacetic acid content with plasma allantoin content

表4 血漿嘌呤衍生物含量與瘤胃發(fā)酵參數(shù)的相關(guān)性Table 4 Correlations of plasma purine derivatives contents with rumen fermentation parameters

3 討 論

3.1 血漿嘌呤衍生物含量與奶牛產(chǎn)奶性能的相關(guān)性

在相同營養(yǎng)條件下，奶牛對飼糧蛋白質(zhì)的消化和吸收不同，從而導致血漿嘌呤衍生物含量不同。血漿嘌呤衍生物排出途徑主要是經(jīng)腎臟隨尿液排出，其次是通過乳腺或唾液排出，并且血漿嘌呤衍生物含量與尿嘌呤衍生物排泄量呈高度正相關(guān)[12]。在本試驗中，血漿尿酸、尿囊素含量的平均值分別為38.23和0.30 μmol/L，且血漿尿酸含量占嘌呤衍生物含量的99%。Gonzalez-Ronquillo等[4]研究表明，泌乳前期和泌乳后期的奶牛尿嘌呤衍生物含量和乳嘌呤衍生物排泄量不同。Giesecke等[13]研究發(fā)現(xiàn)，奶牛產(chǎn)奶量與血漿尿囊素含量(r=0.78)、乳尿囊素排泄量(r=0.95)呈顯著正相關(guān)。本試驗結(jié)果也表明了泌乳日齡、產(chǎn)奶量和乳蛋白產(chǎn)量與血漿嘌呤衍生物含量呈正相關(guān)。因此，泌乳日齡和產(chǎn)奶量影響機體對嘌呤堿基的吸收和代謝。

表5 血漿嘌呤衍生物含量與血漿生化指標的相關(guān)性Table 5 Correlations of plasma purine derivatives contents with plasma biochemical indices

3.2 血漿嘌呤衍生物含量與瘤胃發(fā)酵參數(shù)的相關(guān)性

瘤胃氨態(tài)氮和揮發(fā)性脂肪酸含量是評價瘤胃發(fā)酵特征的主要指標。氨態(tài)氮含量反映了瘤胃內(nèi)蛋白質(zhì)平衡狀況，其含量受瘤胃微生物利用速度和瘤胃壁吸收速度的影響[2]。揮發(fā)性脂肪酸主要來源于瘤胃微生物對碳水化合物的消化，是動物機體主要的能量來源[14]。研究表明，血漿嘌呤衍生物含量與瘤胃微生物蛋白產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)，而瘤胃微生物蛋白產(chǎn)量與能量載體物質(zhì)和含氮物質(zhì)密切相關(guān)[15]。本研究結(jié)果表明，瘤胃氨態(tài)氮、乙酸、丙酸和異丁酸含量與血漿嘌呤衍生物含量無顯著相關(guān)性，而瘤胃丁酸含量與血漿嘌呤衍生物含量呈顯著正相關(guān)，瘤胃戊酸、異戊酸含量與血漿嘌呤衍生物含量呈顯著負相關(guān)性，這說明了血漿嘌呤衍生物含量與碳水化合物代謝相關(guān)，但相關(guān)性較弱。瘤胃丁酸含量與血漿嘌呤衍生物含量表現(xiàn)的強相關(guān)，可能是由于丁酸可以促進微生物的生長活動，從而使微生物更好地利用氮源去合成微生物蛋白[16]。異戊酸屬于支鏈揮發(fā)性脂肪酸，可以為氨基酸的合成提供碳骨架，但因異戊酸和戊酸含量總占比不足10%，目前相關(guān)研究較少，其相互作用關(guān)系還需進一步深入研究。

3.3 血漿嘌呤衍生物含量與血漿生化指標的相關(guān)性

氮同位素分餾使自然豐度下的15N差異富集，其中Δ15N可以表征不同飲食和飼養(yǎng)條件下奶牛氮利用率的變化[17]。據(jù)報道，Δ15N與氮利用率呈顯著負相關(guān)，與瘤胃微生物蛋白合成效率呈負相關(guān)[11，18]。本試驗發(fā)現(xiàn)，Δ15N與血漿嘌呤衍生物含量呈顯著負相關(guān)，說明嘌呤衍生物與機體的氮代謝有關(guān)。肌酐是動物肌肉中磷酸肌酸的代謝產(chǎn)物，反映機體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝水平[19-22]。血液中肌酐含量越高說明機體內(nèi)肌肉降解程度越高[23]。本研究中，血漿肌酐含量與血漿嘌呤衍生物含量呈顯著負相關(guān)，說明機體內(nèi)氨基酸被充分利用，減少肌肉降解，有利于微生物蛋白的合成。游離脂肪酸和葡萄糖含量間接反映了奶牛的能量代謝狀況[24-25]。游離脂肪酸經(jīng)過β氧化產(chǎn)生酮體，主要包括β-羥丁酸和乙酰乙酸，它們與動物機體內(nèi)脂肪的動員程度密切相關(guān)[26]。本研究表明，血漿游離脂肪酸、葡萄糖含量與血漿嘌呤衍生物含量呈顯著正相關(guān)，血漿β-羥丁酸和乙酰乙酸含量與血漿嘌呤衍生物含量無顯著相關(guān)性，但血漿乙酰乙酸含量與血漿尿囊素含量呈顯著正相關(guān)，進一步說明機體的嘌呤代謝與能量代謝息息相關(guān)。血漿游離氨基酸主要被乳腺利用合成乳蛋白[24-29]。尿素氮是衡量機體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝及氨基酸平衡的重要指標[30-31]。但本試驗結(jié)果表明，血漿游離氨基酸和尿素氮含量與血漿嘌呤衍生物含量均無顯著相關(guān)性，與上述結(jié)果不一致，提示了體內(nèi)試驗較為復雜，血漿生化指標受多個因素的干擾。因此，在血漿利用嘌呤衍生物含量估算瘤胃微生物蛋白合成量時，應盡量避免上述影響因素，以提高計算的準確性。

4 結(jié) 論

本試驗通過血漿嘌呤衍生物含量與泌乳前期奶牛的產(chǎn)奶性能、瘤胃發(fā)酵參數(shù)以及血漿生化指標的相關(guān)性分析，表明了影響奶牛血漿嘌呤衍生物的生理因素包括：泌乳日齡、乳蛋白產(chǎn)量、產(chǎn)奶量，瘤胃異戊酸、戊酸、丁酸含量，血漿Δ15N和肌酐、游離脂肪酸、葡萄糖含量。