李 斌 旦增曲珍 白瑪央金 馬金英 金 濤

(西藏自治區(qū)農牧科學院畜牧獸醫(yī)研究所，拉薩 850009)

隨著我國畜牧業(yè)的快速發(fā)展，人畜爭糧現(xiàn)象日益嚴重，發(fā)展節(jié)糧型畜牧業(yè)是緩解這一矛盾的重要途徑。據(jù)報道，我國農作物秸稈2010年產(chǎn)量就已達8.4億t，但由于秸稈營養(yǎng)價值低且品質差的缺點，使秸稈在動物生產(chǎn)中的應用受到較大的限制[1]，要想提高其營養(yǎng)價值必須經(jīng)過合理的加工[2]。目前，秸稈的生物處理方法包括青貯和黃貯，黃貯是依靠枯草芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌和產(chǎn)纖維素菌等益生菌，通過厭氧發(fā)酵提高秸稈的營養(yǎng)價值和利用率，提高適口性，并且能夠長期保存[3-5]。

反芻動物瘤胃液中的微生物能夠分泌纖維素酶并降解纖維素[6-7]。Lee等[8]研究表明，稻草秸稈青貯時添加純培養(yǎng)瘤胃真菌能夠降低青貯飼料中酸性洗滌纖維(ADF)和中性洗滌纖維(NDF)含量，提高青貯飼料粗纖維的降解率。Guo等[9]研究發(fā)現(xiàn)，體外發(fā)酵飼糧中添加纖維素分解菌提高了產(chǎn)氣量及氨態(tài)氮(NH3-N)、總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)、乙酸和丙酸含量，提高了中性洗滌纖維降解率(NDFD)，促進了飼料的消化降解。本實驗室在西藏黃牛瘤胃中篩選出了1株高產(chǎn)纖維素酶菌株N30，與其他從西藏地區(qū)動物胃腸道中篩選得到的產(chǎn)纖維素酶菌株相比，高產(chǎn)纖維素酶菌株N30活性較高，且在更寬的溫度范圍內保持較高活性、溫度穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性[10]，但是該菌株是否能夠促進黃貯的體外發(fā)酵進而提高黃貯品質還是未知。因此，本試驗擬通過體外發(fā)酵法探究高產(chǎn)纖維素酶菌株N30處理對小麥、青稞和油菜黃貯發(fā)酵指標的綜合影響效果，為其在反芻動物中的高效利用提供理論依據(jù)和實踐指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 飼料和菌株來源

小麥、青稞和油菜秸稈取自西藏自治區(qū)拉薩市達孜縣塔杰鄉(xiāng)。纖維素分解菌為高產(chǎn)纖維素酶菌株N30，由西藏黃牛瘤胃液中篩選而得，具體篩選步驟參照張元慶等[11]的方法。菌液與30%甘油以1∶1比例混合，-20 ℃保存。對小麥、青稞和油菜秸稈進行實驗室小批量黃貯發(fā)酵，每種秸稈各發(fā)酵12袋，秸稈鍘切為2.5 cm的小段，裝入真空聚乙烯袋中，每袋500 g，將發(fā)酵用纖維素分解菌進行活化培養(yǎng)，配制成2種不同濃度的菌液，分別為1×1010和2×1010CFU/kg，均勻撒于秸稈上，秸稈的水分含量控制在65%～70%，壓實將空氣排出，最后用封口膜封口，室溫下發(fā)酵60 d。

1.1.2 瘤胃液供體動物

選用4只健康、體重(25.0±0.5) kg、安裝瘤胃瘺管的成年湘東黑山羊作為瘤胃液供體。飼糧按精粗比40∶60制成全混合日糧(TMR)，其組成及營養(yǎng)水平參照NRC(2007)山羊營養(yǎng)需要量進行配制，每天08:00和18:00各飼喂1次，自由飲水。

1.1.3 體外發(fā)酵

體外發(fā)酵液按照培養(yǎng)液與瘤胃液2∶1的比例配制而成[12]。體外發(fā)酵裝置由HZS-H型恒溫水浴搖床和容積為100 mL的玻璃注射器(最小刻度為1 mL)組成。注射器每次使用之前需洗凈、烘干，然后用少量液體石蠟涂在活塞筒的四周，以防漏氣，并可減少氣體產(chǎn)生過程中活塞向上移動的阻力。

1.2 試驗設計及測定指標

體外發(fā)酵飼料為小麥、青稞和油菜黃貯，統(tǒng)一過1 mm篩。每種發(fā)酵飼料分為3個組，分別為對照組、添加1×1010CFU/kg纖維素分解菌組(Ⅰ組)和添加2×1010CFU/kg纖維素分解菌組(Ⅱ組)。

對發(fā)酵小麥、青稞和油菜黃貯進行感官評定，具體方法參照青貯飼料質量評定標準[13]。

27個發(fā)酵管隨機分為9組，每組2個重復。在每個發(fā)酵管內裝200 mg發(fā)酵飼料和1 mL菌液，用平板計數(shù)法確定菌量。Ⅰ和Ⅱ組分別添加1 mL的1×1010和2×1010CFU/kg菌液，對照組中加入1 mL滅活的菌液，并迅速加入培養(yǎng)液至30 mL，進行體外發(fā)酵試驗。

于發(fā)酵2、4、8、12、24、48 h測定厭氧發(fā)酵瓶內氣壓，并按公式[y=(x-0.816)/0.805]換算成室溫標準氣壓下的氣體體積，計算產(chǎn)氣量，參照Wang等[14]提出的方法計算：

式中：GPt表示t時刻的累積產(chǎn)氣量(mL/g)；Vf表示潛在最大產(chǎn)氣量(mL/g)；k表產(chǎn)氣速率(h-1)；b表示形狀參數(shù)。下式同。

起始底物降解速率[FRO0，mmol/(g·h)]，即當t=0時的底物降解速率，計算公式參考Wang等[15-16]的模型，數(shù)學表達方程為：

發(fā)酵結束后，將注射器內全部培養(yǎng)物取出，并立即用pH計測定pH，然后將一部分培養(yǎng)物以3 500×g離心15 min，上清液分別裝入不同的離心管中，-20 ℃冷凍保存，待測NH3-N、微生物蛋白(MCP)和揮發(fā)性脂肪酸(VFA)含量；一部分發(fā)酵液過400目尼龍布后將殘渣全部轉移至石英坩堝中用熱蒸餾水反復沖洗，隨后置于105 ℃烘箱中烘干以測定干物質降解率(DMD)和NDFD。NH3-N含量采用苯酚-次氯酸鈉比色法測定[17]，VFA(乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、異丁酸及異戊酸)含量使用氣相色譜儀(安捷倫7890A，美國)測定[18]，參照董曉玲等[19]的方法進行測定。MCP含量采用考馬斯亮藍法測定[20]，甲烷(CH4)產(chǎn)量于體外瘤胃發(fā)酵48 h時，使用氣相色譜儀測定。

1.3 統(tǒng)計分析

采用Excel 2010軟件對試驗數(shù)據(jù)進行計算和整理，采用SAS 9.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，對差異顯著項目進行多重比較，并采用Tukey法鑒定比較平均值之間的差異顯著性，以P<0.05作為差異顯著判斷標準，0.05

2 結 果

2.1 不同濃度纖維素酶菌劑處理對小麥、青稞和油菜黃貯化學成分的影響

由表1、表2和表3可知，Ⅰ組的小麥和青稞黃貯的感官評分顯著高于對照組(P<0.05)。Ⅰ和Ⅱ組的小麥、青稞和油菜黃貯的pH均顯著高于對照組(P<0.05)。Ⅰ和Ⅱ組的小麥和青稞黃貯的乳酸、乙酸和丙酸含量顯著高于對照組(P<0.05)，各組之間油菜黃貯的乳酸、乙酸和丙酸含量差異不顯著(P>0.05)。Ⅰ和Ⅱ組的小麥和青稞黃貯的NDF和ADF含量顯著低于對照組(P<0.05)。Ⅱ組的小麥、青稞和油菜黃貯的粗蛋白質含量顯著高于對照組(P<0.05)。Ⅰ和Ⅱ組的小麥黃貯的粗脂肪含量顯著高于對照組(P<0.05)。

表2 不同濃度纖維素酶菌劑處理對青稞黃貯化學成分的影響Table 2 Effects of different concentrations of cellulase agent treatment on chemical components of highland barley yellow storage

表3 不同濃度纖維素酶菌劑處理對油菜黃貯化學成分的影響Table 3 Effects of different concentrations of cellulase agent treatment on chemical components of rape yellow storage

2.2 不同濃度纖維素酶菌劑處理對小麥、青稞和油菜黃貯體外營養(yǎng)成分降解率的影響

由表4可知，Ⅰ和Ⅱ組的小麥和青稞黃貯的DMD顯著高于對照組(P<0.05)，各組之間油菜黃貯的DMD差異不顯著(P>0.05)。Ⅰ和Ⅱ組的小麥黃貯的NDFD顯著高于對照組(P<0.05)，Ⅰ組的青稞黃貯的NDFD顯著高于對照組和Ⅱ組(P<0.05)，各組之間油菜黃貯的NDFD差異不顯著(P>0.05)。

表4 不同濃度纖維素酶菌劑處理對小麥、青稞和油菜黃貯體外營養(yǎng)成分降解率的影響Table 4 Effects of different concentrations of cellulase agent treatment on nutrient degradation rates in vitro of wheat, highland barley and rape yellow storages %

2.3 不同濃度纖維素酶菌劑處理對小麥、青稞和油菜黃貯體外發(fā)酵參數(shù)的影響

由表5可知，Ⅰ和Ⅱ組的小麥黃貯的pH顯著低于對照組(P<0.05)，Ⅰ和Ⅱ組的青稞黃貯的pH有降低的趨勢(0.050.05)。Ⅰ和Ⅱ組的油菜黃貯的NH3-N含量顯著高于對照組(P<0.05)，各組之間小麥和青稞黃貯的NH3-N含量差異不顯著(P>0.05)。各組之間小麥、青稞和油菜黃貯的MCP含量均無顯著差異(P>0.05)。Ⅰ和Ⅱ組的小麥和青稞黃貯的TVFA含量顯著高于對照組(P<0.05)。Ⅱ組的小麥黃貯的丁酸含量顯著低于對照組和Ⅰ組(P<0.05)，對照組的青稞黃貯的丁酸含量顯著高于Ⅰ和Ⅱ組(P<0.05)；Ⅰ組的小麥黃貯的戊酸和異戊酸含量顯著低于對照組和Ⅱ組(P<0.05)；Ⅰ和Ⅱ組的油菜黃貯的乙酸/丙酸有增加趨勢(0.05

表5 不同濃度纖維素酶菌劑處理對小麥、青稞和油菜黃貯體外發(fā)酵參數(shù)的影響Table 5 Effects of different concentrations of cellulase agent treatment on in vitro fermentation parameters of wheat, highland barley and rape yellow storages

2.4 不同濃度纖維素酶菌劑處理對小麥、青稞和油菜黃貯體外發(fā)酵產(chǎn)氣特性的影響

由表6可知，Ⅰ和Ⅱ組的小麥和青稞黃貯的48 h總產(chǎn)氣量顯著高于對照組(P<0.05)，各組之間油菜秸稈的48 h總產(chǎn)氣量差異不顯著(P>0.05)。

表6 不同濃度纖維素酶菌劑處理對小麥、青稞和油菜黃貯體外發(fā)酵產(chǎn)氣特性的影響Table 6 Effects of different concentrations of cellulase agent treatment on in vitro fermentation gas production characteristics of wheat, highland barley and rape yellow storages

3 討 論

本研究結果表明，小麥、青稞和油菜黃貯添加纖維素分解菌提高了乳酸、乙酸含量及黃貯感官評分，降低了NDF和ADF含量，增加了粗蛋白質含量，提高了黃貯秸稈的營養(yǎng)價值和利用率。纖維素分解菌能快速水解細胞壁結構多糖，使之產(chǎn)生足量的葡萄糖，為乳酸菌的繁殖生長提供碳源，從而增加乳酸和VFA含量，降低纖維含量。小麥、青稞和油菜秸稈經(jīng)黃貯及纖維素分解菌處理后，以小麥黃貯營養(yǎng)價值較高，其可能的原因是因為小麥秸稈中粗蛋白質含量高，粗纖維含量低，黃貯效果較好。孫娟娟等[21]和馬廣英等[22]研究發(fā)現(xiàn)，添加纖維素酶后，小麥和油菜黃貯的感官綜合評定分值顯著提高，NDF和ADF含量顯著降低，粗蛋白質含量顯著提高，這與本試驗研究結果一致。

一般認為瘤胃內產(chǎn)氣量的多少與飼糧的消化率呈正相關，產(chǎn)氣越多，發(fā)酵效果越好。產(chǎn)氣量是由于干物質的降解而產(chǎn)生的，一般生產(chǎn)中可以利用DMD來簡單地評定瘤胃的發(fā)酵效果。DMD越高，飼料中的營養(yǎng)物質的利用就越多，說明瘤胃的內環(huán)境越有利于瘤胃微生物的發(fā)酵[23]。本試驗發(fā)現(xiàn)，小麥和青稞黃貯添加纖維素分解菌提高了瘤胃產(chǎn)氣量，增加了DMD和NDFD。杜江華等[24]和李昊[25]的研究同樣發(fā)現(xiàn)，秸稈中添加纖維素分解菌，瘤胃產(chǎn)氣量顯著提高。

瘤胃pH是衡量瘤胃微生物發(fā)酵狀況的重要指標，可綜合反映微生物發(fā)酵活動及有機酸的代謝情況[26]。瘤胃pH的正常范圍一般在5.5～7.5。有研究表明，當瘤胃pH低于6.2時，纖維分解菌的生長將會受到抑制[27]。本試驗瘤胃pH維持在6.21～6.56，屬于正常范圍，說明添加纖維素分解菌沒有對人工瘤胃酸堿內環(huán)境造成不良影響。小麥黃貯添加纖維素分解菌組瘤胃pH顯著低于對照組，青稞黃貯添加纖維素分解菌組瘤胃pH也有降低的趨勢。其原因可能是由于試驗組添加了纖維素分解菌液，發(fā)酵較快，因此很快產(chǎn)出酸性物質，pH下降明顯，這與杜江華等[24]的研究結果一致，說明添加活菌制劑可以加快瘤胃內微生物的發(fā)酵。NH3-N的形成主要是由于瘤胃微生物對飼糧中的含氮化合物的分解，而瘤胃中的NH3-N含量主要取決于2個因素，一個是飼糧中氮的降解速率，另一個是微生物對于氨的利用[28]。本試驗中，油菜黃貯添加纖維素分解菌組的NH3-N含量較高，說明添加活菌制劑能夠提高瘤胃NH3-N含量，這與孫滿吉等[29]和杜江華[26]研究結果一致。這是由于添加活菌制劑后能夠增加瘤胃中微生物的活性與數(shù)量，從而導致瘤胃中含氮化合物的降解增加，進而提高瘤胃NH3-N含量。

添加纖維素分解菌能夠使瘤胃中的VFA含量增加[30]。本試驗結果表明，與對照組相比，Ⅰ和Ⅱ組的小麥和青稞黃貯的TVFA含量顯著提高；Ⅱ組的小麥黃貯的丁酸含量顯著降低，青稞黃貯的丁酸含量顯著降低；Ⅰ組的小麥黃貯的戊酸和異戊酸含量顯著降低。黃立敏[31]在奶牛體外發(fā)酵飼糧中添加纖維素分解菌顯著提高了乙酸、丙酸和TVFA含量。杜江華等[24]在體外發(fā)酵飼糧中添加纖維素分解菌和固氮菌混合液顯著提高了乙酸、丙酸和TVFA含量。孫滿吉等[29]研究發(fā)現(xiàn)，添加纖維素分解菌，瘤胃液中TVFA、乙酸含量顯著提高，而對丙酸、丁酸含量和乙酸/丙酸無顯著影響，這與本試驗結果部分存在差異，原因可能是由于發(fā)酵底物的不同及菌液添加濃度的差別造成的，且本試驗采用的是體外發(fā)酵的方法。當乙酸/丙酸小于3屬于丙酸型發(fā)酵，而乙酸/丙酸大于3為乙酸型發(fā)酵。本試驗中各組乙酸/丙酸都小于3，說明該發(fā)酵類型屬于丙酸型發(fā)酵。

本試驗中的各組甲烷產(chǎn)量均無顯著差異。杜江華等[24]研究發(fā)現(xiàn)，4×1011CFU/L菌液混合組甲烷產(chǎn)量明顯高于對照組。喬國華等[32]直接將纖維素分解菌飼喂奶牛，發(fā)現(xiàn)微生物培養(yǎng)物可以提高甲烷產(chǎn)量。甲烷產(chǎn)量提高的原因在于飼糧中添加活菌制劑后，發(fā)酵加快，導致產(chǎn)生的甲烷不能被利用。本試驗中，各組之間甲烷產(chǎn)量無顯著差異的原因可能是由于菌液添加濃度較低造成的。

4 結 論

① 添加纖維素分解菌N30可增加小麥、青稞和油菜黃貯的DMD、NDFD和產(chǎn)氣量，促進飼料的消化降解，增加TVFA含量，丁酸和戊酸含量有不同程度地下降。

② 添加纖維分解菌N30對小麥、青稞和油菜黃貯體外發(fā)酵有明顯促進作用，且添加濃度以2×1010CFU/kg為宜。