簡 麗 鄒田德 李建軍 諶 俊 賀 琴 何 嘉 夏瑩瑩 謝 飛 王自蕊 游金明*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西省動物營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省營養(yǎng)飼料開發(fā)工程研究中心，江西省優(yōu)質(zhì)安全畜禽生產(chǎn)產(chǎn)教融合重點(diǎn)創(chuàng)新中心，南昌 330045；2.江西省贛州市畜牧研究所，贛州 341000)

肝臟是仔豬最重要的代謝器官之一，是其糖脂代謝的中心場所，對新生仔豬糖脂代謝和線粒體功能有重要作用。子代機(jī)體代謝狀況極易受母體妊娠期膳食的影響。據(jù)報(bào)道，母豬妊娠飼糧中添加150 g/t核苷酸顯著上調(diào)新生仔豬肝臟脂肪酸去飽和酶1(FADS1)、激素敏感脂肪酶(HSL)等與能量相關(guān)基因的mRNA的表達(dá)量，提高新生仔豬血清總膽固醇(TC)和低密度脂蛋白含量，提高新生仔豬成活率[1]。Xie等[2]研究發(fā)現(xiàn)，母豬妊娠飼糧中添加30 mg/kg殼寡糖顯著上調(diào)其后代斷奶仔豬肝臟磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)-C、PEPCK-M和葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC)mRNA表達(dá)量，促進(jìn)后代仔豬肝臟糖異生，從而提高哺乳仔豬生長速度。這表明母豬妊娠期營養(yǎng)狀況在后代生長和發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用。近年來有關(guān)母豬飼糧中添加甲基供體對后代影響的研究成為熱點(diǎn)[3]。研究發(fā)現(xiàn)，母豬妊娠飼糧中添加甲基供體可提高新生仔豬初生重和生長速度[4]，甚至后代豬上市時(shí)的肉品質(zhì)[5]。牟道臨[6]發(fā)現(xiàn)，母豬妊娠飼糧中添加甲基供體可降低仔豬肝臟丙二醛(MDA)含量。甲基供體還可以調(diào)節(jié)線粒體代謝。Liu等[7]研究表明，母豬妊娠飼糧中添加甲基供體顯著提高斷奶仔豬肝臟線粒體DNA(mtDNA)含量，改善線粒體功能。王譽(yù)博等[8]報(bào)道，葉酸可以修復(fù)線粒體損傷，影響mtDNA的穩(wěn)定性，在細(xì)胞存活中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果表明，母豬妊娠飼糧中添加甲基供體顯著提高仔豬斷奶時(shí)的窩重和1～24日平均日增重，促進(jìn)新生仔豬肌肉發(fā)育[9]。目前有關(guān)母豬妊娠飼糧中添加甲基供體對新生仔豬肝臟糖脂代謝和線粒體功能的影響尚未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)旨在研究母豬妊娠飼糧中添加甲基供體對新生仔豬肝臟糖脂代謝和線粒體功能的影響，以期為改善新生仔豬能量代謝和仔豬活力提供理論依據(jù)和實(shí)踐參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

甲基供體包括葉酸(西格瑪-奧爾德里奇，美國，純度≥97%)、L-蛋氨酸(希杰集團(tuán)，馬來西亞，純度≥99%)、維生素B12(西格瑪-奧爾德里奇，美國，純度≥98%)、維生素B6(江西天新藥業(yè)，純度≥98%)和膽堿(恩貝集團(tuán)有限公司，氯化膽堿，純度=60%)。

1.2 試驗(yàn)動物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選取54頭平均體重為(102.8±6.3) kg的“杜洛克×二花臉”初胎母豬，用杜洛克純種公豬精液人工授精后均分為2組，分別飼喂基礎(chǔ)飼糧(對照組)和添加甲基供體的基礎(chǔ)飼糧(甲基供體組)。配種30 d后超聲檢查確定是否妊娠，11頭母豬因妊娠失敗被淘汰，最終對照組妊娠母豬數(shù)為21頭，甲基供體組妊娠母豬數(shù)為22頭。甲基供體組飼糧中甲基供體添加量參照文獻(xiàn)[10-11]設(shè)定，具體添加量如下：4 700 mg/kgL-蛋氨酸、16.3 mg/kg葉酸、2 230 mg/kg膽堿、1 180 mg/kg維生素B6和0.15 mg/kg維生素B12。試驗(yàn)從母豬人工授精后開始至分娩結(jié)束，妊娠期母豬單欄飼養(yǎng)，自由飲水，每天飼喂2次(08:00和14:00)，妊娠第1～80天飼喂量為2.28 kg/d，第81～90天飼喂量為2.4 kg/d，第90天至分娩飼喂量為3.0 kg/d。妊娠第110天轉(zhuǎn)至分娩舍。母豬妊娠期基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平參考文獻(xiàn)[9]。

1.3 樣品采集

母豬分娩結(jié)束后，對新生仔豬進(jìn)行稱重。每組選取8窩，每窩選取1頭體重接近窩平均體重的仔豬(每組共選取8頭仔豬)屠宰，測定新生仔豬內(nèi)臟器官重量，并采集肝臟，分裝于凍存管后液氮凍存，待樣品采集結(jié)束后，將樣品轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存待測肝臟糖脂代謝和線粒體功能指標(biāo)。

1.4 指標(biāo)測定

1.4.1 肝臟糖脂代謝和能量代謝指標(biāo)

采用試劑盒法測定肝臟中糖原(Gly)、甘油三酯(TG)、TC、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、蛋白質(zhì)含量及PEPCK、琥珀酸脫氫酶(SDH)活性，所用試劑盒購自南京建成生物工程研究所，其中PEPCK、SDH活性采用分光光度計(jì)(UV-5100，上海精密儀表有限公司)測定，其他指標(biāo)均采用全自動多功能酶標(biāo)儀(SpectraMax-190，Molecular Devices，美國)測定。

肝臟中三磷酸腺苷(ATP)、氧化型輔酶Ⅰ(NAD+)、還原型輔酶Ⅰ(NADH)含量按照相應(yīng)試劑盒(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)使用說明書測定，肝臟檸檬酸合酶(CS)和G6PC活性使用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)測定。

1.4.2 肝臟mtDNA含量

使用DNA提取試劑盒(D111-01，北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司)提取肝臟總DNA。通過測定線粒體編碼基因線粒體色素b(Cytb)與細(xì)胞核編碼基因18S rRNA比值計(jì)算mtDNA含量。

1.4.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

利用Primer 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，由華大集團(tuán)合成，引物序列見表1。采用試劑盒(ER501，北京全式金生物技術(shù)有限公司)提取肝臟總RNA。樣品RNA完整性、質(zhì)量和純度用1%瓊脂糖凝膠電泳和核酸/蛋白質(zhì)自動分析儀檢測。使用RT Master Mix試劑盒(AE311，北京全式金生物技術(shù)有限公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。參考SYBR Green Master Mix試劑盒(AQ141，北京全式金生物技術(shù)有限公司)使用說明書在熒光定量PCR儀(CFX ConnectTMOptics Module，Bio-Rad，美國)上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。試驗(yàn)采用20 μL的反應(yīng)體系，每次反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行3次。反應(yīng)程序參考Livak等[12]，以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為參比基因，使用2-ΔΔCt計(jì)算目的基因的mRNA相對表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for quantitative real-time PCR

續(xù)表1基因Genes登錄號Accession number引物序列Primer sequences (5'—3')產(chǎn)物長度 Product length/bp乙酰輔酶A羧化酶 ACCXM_021066238.1F:ATGAAGGCTGTGGTGATGGAR:CTTGGTGACTTGAGCGTGAG162硬脂酰輔酶A去飽和酶 SCDNM_213781.1F:TAAACAGTGCTGCCCACCTAR:AGGGAAAGGTGTGGTGGTAG126過氧化物酶體增殖物激活受體γ PPARγNM_214379.1F:TGGCCATTCGCATCTTTCAGR:ATCTCGTGGACGCCATACTT145 過氧化物酶體增殖物激活受體α PPARαNM_001044526.1F:GAGCCTGAGGAAACCCTTCTR:GCACCAAATGATAGCAGCCA127脂蛋白脂酶LPLNM_214286.1F:AGGACACTTGCCATCTCATTR:GGGACCCAACTTTCATACAT121 脂肪酸結(jié)合蛋白 FABPNM_001004046.2F:AATCGTGCAGAATGGGAAGCR:CCAGTCAGGGTCTCCATCTC108微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)移蛋白 MTPNM_214185.1F:CCAAGACAGAGGCTGTCAGAR:GACAGCATCCACAAGCTGAG128過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子-1α PGC-1αNM_213963F:CCCGAAACAGTAGCAGAGACAAGR:CTGGGGTCAGAGGAAGAGATAAAG111沉默調(diào)節(jié)蛋白1 SIRT1EU030283.2F:TGACTGTGAAGCTGTACGAGGAGR:TGGCTCTATGAAACTGCTCTGG143細(xì)胞核呼吸因子-1 NRF-1AK237171.1F:GCCAGTGAGATGAAGAGAAACGR:CTACAGCAGGGACCAAAGTTCAC166線粒體轉(zhuǎn)錄因子A TfamNM_001130211F:GGTCCATCACAGGTAAAGCTGAAR:ATAAGATCGTTTCGCCCAACTTC167F1ATP合成酶β亞基β-F1-ATPaeNM_001185142F:CATGAAGCAGGTGGCAGGTAR:CAGACGAACACCACGACTCA127細(xì)胞色素c氧化酶亞基ⅣCOX4XM_021093706.1F:CCAAGTGGGACTACGACAAGAACR:CAGACGAACACCACGACTCA131線粒體色素c Cyt cNM_001129970.1F:TAGAAAAGGGAGGCAAACACAAGR:GGATTCTCCAGGTACTCCATCAG154檸檬酸合酶CSNM_214276.1F:CCTTTCAGACCCCTACTTGTCCTR:CACATCTTTGCCGACTTCCTTC127線粒體色素b Cyt bNC_000845.1F:ATGAAACATTGGAGTAGTCCTACTATTTACCR:CTACGAGGTCTGTTCCGATATAAGG14918S rRNANC_010448.3F:GGTAGTGACGAAAAATAACAATACAGGACR:ATACGCTATTGGAGCTGGAATTACC141

1.4.4 Western blot

根據(jù)蛋白提取試劑盒(BC3710，北京索萊寶科技有限公司)說明書提取肝臟組織中的總蛋白質(zhì)。用BCA蛋白檢測試劑盒(DQ111-01，北京全式金生物技術(shù)有限公司)測定樣品蛋白質(zhì)濃度。配制分離膠濃度為10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠(AR0138，武漢博士德生物工程有限)，通過SDS-PAGE對目的蛋白進(jìn)行分離，然后將蛋白質(zhì)印跡轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。使用5%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h，4 ℃將一抗(PEPCK1，1∶1 000，16754-1-AP，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；G6PC抗體，1∶1 000，ab83690，Abcam，美國)孵育過夜；第2天用TBST洗膜3次，每次5 min，然后用羊抗兔抗體(SA00001-2，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)室溫孵育2 h后，采用特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(DW101-01，北京全式金生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光1 min后，將膜轉(zhuǎn)至在凝膠成像照相儀上成像，曝光拍照，用Image J進(jìn)行灰度值分析目的蛋白相對表達(dá)量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，0.05≤P<0.10為有升高或降低趨勢判斷標(biāo)準(zhǔn)。所有數(shù)據(jù)均以“平均值+標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 新生仔豬內(nèi)臟器官重量

由表2可知，與對照組相比，母豬妊娠飼糧中添加甲基供體后對新生仔豬個(gè)體重、肺臟和腎臟重量無顯著影響(P>0.05)，但顯著提高了新生仔豬脾臟重量(P<0.05)，且有提高新生仔豬肝臟、心臟和腎上腺重量的趨勢(0.05≤P<0.10)。

表2 母豬妊娠飼糧中添加甲基供體對新生仔豬內(nèi)臟器官重量的影響Table 2 Effects of methyl-donor supplementation in diets for pregnant sows on visceral organweight of newborn piglets (n=8)

2.2 新生仔豬肝臟糖脂代謝指標(biāo)

由表3可知，與對照組相比，母豬妊娠飼糧中添加甲基供體顯著提高了新生仔豬肝臟中Gly含量以及PEPCK和G6PC活性(P<0.05)，而顯著降低了新生仔豬肝臟中TG和TC含量(P<0.05)。

表3 母豬妊娠飼糧中添加甲基供體對新生仔豬肝臟糖脂代謝指標(biāo)的影響Table 3 Effects of methyl-donor supplementation in diets for pregnant sows on hepatic glycolipid metabolism indices of newborn piglets (n=8)

2.3 新生仔豬肝臟能量代謝指標(biāo)

由表4可知，與對照組相比，母豬妊娠飼糧中添加甲基供體顯著提高了新生仔豬肝臟中NAD+含量、NAD+/NADH的比值以及CS和SDH活性(P<0.05)。

表4 母豬妊娠飼糧中添加甲基供體對新生仔豬肝臟能量代謝指標(biāo)的影響Table 4 Effects of methyl-donor supplementation in diets for pregnant sows on hepatic energy metabolism indices of newborn piglets (n=8)

2.4 新生仔豬肝臟糖異生相關(guān)基因mRNA和蛋白相對表達(dá)量

如圖1所示，與對照組相比，母豬妊娠飼糧中添加甲基供體顯著上調(diào)了新生仔豬肝臟丙酮酸羧化酶(PC)、PEPCK1、PEPCK2、果糖二磷酸酶1(FBP1)和G6PCmRNA相對表達(dá)量(P<0.05)，且顯著上調(diào)了新生仔豬肝臟PEPCK1和G6PC蛋白相對表達(dá)量(P<0.05)。

2.5 新生仔豬肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量

如圖2所示，與對照組相比，母豬妊娠飼糧中添加甲基供體顯著下調(diào)新生仔豬肝臟脂肪酸合成相關(guān)基因[CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α(C/EBPα)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1C(SREBP-1C)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD)和過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)]mRNA相對表達(dá)量(P<0.05)，而顯著上調(diào)了新生仔豬肝臟脂質(zhì)氧化相關(guān)基因[過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)、脂蛋白脂酶(LPL)和脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)]mRNA相對表達(dá)量(P<0.05)。

*表示甲基供體組與對照組之間存在顯著差異(P<0.05)。下圖同。

圖2 母豬妊娠飼糧中添加甲基供體對新生仔豬肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量的影響Fig.2 Effects of methyl-donor supplementation in diets for pregnant sows on mRNA relative expression levels of hepatic genes related to lipid metabolism of newborn piglets (n=8)

2.6 新生仔豬肝臟線粒體功能相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量

如圖3所示，與對照組相比，母豬妊娠飼糧中添加甲基供體顯著上調(diào)了新生仔豬肝臟過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子-1α(PGC-1α)、沉默調(diào)節(jié)蛋白1(SIRT1)、細(xì)胞核呼吸因子-1(NRF-1)和線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(Tfam)mRNA相對表達(dá)量(P<0.05)，同時(shí)還顯著上調(diào)了新生仔豬肝臟細(xì)胞色素c氧化酶亞基Ⅳ(COX4)、Cytc和CSmRNA相對表達(dá)量(P<0.05)，并顯著提高了新生仔豬肝臟mtDNA含量(P<0.05)。

圖3 母豬妊娠飼糧中添加甲基供體對新生仔豬肝臟線粒體功能相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量的影響Fig.3 Effects of methyl-donor supplementation in diets for pregnant sows on mRNA relative expression levels of hepatic genes related to mitochondrial function of newborn piglets (n=8)

3 討 論

發(fā)育中的胎兒極易受母體營養(yǎng)的影響。研究表明，給母體補(bǔ)充甲基供體可調(diào)節(jié)后代的生長發(fā)育和健康狀態(tài)[13]。Fekete等[14]研究發(fā)現(xiàn)，給妊娠母體補(bǔ)充甲基供體(葉酸)可提高新生兒體重。而Liu等[7]報(bào)道，給母體補(bǔ)充葉酸并不影響宮內(nèi)發(fā)育遲緩(IUGR)仔豬的體重。在本研究中，所配制基礎(chǔ)飼糧營養(yǎng)水平滿足或超過NRC(2012)推薦的妊娠母豬營養(yǎng)需要量，以探究在滿足母豬營養(yǎng)需要量的基礎(chǔ)上額外添加甲基供體是否會對后代新生仔豬產(chǎn)生影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，母豬妊娠飼糧中添加甲基供體并不影響新生仔豬個(gè)體重和肝臟重量。

糖異生是專用于從非己糖前體合成葡萄糖的代謝途徑，在禁食或應(yīng)激狀態(tài)下可維持機(jī)體葡萄糖穩(wěn)態(tài)[15]。新生仔豬可通過糖異生來抵抗分娩壓力，因此，糖異生對新生仔豬的存活具有重要意義[16-17]。肝臟糖異生的關(guān)鍵限速酶是PEPCK、G6PC、PC和FBP1。在本研究中，母豬妊娠飼糧中添加甲基供體可顯著提高新生仔豬肝臟中Gly含量以及PEPCK和G6PC活性。肝臟中Gly含量升高表明肝臟糖異生途徑可能被激活，這與其他學(xué)者研究結(jié)果[18-19]一致。母豬妊娠飼糧中添加甲基供體還顯著上調(diào)了新生仔豬肝臟PEPCK和G6PCmRNA和蛋白相對表達(dá)量，與肝臟PEPCK和G6PC活性結(jié)果相對應(yīng)。由此可知，母體妊娠飼糧中添加甲基供體可促進(jìn)新生仔豬肝臟糖異生。

新生仔豬依靠體內(nèi)的能量儲備來維持生命活動，肝臟作為能量供應(yīng)的重要器官，在脂質(zhì)代謝和線粒體功能中起著重要作用。在本研究中，母豬妊娠飼糧中添加甲基供體顯著降低了新生仔豬肝臟中TG和TC含量，表明甲基供體對機(jī)體健康有積極作用，這一結(jié)果與他人研究結(jié)果[20-21]一致。在本試驗(yàn)中，母豬妊娠飼糧中添加甲基供體顯著降低了肝臟中TG含量，并顯著下調(diào)了肝臟SREBP-1C和SCDmRNA相對表達(dá)量，這表明在母豬妊娠飼糧中添加甲基供體可通過降低新生仔豬肝臟脂肪酸合成，從而減少其肝臟中脂質(zhì)的積累。PPARγ在脂肪生成中有著重要的作用[22]。本研究結(jié)果顯示，母豬妊娠飼糧中添加甲基供體顯著降低了新生仔豬肝臟PPARγmRNA相對表達(dá)量。由此可知，母豬妊娠飼糧中添加甲基供體促進(jìn)了新生仔豬肝臟脂質(zhì)代謝。

線粒體是細(xì)胞能量代謝的主要部位，其在脂肪氧化中起著關(guān)鍵作用。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，母豬妊娠飼糧中添加甲基供體顯著提高了新生仔豬肝臟ATP和mtDNA含量，提高了新生仔豬肝臟能量的儲備。這一發(fā)現(xiàn)與他人研究結(jié)果[23]一致。CS是三羧酸循環(huán)中的限速酶，可調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝[24]。SDH是三羧酸循環(huán)中唯一的一個(gè)結(jié)合于線粒體內(nèi)膜的多亞基酶，可為細(xì)胞線粒體需氧和產(chǎn)能的呼吸鏈提供電子，是線粒體的標(biāo)志酶[25]。在本試驗(yàn)中，母豬妊娠飼糧中添加甲基供體顯著提高了新生仔豬肝臟中CS和SDH活性。線粒體生物發(fā)生和能量消耗主要受PGC-1α調(diào)節(jié)。有研究表明，葉酸可上調(diào)PGC-1αmRNA表達(dá)，緩解自由基導(dǎo)致的線粒體失活和破裂[26]。本研究結(jié)果顯示，母豬妊娠飼糧中添加甲基供體顯著上調(diào)了新生仔豬肝臟PGC-1αmRNA相對表達(dá)量，同時(shí)顯著上調(diào)了其下游靶基因NRF-1和TfammRNA相對表達(dá)量。SIRT1活性受NAD+/NADH的比值調(diào)節(jié)[27]。在本試驗(yàn)中，母豬妊娠飼糧中添加甲基供體顯著提高了新生仔豬肝臟NAD+/NADH的比值，這可能與線粒體呼吸效率上升有關(guān)。甲基供體可刺激仔豬肝臟中SIRT1表達(dá)，提高NADH的氧化分解，促進(jìn)肝臟中NAD+含量及NAD+/NADH的比值升高。由此可知，母豬妊娠飼糧中添加甲基供體促進(jìn)了新生仔豬線粒體生物合成。

4 結(jié) 論

母豬妊娠飼糧中添加甲基供體可抑制新生仔豬肝臟脂質(zhì)累積，促進(jìn)新生仔豬糖異生，改善新生仔豬肝臟糖脂代謝和線粒體功能。