曾 斌 高 騫 沈維軍 萬(wàn)發(fā)春

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128)

牛肉肉質(zhì)鮮美、富含必需氨基酸和微量元素，是我國(guó)居民的主要肉類來(lái)源之一。根據(jù)《2020年度肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)發(fā)展報(bào)告》，我國(guó)在2020年牛肉產(chǎn)量為678萬(wàn)t，居世界第3位。我國(guó)也是全球牛肉進(jìn)口最多的國(guó)家，全年牛肉進(jìn)口量為275萬(wàn)t，存在巨大的牛肉缺口，優(yōu)質(zhì)牛肉更是供不應(yīng)求。牛肉高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)是當(dāng)前肉牛營(yíng)養(yǎng)調(diào)控和分子育種研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)，其主要涉及肉牛的肌肉發(fā)育和脂肪在不同部位的沉積。隨著全轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的成熟和廣泛應(yīng)用，非編碼RNAs(non-coding RNAs，ncRNAs)相關(guān)研究在畜牧生產(chǎn)領(lǐng)域得到迅速發(fā)展，越來(lái)越多的ncRNAs被鑒定為動(dòng)物肌肉發(fā)育和脂肪形成的關(guān)鍵調(diào)控因子。肉牛增量提質(zhì)需要盡可能增加瘦肉(肌肉)組織以及肌內(nèi)脂肪(大理石花紋)含量，同時(shí)減少價(jià)值較低的腹腔脂肪和皮下脂肪含量。因此，這篇綜述就ncRNAs對(duì)肉牛肌肉發(fā)育和脂肪形成的調(diào)節(jié)作用進(jìn)行了歸納總結(jié)，以期為肉牛高效養(yǎng)殖提供理論參考。

1 肉牛肌肉發(fā)育和脂肪沉積概述

肌肉發(fā)育和脂肪沉積對(duì)肉牛的生產(chǎn)和提質(zhì)都至關(guān)重要。肉牛肌肉細(xì)胞、脂肪細(xì)胞在胚胎發(fā)育過(guò)程中都來(lái)自一個(gè)共同的祖細(xì)胞庫(kù)[1]。骨骼肌作為肉牛軀體最主要的組成部分，與產(chǎn)肉力等經(jīng)濟(jì)性狀直接相關(guān)。骨骼肌的發(fā)育可大致分為胚胎期、胎兒期和出生后期[2]。在胚胎期和胎兒期，骨骼肌發(fā)育主要包括肌肉纖維細(xì)胞的形成和肌肉纖維的進(jìn)一步增加，即肌細(xì)胞的形成和增殖[3]。肉牛肌纖維細(xì)胞是在出生前形成的，出生后不再有凈增加。出生后肌肉的生長(zhǎng)主要通過(guò)肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和分化使肌纖維體積增大[4]，即肌管和肌纖維的形成，這也表明肌衛(wèi)星細(xì)胞在動(dòng)物出生后肌肉生長(zhǎng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

肉牛的脂肪沉積是一個(gè)復(fù)雜的生理生化過(guò)程，主要依賴于脂肪前體細(xì)胞的增殖、分化和成熟。哺乳動(dòng)物脂肪細(xì)胞主要在胎兒和出生后早期形成[3,5]，脂肪細(xì)胞的總數(shù)是在成年期前就達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)[6]。成年后則主要表現(xiàn)為體積的增加和脂滴的聚集(分化和成熟)[7]。隨著動(dòng)物年齡的增長(zhǎng)，祖細(xì)胞逐漸減少是產(chǎn)生新脂肪細(xì)胞能力下降的主要原因[8]。肉牛脂肪主要存在于皮下、腹腔內(nèi)臟周邊和肌內(nèi)。其中肌內(nèi)脂肪的沉積和分布(即大理石花紋等級(jí))是評(píng)價(jià)牛肉品質(zhì)的主要依據(jù)。動(dòng)物不同組織部位的脂肪沉積呈現(xiàn)出明顯的時(shí)序性和組織特異性，肌內(nèi)脂肪的沉積次序要滯后于腹腔脂肪和皮下脂肪，沉積難度更大[9]。因此，控制脂肪更多的在肌內(nèi)沉積而不是在其他部位組織沉積一直是肉牛脂肪沉積研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。有證據(jù)表明，肌內(nèi)脂肪細(xì)胞與皮下、內(nèi)臟脂肪細(xì)胞存在差異[10-11]，在胎兒肌肉發(fā)育過(guò)程中，肌內(nèi)脂肪細(xì)胞與肌源性細(xì)胞具有更加接近的祖細(xì)胞。肌內(nèi)脂肪細(xì)胞這種獨(dú)特的發(fā)育起源特性提供了在不提高動(dòng)物整體肥胖的情況下特異性增強(qiáng)牛肉大理石花紋的靶點(diǎn)[1]。

2 ncRNAs及其作用機(jī)制

ncRNAs作為一類表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)因子，在復(fù)雜的生命活動(dòng)中參與了眾多基因的表達(dá)調(diào)控。目前，在關(guān)于動(dòng)物生長(zhǎng)、發(fā)育、免疫等生理功能的ncRNAs研究中，微小RNA(microRNA，miRNA)、長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-codingRNA，lncRNA)和環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)這3種ncRNAs的研究最為多見。miRNAs是長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸的ncRNA，其作用方式通常是通過(guò)與靶基因的3′非編碼區(qū)(3′-UTR)結(jié)合，抑制蛋白翻譯或降解mRNA來(lái)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。因?yàn)閙iRNA在物種間保守性強(qiáng)、命名規(guī)范、研究方法成熟和數(shù)據(jù)庫(kù)完整，是研究最為深入的一種ncRNA。lncRNA的長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸，幾乎沒(méi)有蛋白質(zhì)編碼能力[12]。根據(jù)現(xiàn)有的研究，lncRNA的作用機(jī)制分為以下類型：1)作為miRNA海綿；2)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后干擾；3)誘導(dǎo)染色質(zhì)重塑和組蛋白修飾；4)結(jié)合特定的蛋白質(zhì)，調(diào)節(jié)其活性或改變其定位[13]。其中，lncRNA作為miRNA的海綿參與競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)，主要是通過(guò)降低miRNA活性，導(dǎo)致miRNA的靶基因表達(dá)升高，這也是目前l(fā)ncRNA最為詳細(xì)的作用機(jī)制研究。circRNA是一種具有共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu)的ncRNA，已成為RNA領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。與線性的RNA相比，circRNA不具備5′末端帽子結(jié)構(gòu)和3′末端poly(A)尾巴結(jié)構(gòu)[14]。目前的研究表明，circRNA產(chǎn)生機(jī)制主要包括直接轉(zhuǎn)錄組反向剪切、外顯子跳躍、內(nèi)含子的反義互補(bǔ)序列配對(duì)模式以及依賴于RNA結(jié)合蛋白的環(huán)化模式等[15-16]。目前研究發(fā)現(xiàn)，circRNA的作用機(jī)制主要包括直接調(diào)節(jié)親本基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯、競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA分子，也有研究表明circRNA還具有編碼小肽和蛋白質(zhì)的能力[17]。在生物學(xué)功能上，與lncRNA類似，circRNA作為miRNA海綿分子，參與ceRNA網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的報(bào)道最為多見。目前，ncRNAs研究的主要方法是首先通過(guò)高通量測(cè)序或芯片技術(shù)找出差異表達(dá)、高表達(dá)的ncRNA，PCR或者實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)驗(yàn)證ncRNA表達(dá)水平；然后通過(guò)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)靶基因和參與調(diào)控的信號(hào)通路；最后通過(guò)對(duì)ncRNA敲減、過(guò)表達(dá)研究ncRNA的功能，采用RNA pull-down、免疫共沉淀等技術(shù)確定ncRNA與蛋白質(zhì)的互作，采用雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證miRNA和mRNA/lncRNA/circRNA的互作情況。

3 ncRNAs與肉牛肌肉發(fā)育

3.1 miRNA與肉牛肌肉發(fā)育

在肉牛肌肉發(fā)育的研究中，miRNAs已被廣泛報(bào)道為骨骼肌性狀的重要調(diào)控因子。高通量測(cè)序技術(shù)作為快速篩選差異miRNA的方法，在肉牛肌纖維細(xì)胞的增殖和分化的研究中廣泛應(yīng)用。Zhang等[18]和Wang等[19]對(duì)牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化前后的miRNA進(jìn)行測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)了多個(gè)差異的miRNA，功能富集表明這些差異的miRNA主要在細(xì)胞代謝、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路上富集。Sun等[20]通過(guò)對(duì)秦川牛胎兒期和成年期的背最長(zhǎng)肌的miRNA進(jìn)行高通量測(cè)序分析，共鑒定出521個(gè)miRNA。經(jīng)過(guò)qRT-PCR檢測(cè)到25個(gè)高表達(dá)的miRNAs，其中miR-206、miR-1、miR-133等5個(gè)miRNA在肌肉組織特異性高表達(dá)miRNA，提示這些miRNA可能在牛肌肉組織的發(fā)育中發(fā)揮作用。隨后有研究報(bào)道了miR-1和miR-206具有相似的種子序列，它們直接靶向牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中配對(duì)盒基因7(paired box 7，Pax7)和組蛋白去乙?；?(histone deacetylase 4，HDAC4)來(lái)促進(jìn)細(xì)胞成肌分化。在抑制miR-1和miR-206后，可提高Pax7和HDAC4蛋白水平，還能顯著促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞的增殖[21]。另有研究表明，日本短毛肉牛在圈養(yǎng)期間，股二頭肌中miR-206的表達(dá)會(huì)逐漸下降，而放牧?xí)S持肌肉組織中的miR-206水平，這也表明miR-206參與了放牧誘導(dǎo)的肉牛肌肉類型轉(zhuǎn)化過(guò)程[22]。Dai等[23]通過(guò)微陣列芯片和qRT-PCR發(fā)現(xiàn)miR-128在牛骨骼肌中高表達(dá)，同時(shí)在牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化過(guò)程中上調(diào)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-128通過(guò)靶向抑制轉(zhuǎn)錄因子-刺激蛋白1(stimulatory protein 1，Sp1)，從而抑制牛肌肉衛(wèi)星細(xì)胞增殖和分化。Sp1同時(shí)也是成肌分化因子(myogenic differentiation，MyoD)的激活因子和細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制因子1A(cyclin-dependent kinase inhibitor 1A，CDKN1A)的抑制因子。在肌肉細(xì)胞增殖和分化過(guò)程中差異變化的miRNA也是研究的聚焦點(diǎn)。miR-483在牛成肌細(xì)胞的增殖和分化階段的表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，miR-483靶向胰島素樣生長(zhǎng)因子1(insulin-like growth factor 1，IGF1)，并下調(diào)磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶(PI3K/AKT)信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，對(duì)牛成肌細(xì)胞增殖和分化都具有負(fù)調(diào)控作用[24]。而miR-143表達(dá)量在牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化過(guò)程中顯著升高，胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白5(insulin-like growth factor binding protein 5，IGFBP5)作為IGF信號(hào)通路的重要組成部分，它在牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中直接受到miR-143的靶向調(diào)控。轉(zhuǎn)染miR-143模擬物可以導(dǎo)致IGFBP5的表達(dá)水平降低，抑制細(xì)胞增殖和分化；轉(zhuǎn)染抑制劑下調(diào)miR-143表達(dá)量也能抑制細(xì)胞增殖，但能促進(jìn)細(xì)胞分化[25]。由此可見，特異性高表達(dá)和階段差異性表達(dá)的miRNA更有可能參與肉牛肌肉發(fā)育過(guò)程，后期研究可通過(guò)生物信息學(xué)等手段充分挖掘高表達(dá)和差異表達(dá)的miRNA的靶向基因并進(jìn)行驗(yàn)證。

最近的研究表明，與miR-143類似，miR-365-3p在肌肉細(xì)胞也具增殖和分化雙重調(diào)節(jié)功能[26]，進(jìn)一步功能分析發(fā)現(xiàn)，miR-365-3p能抑制牛原代成肌細(xì)胞增殖，但促進(jìn)其分化(肌管形成)過(guò)程。其分子機(jī)制是miR-365-3p直接靶向激活素A受體Ⅰ型(activin A receptor Ⅰ，ACVRⅠ)，從而降低細(xì)胞增殖相關(guān)分子細(xì)胞周期蛋白D1(cyclinD1，CCND1)、細(xì)胞周期蛋白依賴激酶2(cyclin-dependent kinase 2，CDK2)和增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)肌肉分化標(biāo)記基因(myogenic differentiation 1,MYOD1)和肌細(xì)胞生成素(myogenin，MYOG)的表達(dá)水平。此外，miR-378和miR-139可以通過(guò)分別靶向DNA聚合酶α亞基B(DNA polymerase α subunit B，POLA2)和二氫葉酸還原酶(dihydrofolater eductase，DHFR)促進(jìn)牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分化[27-28]。Zhang等[29]研究證實(shí)了miR-2400靶向MYOG促進(jìn)牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖；Wang等[30]發(fā)現(xiàn)miR-208b可以提高CCND1、細(xì)胞周期蛋白E1(CyclinE1)的mRNA和蛋白表達(dá)水平，通過(guò)靶向負(fù)調(diào)控CDKN1A，促進(jìn)牛原代成肌細(xì)胞的增殖。綜上所述，不同miRNA因靶向作用的主效基因不同，對(duì)肉牛肌肉細(xì)胞的功能作用存在差異。在研究肉牛肌肉細(xì)胞功能基因變化的同時(shí)，關(guān)注miRNA等調(diào)控因子的變化規(guī)律，是深入探索其分子機(jī)制的有效途徑。

肌肉嫩度、肌纖維類型與牛肉肉品質(zhì)之間密切聯(lián)系。Kappeler等[31]比較了不同剪切力的牛肌肉中miRNA表達(dá)量的差異，發(fā)現(xiàn)在剪切力較低的骨骼肌中miR-182和miR-183高表達(dá)，而剪切力較高的骨骼肌中miR-338高表達(dá)。Muroya等[32]比較了日本黑牛腱肌(MyHC2x型豐度，快肌)和咀嚼肌(MyHC1型豐度，慢肌)之間差異的miRNA，結(jié)果表明miR-196a和miR-885僅在腱肌肌肉中表達(dá)，而miR-208b在咀嚼肌中高表達(dá)，這些差異表達(dá)的miRNA可能在牛肌肉類型特異性組織形成和維持方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。上述研究大體揭示了miRNA在不同牛肉品質(zhì)條件下的差異規(guī)律，但目前還沒(méi)有報(bào)道指出這些差異miRNA形成的生物學(xué)基礎(chǔ)和參與的分子機(jī)制，因此有必要在今后的研究中加以明確。

3.2 lncRNA與肉牛肌肉發(fā)育

肉牛肌肉中l(wèi)ncRNA表達(dá)規(guī)律的挖掘分析有較為廣泛的研究。Jia等[33]對(duì)成年夏洛來(lái)牛和同江牛的背最長(zhǎng)肌的lncRNA進(jìn)行高通量測(cè)序，共鑒定得到4 155個(gè)不同的lncRNA，其中有32個(gè)lncRNA在這2種肉牛背最長(zhǎng)肌存在差異表達(dá)。在哈薩克牛和新疆褐牛背最長(zhǎng)肌中，有182個(gè)lncRNA存在差異表達(dá)[34]。而在分析肉牛和廣西水牛骨骼肌組織中l(wèi)ncRNA的表達(dá)情況時(shí)候共發(fā)現(xiàn)16 236個(gè)候選lncRNA，其中差異的lncRNA共有2 161個(gè)[35]。綜合以上研究，我們可以發(fā)現(xiàn)不同品種肉牛肌肉中l(wèi)ncRNA的表達(dá)規(guī)律存在差異，這可能與不同肉牛之間肉質(zhì)性狀的差異存在緊密的聯(lián)系。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，lncRNA是肉牛骨骼肌發(fā)育的重要調(diào)控因子，通過(guò)相應(yīng)的miRNA調(diào)控牛骨骼肌發(fā)育過(guò)程。Yue等[36]利用他們課題組前期對(duì)肉牛骨骼肌轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序的結(jié)果，構(gòu)建了lncRNA-miRNA-mRNA的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)lncRNA在肉牛肌肉發(fā)育相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程和Wnt信號(hào)通路中顯著富集。Sun等[37]對(duì)肉牛3個(gè)不同發(fā)育階段(胎兒期、青春前期和體成熟期)骨骼肌中l(wèi)ncRNA的表達(dá)情況進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)401個(gè)lncRNA在3個(gè)發(fā)育階段差異表達(dá)。其中包括一種新的肌肉特異性lncRNA(lncMD)，在成肌細(xì)胞分化過(guò)程中上調(diào)。進(jìn)一步研究表明，胰島素樣生長(zhǎng)因子2(insulin-like growth factor 2，IGF2)是miR-125b的直接靶標(biāo)，而lncMD可以作為miR-125b的分子海綿，導(dǎo)致IGF2表達(dá)增強(qiáng)，從而促進(jìn)肌肉細(xì)胞分化。lncRNA-MEG3在牛骨骼肌組織中高表達(dá)，并在牛原代成肌細(xì)胞分化中保持穩(wěn)定，過(guò)表達(dá)lncRNA-MEG3可以顯著促進(jìn)成肌細(xì)胞肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain，MyhC)、MyoG和肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2C(myocyte enhancer factor 2C，MEF2C)表達(dá)，其分子機(jī)制是lncRNA-MEG3可通過(guò)與miRNA-135和MEF2C相互作用促進(jìn)牛骨骼肌細(xì)胞分化[38]。在對(duì)肉牛肌肉miRNA的總結(jié)中，已有研究表明miR-133是肌肉組織特異性高表達(dá)miRNA[20]。目前，發(fā)現(xiàn)lncRNA可以通過(guò)miR-133a和miR-133b來(lái)發(fā)揮作用。例如，lnc133b存在與成熟的miR-133b互補(bǔ)序列。lnc133b可以促進(jìn)肌肉衛(wèi)星細(xì)胞增殖并抑制其分化，下調(diào)miR-133b的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R)的表達(dá)，提示lnc133b通過(guò)ceRNA調(diào)控肌肉衛(wèi)星細(xì)胞增殖和分化[39]。在肌肉發(fā)育過(guò)程中表達(dá)量變化顯著的lnc-MDNCR可以通過(guò)海綿miR-133a，解除miR-133a對(duì)牛原代成肌細(xì)胞中的骨肉瘤B(osteosarcoma B，GosB)的靶向調(diào)控作用，從而促進(jìn)成肌細(xì)胞分化并抑制細(xì)胞增殖[40]。

通過(guò)對(duì)基因組中相鄰轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行轉(zhuǎn)錄干擾也是lncRNA的一種作用方式。在肉牛成肌細(xì)胞細(xì)胞核和肌管中特異性表達(dá)的lnc403可以負(fù)調(diào)控相鄰基因——生肌調(diào)節(jié)因子6(myogenic regulatory factors 6，Myf6)的表達(dá)，從而抑制骨骼肌細(xì)胞的分化[41]。lncKBTBD10也是定位于細(xì)胞核中并影響其鄰近基因——Kelch BTB域蛋白10(Kelch BTB domain protein 10，KBTBD10)參與肌發(fā)生過(guò)程。與其他基因的調(diào)控方式存在不同，無(wú)論對(duì)lncKBTBD10基因進(jìn)行敲低或過(guò)表達(dá)，KBTBD10蛋白水平均降低，而且牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和分化都受到了抑制[42]。Yue等[43]發(fā)現(xiàn)在肉牛成肌細(xì)胞分化過(guò)程中l(wèi)ncYYW的表達(dá)逐漸增加，并促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖。機(jī)制上，lncYYW的過(guò)表達(dá)可以增加細(xì)胞周期DNA合成(S)階段的細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)肌原蛋白和肌球蛋白重鏈的表達(dá)，進(jìn)一步的芯片分析顯示lncYYW在牛成肌細(xì)胞中正調(diào)控生長(zhǎng)激素1(growth hormone 1，GH1)及其下游基因AKT1的表達(dá)。lnc-H19已被發(fā)現(xiàn)在人類和小鼠中可以促進(jìn)成肌細(xì)胞分化，Xu等[44]研究發(fā)現(xiàn)lnc-H19在1周齡及1、6和36月齡的牛骨骼肌中均高表達(dá)，并可以通過(guò)抑制沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1/叉頭轉(zhuǎn)錄因子1(Sirt1/FoxO1)信號(hào)通路促進(jìn)牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分化。最近的研究發(fā)現(xiàn)lncRNA-IGF2 AS作為胰島素樣生長(zhǎng)因子2(insulin-like growth factor 2，IGF2)的反義轉(zhuǎn)錄本，可促進(jìn)牛成肌細(xì)胞的增殖和分化。lncRNA-IGF2 AS不僅可以補(bǔ)充IGF2的內(nèi)含子區(qū)域，影響IGF2的穩(wěn)定性和表達(dá)，還可直接與白細(xì)胞介素增強(qiáng)因子結(jié)合因子3(ILF3)蛋白結(jié)合，從而參與調(diào)控肌生成[45]。以上研究表明，lncRNA在調(diào)控肉牛骨骼肌發(fā)育過(guò)程的作用形式多樣。在通過(guò)生物信息學(xué)分析lncRNA參與的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的同時(shí)，也需關(guān)注lncRNA的基因組中相鄰轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)情況，特別是與相應(yīng)編碼基因具有互補(bǔ)序列的反義lncRNA。

3.3 circRNA與肉牛肌肉發(fā)育

Liu等[46]使用RNA-Seq鑒定了山東黑牛和魯西牛肌肉中的circRNA。在鑒定得到的14 640個(gè)circRNA中，差異表達(dá)circRNA共有655個(gè)。同時(shí)分析出有14個(gè)circRNA可能在肉牛肌肉生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控中發(fā)揮重要作用。在哈薩克牛和新疆褐牛背最長(zhǎng)肌circRNA的測(cè)序鑒定中共得到5 177個(gè)circRNA，其中有46個(gè)差異表達(dá)。進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析表明，差異表達(dá)circRNA的來(lái)源基因與肌肉的生物學(xué)過(guò)程有關(guān)[47]。這些差異表達(dá)的circRNA也可能是新疆褐牛牛肉品質(zhì)更高的生物學(xué)基礎(chǔ)。已有研究表明，circRNA參與了肉牛肌細(xì)胞增殖與分化過(guò)程。circEch1是肉牛肌肉發(fā)育過(guò)程中上調(diào)最多的circRNA之一，體外試驗(yàn)表明circEch1抑制牛成肌細(xì)胞的增殖和促進(jìn)其分化，動(dòng)物(小鼠)試驗(yàn)研究進(jìn)一步確認(rèn)circEch1可刺激骨骼肌再生[48]。更多的體外試驗(yàn)研究表明，circRNA可通過(guò)對(duì)相應(yīng)miRNA的海綿作用來(lái)參與肉牛肌肉細(xì)胞發(fā)育過(guò)程。circINSR是肉牛胚胎肌肉組織中高表達(dá)的circRNA之一，通過(guò)miR-34a調(diào)控B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)和細(xì)胞周期蛋白E2(CyclinE2)的表達(dá)來(lái)促進(jìn)肉牛成肌細(xì)胞增殖，減少細(xì)胞凋亡[49]。miR-133a是肉牛肌肉組織中高表達(dá)的miRNA，除了與lncRNA具有結(jié)合位點(diǎn)，Li等[50]發(fā)現(xiàn)到circFUT10具有miR-133a 3個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，并通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-133a，增加MyoD、MyoG和MyhC的蛋白表達(dá)水平，誘導(dǎo)牛原代成肌細(xì)胞分化，抑制增殖并促進(jìn)凋亡。miR-107同樣在肉牛骨骼肌中高表達(dá)，miR-107可以靶向抑制Wnt3a，進(jìn)而抑制牛成肌細(xì)胞的分化，circFGFR4可以通過(guò)海綿miR-107改變這一過(guò)程來(lái)促進(jìn)成肌細(xì)胞的分化[51]。circSNX29也可促進(jìn)肉牛成肌細(xì)胞分化，抑制細(xì)胞增殖，其分子機(jī)制是circSNX29直接靶向下調(diào)miR-744，逆轉(zhuǎn)miR-744對(duì)Wnt5a和CaMKⅡ δ的抑制，從而激活了非典型的Wnt5a/Ca2+信號(hào)通路[52]。circHUWEl在肉牛成肌細(xì)胞中可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-29b，解除其對(duì)AKT的抑制作用，從而激活A(yù)KT信號(hào)通路，促進(jìn)牛成肌細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡和分化[53]。miR-432作為IGF2的調(diào)節(jié)因子，circTTN可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-432，激活I(lǐng)GF2-PI3K-AKT信號(hào)通路，促進(jìn)牛原代成肌細(xì)胞的增殖和分化[54]。

綜上所述，ncRNA在肉牛肌肉組織中表達(dá)豐富，通過(guò)不同的靶基因作用和信號(hào)通路途徑，廣泛參與了肉牛肌肉細(xì)胞的增殖和分化調(diào)控過(guò)程，并與肌肉剪切力和嫩度等肉質(zhì)性狀密切相關(guān)。表1總結(jié)了近年來(lái)ncRNA在肉牛肌細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的生物學(xué)功能。

表1 ncRNAs在肉牛肌肉發(fā)育中的功能Table 1 Function of ncRNAs in muscle development in beef cattle

續(xù)表1非編碼RNANon-coding RNA靶基因Target gene功能Function文獻(xiàn)ReferencesCircEch1-抑制肌細(xì)胞增殖、促進(jìn)肌細(xì)胞分化[48]CircINSRmiR-34a/B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)促進(jìn)肌細(xì)胞增殖,減少肌細(xì)胞凋亡[49]CircFUT10miR-133a抑制肌細(xì)胞增殖、促進(jìn)肌細(xì)胞分化和凋亡[50]CircFGFR4miR-107促進(jìn)肌細(xì)胞分化[51]CircSNX29miR-744/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ δ(CaMKⅡδ)促進(jìn)肌細(xì)胞分化,抑制肌細(xì)胞增殖[52]CircHUWElmiR-29b促進(jìn)肌細(xì)胞增殖,抑制肌細(xì)胞凋亡和分化[53]CircTTNmiR-432/胰島素樣生長(zhǎng)因子2(IGF2)促進(jìn)肌細(xì)胞增殖和分化[54]

4 ncRNAs與肉牛脂肪沉積

4.1 miRNA與肉牛脂肪沉積

分析肉牛不同部位脂肪組織中ncRNA的表達(dá)差異可為肉牛脂肪沉積的靶向調(diào)控提供新途徑。Wang等[55]通過(guò)微陣列芯片和生物信息學(xué)研究了成年肉牛肌內(nèi)脂肪和皮下脂肪中miRNA的表達(dá)譜，在芯片檢測(cè)到的213個(gè)miRNAs中有88個(gè)差異表達(dá)的miRNAs。miR-143、miR-145、miR-26a、miR-2373-5p和miR-23b-3p在肌內(nèi)脂肪中高表達(dá)，而miR-26a、miR-2373-5p、miR-2325c、miR-3613和miR-2361在皮下脂肪中高表達(dá)；這些差異表達(dá)的miRNAs的靶基因參與了不同的信號(hào)通路。肌內(nèi)脂肪作為牛肉品質(zhì)評(píng)價(jià)中最重要的指標(biāo)，在不同肌內(nèi)脂肪含量的肉牛組織中，其miRNA的表達(dá)譜也存在較大差異[56-57]。肉牛脂肪組織中的miRNA的表達(dá)譜受多種因素的影響，包括品種[58]、飼糧營(yíng)養(yǎng)水平[59-60]、飼喂和放牧方式[61]等。閹割作為增加肉牛肌內(nèi)脂肪沉積，改善肉質(zhì)的途徑之一，同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致肌內(nèi)脂肪中miRNA表達(dá)譜改變。Zhang等[62]對(duì)秦川公牛和閹牛肌內(nèi)脂肪中的miRNA進(jìn)行分析共鑒定出52個(gè)差異表達(dá)的miRNA。另有研究證明，閹牛體內(nèi)組織中miR-27a-5p更高，其可以通過(guò)靶向牛體內(nèi)鈣敏感受體(calcium-sensing receptor，CaSR)來(lái)增加脂肪沉積，這也可能是閹牛具有更高品質(zhì)肉質(zhì)的原因之一[63]。

miRNA廣泛參與了肉牛脂肪沉積的調(diào)控過(guò)程。Yu等[64]為篩選肉牛脂肪形成相關(guān)的miRNA，分析了脂肪前體細(xì)胞和成熟脂肪細(xì)胞(分化后)miRNA的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)共有260個(gè)差異的miRNA，功能分析表明差異miRNA的靶基因和脂質(zhì)代謝密切相關(guān)。本文總結(jié)了近年來(lái)對(duì)肉牛脂肪細(xì)胞具有調(diào)控作用的miRNAs。miR-130a和miR-130b都可以調(diào)控牛脂肪細(xì)胞分化，miR-130a和miR-130b分別通過(guò)靶向抑制過(guò)氧化物酶體增殖激活受體(peroxisome proliferator activated receptor gamma, PPARγ)和細(xì)胞色素P450家族2亞家族U成員1(cytochrome P450 family 2 subfamily U member 1，CYP2U1)導(dǎo)致脂肪細(xì)胞中甘油三酯(triglyceride，TG)水平顯著降低，并減少脂滴形成[65]。在肉牛胎兒期脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中，miR-210通過(guò)靶向沉默Wnt1誘導(dǎo)信號(hào)通路蛋白2(Wnt1 inducible signaling pathway protein 2，WISP2)促進(jìn)細(xì)胞的脂肪生成[66]。延邊黃牛作為我國(guó)五大良種黃牛之一，miR-1271在延邊黃牛脂肪細(xì)胞中直接靶向激活轉(zhuǎn)錄因子3(activating transcription factor 3，ATF3)的3′-UTR，并下調(diào)其表達(dá)，促進(jìn)脂肪形成調(diào)節(jié)因子PPARγ和CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(CCAAT enhancer binding protein alpha，C/EBPα)的表達(dá)，從而增加甘油三酯積累和細(xì)胞聚脂[67]。miR-149-5p在牛脂肪細(xì)胞增殖和分化后期表達(dá)量上調(diào)，直接靶向CREB調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄輔激活因子(CREB regulated transcription coactivator，CRTCs)抑制脂肪細(xì)胞增殖和脂肪積累[68]。比較轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)miR-224與脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase，LPL)在肉牛肌內(nèi)脂肪中呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步的研究證實(shí)了miR-224靶向負(fù)調(diào)控LPL，同時(shí)會(huì)導(dǎo)致PPARγ、脂肪酸合酶(fatty acid synthase，F(xiàn)ASN)、圍脂滴蛋白1(perilipin 1，PLIN1)等脂肪形成相關(guān)基因的表達(dá)水平降低，從而抑制牛前體脂肪細(xì)胞的成脂分化[69]。與miR-224的調(diào)控功能相反，miR-378可促進(jìn)牛前體脂肪細(xì)胞的分化聚脂[70]。E2F轉(zhuǎn)錄因子2(E2F transcription factor 2，E2F2)和RAN結(jié)合蛋白10(RAN binding protein 10，RANBP10)都是miR-378靶基因。在肉牛脂肪細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-378，2個(gè)靶基因表達(dá)下調(diào)，而脂肪細(xì)胞分化標(biāo)記基因PPARγ、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulatory element binding protein，SREBP)表達(dá)上調(diào)，從而導(dǎo)致甘油三酯含量、脂滴體積增加。綜上所述，miRNA與肉牛脂肪細(xì)胞的增殖、分化聚脂密切相關(guān)，但需要對(duì)肉牛不同部位脂肪組織中miRNA的表達(dá)規(guī)律及調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究，從而為肉牛不同部位差異化脂肪沉積調(diào)控提供靶點(diǎn)和基礎(chǔ)資料。

4.2 lncRNA、circRNA與肉牛脂肪沉積

在肉牛脂肪沉積的ncRNA的研究中，lncRNA和circRNA的研究報(bào)道相對(duì)較少。Jiang等[70]通過(guò)測(cè)序分析了秦川犢牛和成年牛脂肪組織中l(wèi)ncRNA表達(dá)情況，共獲得3 716個(gè)候選lncRNA，在2個(gè)發(fā)育階段有119個(gè)lncRNA差異表達(dá)。他們同時(shí)對(duì)2種不同生長(zhǎng)階段肉牛脂肪組織中circRNA表達(dá)情況進(jìn)行了分析，共獲得14 274個(gè)候選circRNA，其中有307個(gè)circRNA差異表達(dá)[71]。Li等[72]分析了牛原代脂肪細(xì)胞分化前后lncRNA的表達(dá)變化，對(duì)差異表達(dá)最顯著的lncRNA ADNCR功能研究發(fā)現(xiàn)其抑制脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志性基因的表達(dá)。機(jī)制分析揭示lncRNA ADNCR能夠作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA吸附miR-204，阻止miR-204對(duì)其靶基因-組蛋白去乙?；?(sirtuin 1，SIRT1)的抑制作用，從而抑制脂肪生成。Lnc-MIR221HG作為牛轉(zhuǎn)錄中新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，主要存在于細(xì)胞核內(nèi)并能抑制牛脂肪細(xì)胞分化[73]。Lnc-BADLNCR1同樣是牛脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的調(diào)節(jié)因子，谷氧還蛋白5(glutaredoxin 5，GLRX5)是促進(jìn)脂滴形成和成脂基因表達(dá)的刺激因子，Lnc-BADLNCR1通過(guò)負(fù)調(diào)控GLRX5基因的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)抑制牛脂肪細(xì)胞分化聚脂[74]。通過(guò)對(duì)miRNA的海綿作用是lncRNA和circRNA的共同作用方式。Kang等[75]發(fā)現(xiàn)circFLT1和lncCCPG1在肉牛前體脂肪細(xì)胞和成熟脂肪細(xì)胞中的差異化表達(dá)，過(guò)表達(dá)circFLT1和lncCCPG1共同促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化并抑制增殖。他們還研究了circFLT1和lncCCPG1在這一生物學(xué)過(guò)程背后所涉及的復(fù)雜分子機(jī)制。他們發(fā)現(xiàn)circFLT1和lncCCPG1都能對(duì)miR-93形成海綿作用，解除miR-93對(duì)lncSLC30A9的表達(dá)的抑制作用，高表達(dá)的lncSLC30A9通過(guò)抑制AKT蛋白的表達(dá)來(lái)抑制細(xì)胞增殖，同時(shí)通過(guò)將FOS蛋白招募到PPARγ的啟動(dòng)子上促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化。Jiang等[71]在前期高通量測(cè)序的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)circFUT10的來(lái)源基因與脂肪組織發(fā)育和沉積密切相關(guān)，并在脂肪組織細(xì)胞中高表達(dá)。功能分析表明circFUT10通過(guò)對(duì)let-7c的海綿作用，解除let-7c對(duì)過(guò)氧化物酶體增殖激活受體-γ共激活因子1β(peroxisome proliferation-activated receptor-γ coactivator 1β，PPARGC1B)的抑制，從而促進(jìn)牛脂肪細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞分化。

綜上所述，研究肉牛脂肪細(xì)胞的增殖和分化的機(jī)理是改善肉牛體脂沉積和生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)牛肉的基礎(chǔ)。與肉牛肌肉發(fā)育的研究相比，ncRNA在脂肪沉積的研究相對(duì)薄弱，但也發(fā)現(xiàn)了許多ncRNA對(duì)肉牛脂肪細(xì)胞的增殖和分化具有調(diào)控作用，如表2所示。

表2 ncRNAs在肉牛脂肪沉積中的功能Table 2 Function of ncRNAs in fat deposition in beef cattle

續(xù)表2非編碼RNANon-coding RNA靶基因Target gene功能Function文獻(xiàn)ReferencesmiR-378E2F轉(zhuǎn)錄因子2(E2F2)/RAN結(jié)合蛋白10(RANBP10)促進(jìn)脂肪細(xì)胞成脂分化[70]LncRNA ADNCRmiR-204/組蛋白去乙?；?(SIRT1)抑制脂肪細(xì)胞聚脂[72]Lnc-MIR221HG-抑制脂肪細(xì)胞分化[73]Lnc-BADLNCR1谷氧還蛋白5(GLRX5)抑制脂肪細(xì)胞分化聚脂[74]LncCCPG1miR-93促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化、抑制脂肪細(xì)胞增殖[75]CircFLT1miR-93促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化、抑脂肪細(xì)胞制增殖[75]CircFUT10let-7c/過(guò)氧化物酶體增殖激活受體-γ共激活因子1β(PPARGC1B)進(jìn)促脂肪細(xì)胞增殖,抑制脂肪細(xì)胞分化[71]

5 小結(jié)與展望

目前，ncRNAs在畜牧生產(chǎn)上的研究發(fā)展迅速，研究者通過(guò)系統(tǒng)的生物學(xué)手段篩選出大量參與肉牛肌肉細(xì)胞和脂肪細(xì)胞增殖和分化過(guò)程的ncRNAs，為肉牛的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控和育種改良提供了理論基礎(chǔ)和豐富的調(diào)控靶點(diǎn)。隨著生物學(xué)技術(shù)的持續(xù)發(fā)展和ncRNA數(shù)據(jù)庫(kù)不斷完善、規(guī)范，研究人員將會(huì)發(fā)現(xiàn)更多參與肉牛生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的ncRNAs，但是仍然存在以下科學(xué)問(wèn)題有待探索：1)與miRNA相比，lncRNA和circRNA的功能更為廣泛，但由于在物種之間保守性差，它們?cè)谌馀Ｖ械难芯窟€需要更多的挖掘和驗(yàn)證，尤其是與肉牛脂肪沉積相關(guān)的circRNA研究。同時(shí)也需要盡快地規(guī)范lncRNA和circRNA的命名、完善相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)。2)由于肉牛屬于大型動(dòng)物的限制，目前關(guān)于非編碼RNA在肉牛肌肉和脂肪中的功能驗(yàn)證基本集中在體外細(xì)胞水平，缺乏活體試驗(yàn)的驗(yàn)證研究。miRNA在不同動(dòng)物之間保守性強(qiáng)，并具有相似的生物學(xué)功能，通過(guò)基因敲除、慢病毒載體等手段在模式動(dòng)物(例如小鼠)上進(jìn)行ncRNA功能的活體驗(yàn)證是今后可考慮的研究方法。3)肌纖維類型和肌內(nèi)脂肪是影響牛肉品質(zhì)的主要因素，在不同類型肌纖維的形成和轉(zhuǎn)化、不同部位的脂肪沉積過(guò)程中ncRNA的變化規(guī)律、生物學(xué)功能和相應(yīng)的分子機(jī)制的研究應(yīng)當(dāng)值得關(guān)注。4)飼糧營(yíng)養(yǎng)作為動(dòng)物生長(zhǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，在肌肉發(fā)育和脂肪沉積過(guò)程中具有決定性的作用。在研究不同營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和配比對(duì)肉牛肌肉和脂肪中關(guān)鍵主效基因產(chǎn)生影響的同時(shí)，也應(yīng)關(guān)注相應(yīng)功能性ncRNA的變化規(guī)律，從而為精細(xì)化營(yíng)養(yǎng)調(diào)控肉牛的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)提供基礎(chǔ)。