王儀威，馮祎高，劉潤(rùn)然，盧春甜，曹愛(ài)忠，張瑞奇

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京210095

由禾谷鐮孢菌復(fù)合種（Fusarium graminearumcomplex）引起的赤霉病是我國(guó)小麥生產(chǎn)中一種重要的真菌病害。近年來(lái)，由于氣候變暖、抗病品種缺乏以及大量秸稈還田等，赤霉病在長(zhǎng)江中下游麥區(qū)和黃淮麥區(qū)頻繁發(fā)生，已成為小麥主產(chǎn)區(qū)的重要病害，嚴(yán)重威脅小麥的安全生產(chǎn)。小麥感染赤霉病后不僅影響產(chǎn)量，而且會(huì)使籽粒中產(chǎn)生大量脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）和玉米赤霉烯酮（ZEN）等真菌毒素，嚴(yán)重危害人類健康[1]?；瘜W(xué)殺菌劑如多菌靈、戊唑醇和氰烯菌酯等被廣泛用于小麥赤霉病的防治，但長(zhǎng)期使用這些殺菌劑，會(huì)造成病菌產(chǎn)生抗藥性，嚴(yán)重影響藥劑的防治效果。另外，藥劑防治不僅增加了小麥生產(chǎn)成本，且對(duì)環(huán)境也造成污染。因此，培育抗病品種和合理種植布局是控制小麥赤霉病的根本措施。

發(fā)掘優(yōu)異抗性資源及對(duì)其抗性進(jìn)行遺傳解析是培育抗病品種的前提。普通小麥經(jīng)過(guò)近萬(wàn)年的人工馴化和育種選擇，遺傳基礎(chǔ)日趨狹窄，抗赤霉病的種質(zhì)資源相對(duì)匱乏，僅有蘇麥3號(hào)、望水白等少數(shù)資源[2-3]。盡管研究者針對(duì)小麥抗侵染、抗擴(kuò)展和低毒素積累性狀從小麥種內(nèi)發(fā)現(xiàn)了與赤霉病抗性相關(guān)的數(shù)量性狀位點(diǎn)（quantitative trait locus，QTL）200多個(gè)[1]，但大部分位點(diǎn)對(duì)赤霉病抗性的貢獻(xiàn)較低，需要將多個(gè)位點(diǎn)聚合后才能達(dá)到中抗以上水平。然而，小麥近緣種保留了豐富的遺傳多樣性，且對(duì)各種生物和非生物脅迫具有良好的適應(yīng)性，為小麥赤霉病抗性改良提供了優(yōu)異基因資源。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外針對(duì)小麥高抗赤霉病種質(zhì)資源缺乏問(wèn)題，已開(kāi)展了小麥近緣種抗赤霉病資源發(fā)掘工作，在大賴草、鵝觀草、纖毛鵝觀草、長(zhǎng)穗偃麥草等近緣種中發(fā)掘出一批抗赤霉病的優(yōu)異種質(zhì)[1]。通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交和染色體工程將赤霉病抗性導(dǎo)入小麥對(duì)小麥抗性育種具有重要意義。目前，來(lái)自小麥近緣屬種的抗赤霉病基因有3個(gè)。其中，來(lái)自于大賴草的Fhb3定位于（Leymus racemosus）7Lr#1染色體短臂[4]；來(lái)自于鵝觀草的Fhb6定位于（Roegneria kamoji）1Rk#1染色體短臂[5]；來(lái)自于偃麥草的Fhb7定位于（Thinopyrum）7E染色體長(zhǎng)臂[6]。這些優(yōu)異的赤霉病抗性基因，為小麥抗赤霉病育種提供了重要的基因資源。

鵝觀草（R.kamojiOhwi，2n=42，SSHHYY）為多年生草本植物，廣泛分布于東亞地區(qū)。周永紅等[7]鑒定了鵝觀草屬13個(gè)種71份材料，結(jié)果表明鵝觀草屬是小麥族中赤霉病抗性最強(qiáng)、抗源最多的一個(gè)屬。翁益群[8]等對(duì)小麥族8個(gè)屬近20個(gè)親緣種進(jìn)行接種鑒定發(fā)現(xiàn)，鵝觀草的赤霉病抗性較好，且通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交和幼胚培養(yǎng)，獲得了鵝觀草與中國(guó)春的雜種及回交后代。經(jīng)過(guò)多次回交、自交后，Wang等[9]選育出5個(gè)附加系和代換系，經(jīng)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restricted fragment length polymorphisms，RFLP）分 析，明 確 附 加系NAU701、NAU702和代換系NAU751中鵝觀草染色體分別屬于第1、第5和第3部分同源群，被標(biāo)定為1Rk#1、5Rk#1和3Rk#1。汪杏芬等[10]選育出赤霉病抗性較好的1Rk#1（1A）異代換系。此后，美國(guó)堪薩斯州立大學(xué)Cainong等[5]從南京農(nóng)業(yè)大學(xué)引進(jìn)1Rk#1滲入系材料，利用中國(guó)春ph1b1b突變材料誘導(dǎo)染色體重組，創(chuàng)制出了T1AL·1AS-1Rk#1S小片段易位系，通過(guò)赤霉病抗性鑒定，將該易位系攜帶的抗赤霉病基因定名為Fhb6。由于鵝觀草基因組的核型分析尚不能區(qū)分每條染色體的基因組歸屬，因此，攜帶Fhb6基因的染色體基因組歸屬目前還不清楚。

目前，許多外源物質(zhì)鑒定新方法和技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展使得快速鑒定和精確識(shí)別外源染色體身份成為可能。為了發(fā)掘鵝觀草基因組中更多優(yōu)異的赤霉病抗源，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞遺傳所2010年重新開(kāi)展了中國(guó)春與鵝觀草遠(yuǎn)緣雜交研究[11]。通過(guò)多年回交、自交，獲得了鵝觀草不同染色體滲入到中國(guó)春背景的細(xì)胞學(xué)材料。本研究基于滲入系材料，欲篩選鵝觀草第一部分同源染色體特異分子標(biāo)記，并進(jìn)一步利用分子標(biāo)記對(duì)攜帶Fhb6染色體進(jìn)行基因組歸屬分析，篩選鑒定鵝觀草第一部分同源群不同染色體滲入系材料，為后續(xù)鵝觀草第一部分同源群染色體上赤霉病抗性基因的發(fā)掘奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

鵝觀草NAURK01采自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江浦試驗(yàn)田自然生長(zhǎng)的鵝觀草。為區(qū)分1989年與中國(guó)春雜交的鵝觀草，將重新雜交鵝觀草NAURK01的染色體編號(hào)為#2，早期雜交的鵝觀草染色體編號(hào)為#1。攜帶抗赤霉病基因Fhb6的二體異代換系材料DS1RK#1(1A)用于分析攜帶Fhb6染色體的基因組歸屬。另外用于鵝觀草染色體基因組歸屬分析的小麥野生近緣屬種包括黑麥（Secale，RR）、大麥（H.vulgare，HH）、老芒麥（E.sibiricus，SSHH）、二倍體擬鵝觀草（P.libanotica，SS）、加拿大披堿草（E.canadensis，StStHH）和纖毛鵝觀草（R.ciliaris，SSYY）。以普通小麥中國(guó)春和安農(nóng)8455作為對(duì)照。上述材料均由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞遺傳研究所保存提供。

1.2 細(xì)胞學(xué)鑒定

將試驗(yàn)材料種子按單粒編號(hào)、浸種、發(fā)芽，待幼根長(zhǎng)至2 cm左右，將種子移至盛有0.2 μmol·L-1甲基胺草磷（amiprophos methyl，APM，溶劑為丙酮）溶液的培養(yǎng)皿中浸泡2 h，再用清水沖洗后將根剪下，放入0.5 mL離心管（管蓋上扎一小孔）。隨后將離心管放入密封的笑氣罐中，充入壓強(qiáng)為0.8～1.2 MP的笑氣（N2O），1.5 h后取出，加入90%預(yù)冷冰乙酸固定8 min后將根取出，經(jīng)濾紙吸干放入新的1.5 mL離心管，加入適量70%的乙醇，保存于-20℃冰箱備用。用45%醋酸溶液解離根尖，取分生區(qū)細(xì)胞以壓片法制片。將制好的片子放入-70℃冰箱，充分冷凍后，揭去蓋片放入無(wú)水乙醇中脫水5 min以上，氣干后用于原位雜交。

基因組原位雜交（genomic in situ hybridization，GISH）探針和重復(fù)序列寡聚核苷酸探針混合熒光原位雜交（Oligo-fluorescence in situ hybridization，Oligo-FISH）具體操作步驟參照王丹蕊等[12]方法進(jìn)行。純化后的鵝觀草基因組DNA用Fluorescein-12-dUTP（Roche）經(jīng)缺刻平移法標(biāo)記后用作GISH探針。使用的重復(fù)序列寡聚核苷酸探針為小麥D基因組染色體轉(zhuǎn)化的pAs1-2和pAs1-5，用紅色熒光素TAMRA 5′端標(biāo)記，探針序列和熒光標(biāo)記由安徽通用生物系統(tǒng)公司合成。GISH和Oligo-FISH分析時(shí)每張制片的雜交液中探針用量為：鵝觀草基因組GISH探針2 μL，重復(fù)序列寡聚探針pAs1-2和pAs1-5各加1 μL。進(jìn)行雜交時(shí)封阻用的中國(guó)春基因組DNA與鵝觀草基因組GISH探針的濃度比為100∶1。原位雜交制片在OLYMPUS BX53型熒光顯微鏡下選取染色體完整、分散良好的有絲分裂中期細(xì)胞，用DP80 CCD(Cooled Color Digital Camera)和cellSens Standard 1.18成像系統(tǒng)（OLYMPUS）拍照，利用Adobe Photoshop（v6.0）軟件進(jìn)行圖片分析。

1.3 分子標(biāo)記鑒定

CTAB法提取植株葉片DNA[13]。從已定位于小麥第一群染色體臂的特異EST-STS標(biāo)記中篩選鵝觀草第一部分同源群染色體特異標(biāo)記[14-16]，標(biāo)記信息詳見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為10 μL，包含2×TaqTSINGKE Master Mix（green，購(gòu)自北京擎科生物科技有限公司）5 μL，DNA模板（濃度約120 ng·μL-1）1 μL，引物各0.2 μL（10 μmol·L-1），ddH2O 3.6 μL。然后加入7 μL石蠟油進(jìn)行液封，防止DNA在PCR過(guò)程中揮發(fā)。800 r·min-1離心20 s，取出后緩慢顛倒，使各成分充分混勻。PCR程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，55～60℃退火30 s，72℃延伸50 s，33次循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。8%的聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，1%硝酸銀染色。

表1 鵝觀草第一部分同源群染色體特異分子標(biāo)記Table 1 Specific molecular markers of homologous group chromosomes1 in R.kamoji

2 結(jié)果與分析

2.1 鵝觀草第一部分同源群染色體特異分子標(biāo)記篩選

利用45個(gè)標(biāo)記對(duì)鵝觀草NAURK01及攜帶Fhb6的小麥-鵝觀草異代換系DS1RK#1(1A)進(jìn)行掃描，有20個(gè)標(biāo)記能夠鑒定出鵝觀草第一部分同源群1條或多條染色體，但多數(shù)標(biāo)記在鵝觀草與普通小麥中擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量大小較接近。其中，CINAU27、CINAU190、CINAU207和CINAU493在普通小麥中國(guó)春和安農(nóng)8455均能擴(kuò)增出1A、1B和1D特異條帶，同時(shí)能夠鑒定鵝觀草第一部分同源群2條或3條染色體，且PCR產(chǎn)物與小麥第一部分同源群染色體擴(kuò)增產(chǎn)物易于區(qū)分，因此，選取這4個(gè)STS標(biāo)記用于后續(xù)材料鑒定（表1）。其中，CINAU27在鵝觀草中擴(kuò)增出兩條特異條帶，其余3個(gè)標(biāo)記在鵝觀草中擴(kuò)增出3條特異條帶(圖1，2)。CINAU493定位于小麥第一部分同源群染色體長(zhǎng)臂，其余3個(gè)標(biāo)記定位于小麥第一部分同源群染色體短臂。

2.2 攜帶Fhb6染色體的基因組歸屬分析

利用CINAU27對(duì)小麥近緣物種中可能是鵝觀草基因組供體的二倍體或四倍體種進(jìn)行鑒定，結(jié)果（圖1）表明，除大麥（HH）外，該標(biāo)記在供試材料中均擴(kuò)增出特異條帶，表明該標(biāo)記序列在小麥近緣物種中存在同源序列，可用于基因組進(jìn)化分析。CINAU27在六倍體鵝觀草（SSHHYY）和四倍體纖毛鵝觀草（SSYY）擴(kuò)增出了兩條分子量大小相同的條帶，一條分子量為930 bp，另一條分子量為590 bp。在四倍體老芒麥（SSHH）和二倍體擬鵝觀草（SS）中僅擴(kuò)增出了590 bp特異條帶。因此，CINAU27在六倍體鵝觀草中擴(kuò)增出的590 bp特異條帶應(yīng)為1S特異條帶，930 bp特異條帶應(yīng)為1Y特異條帶。攜帶Fhb6小麥-鵝觀草異代換系DS1RK#1(1A)DNA僅出現(xiàn)930 bp特異條帶，缺失1A染色體特異條帶（圖2a），由此推斷，該小麥-鵝觀草異代換系為DS1Y#1（1A），F(xiàn)hb6基因所在的染色體為1Y#1。

圖1 分子標(biāo)記CINAU27在普通小麥及其近緣屬種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR productions amplified by marker CINAU27 in wheat and its relatives

2.3 小麥-鵝觀草第一部分同源群染色體滲入系材料分子細(xì)胞學(xué)鑒定

從中國(guó)春與NAURK01的BC2F6世代中共計(jì)選育出5份材料涉及鵝觀草第一部分同源群染色體，分別命名為21RK-1、21RK-2、21RK-3、21RK-4和21RK-5。利用篩選的鵝觀草4個(gè)特異STS標(biāo)記對(duì)5份材料進(jìn)行PCR，結(jié)果（圖2）表明，21RK-1的4個(gè)STS標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物與攜帶Fhb6小麥-鵝觀草異代換系DS1RK#1(1A)完全相同；與中國(guó)春相比，多一條1Y染色體特異條帶，而缺少1A染色體特異條帶。21RK-2與中國(guó)春相比，CINAU27的擴(kuò)增產(chǎn)物多一條1S染色體特異條帶，而缺少1D染色體特異條帶。21RK-3、21RK-4和21RK-5擴(kuò)增的鵝觀草特異條帶與21RK-2相同，表明均是涉及1S#2染色體的滲入系材料。但21RK-5在用CINAU493擴(kuò)增時(shí)缺少鵝觀草特異條帶，表明該材料包含的染色體是1S染色體短臂。

圖2 基因組特異分子標(biāo)記在5份小麥-鵝觀草滲入系材料的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR productions of five wheat-R.kamoji introgression lines amplified by using four STS markers

基因組原位雜交和oligo-FISH鑒定發(fā)現(xiàn)（圖3），21RK-1的染色體數(shù)目2n=42，包含一對(duì)鵝觀草染色體（圖3B），其Oligo-FISH核型與1Y#1相同（圖3G），因此，21RK-1是1Y#2染色體代換1A染色體的二體異代換系DS1Y#2(1A)。21RK-2的染色體數(shù)目2n=42，包含一對(duì)鵝觀草染色體且其oligo-FISH核型與1Y染色體不同（圖3G），且缺少一對(duì)1D染色體（圖3C），因此，21RK-2是1S#2染色體代換1D染色體的二體異代換系DS1S#2（1D）。21RK-3是添加1S#2染色體的異附加系DA1S#2（圖3D）。21RK-4為1S#2和TW·1S#2S的雙單體附加系（圖3E）。21RK-5為純合TW·1S#2S易位系（圖3F）。

圖3 小麥-鵝觀草滲入系材料的GISH/FISH分析Fig.3 GISH/FISH analysis of six wheat-R.kamoji introgression lines

3 討論

小麥野生近緣屬種包含大量的異源多倍體，這些異源多倍體基因組的二倍體供體鑒定是一項(xiàng)復(fù)雜的工作。傳統(tǒng)的異源多倍基因組組成分析主要依靠染色體核型分析，或?qū)愒炊啾扼w與不同二倍體雜交后對(duì)其雜種F1花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂染色體進(jìn)行構(gòu)型分析。鵝觀草是異源六倍體（2n=2x=42，SSHHYY），染色體較多，要獲得一套以普通小麥為背景的完整鵝觀草添加系/代換系是一項(xiàng)長(zhǎng)期工作，并且鵝觀草染色體組的核型難以區(qū)分每一條染色體，因此，小麥-鵝觀草染色體滲入系的鑒定具有巨大挑戰(zhàn)。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞遺傳研究所早在20年前就選育出了抗赤霉病較好的二體異代換系材料DS1RK#1(1A)[8-10]，將其攜帶的抗赤霉病基因命名為Fhb6[5]，但一直無(wú)法確定攜帶該基因染色體的基因組歸屬。本研究通過(guò)篩選小麥及其近緣屬種第一部分同源染色體特異分子標(biāo)記，明確了攜帶抗赤霉病基因Fhb6的染色體為1Y染色體。利用這些標(biāo)記從中國(guó)春與鵝觀草的滲入系中鑒定出了5份涉及鵝觀草第一部分同源群染色體的新種質(zhì)。本研究結(jié)果表明，基因組特異分子標(biāo)記為精確、高效鑒定小麥-鵝觀草滲入系提供了新策略，加快了鵝觀草中優(yōu)異抗性基因的發(fā)掘工作，對(duì)小麥與其他野生近緣種的遠(yuǎn)緣雜交工作具有借鑒作用。

小麥及其近緣屬種赤霉病抗性遺傳分析表明，高抗病材料往往包含多個(gè)抗病基因。異源六倍體鵝觀草是抗小麥赤霉病最強(qiáng)的野生近緣屬種，可能也是多個(gè)抗性基因聚合的效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)鵝觀草與普通小麥雜種后代的赤霉病抗性鑒定發(fā)現(xiàn)，中國(guó)春與鵝觀草雜種F1及回交BC1F1和BC2F1后代的赤霉病抗性較高[11]，但總體上隨著回交和自交代數(shù)增加呈下降趨勢(shì)。這可能是隨著世代增加，攜帶多條鵝觀草染色體的單株逐步被淘汰，每個(gè)植株(系)中只保留1～2條外源染色體，因此，推測(cè)鵝觀草抗小麥赤霉病基因可能位于不同染色體。從鵝觀草1Y染色體短臂末端定位到一個(gè)赤霉病抗性位點(diǎn)Fhb6，與其部分同源的第一部分同源群其他染色體上也可能存在Fhb6等位基因。本研究從中國(guó)春與鵝觀草重新雜交的后代中選育到新的1Y#2（1A）二體異代換系，還選育到4個(gè)與其部分同源的1S#2染色體滲入系材料。這些材料為進(jìn)一步發(fā)掘Fhb6等位基因奠定了基礎(chǔ)。盡管對(duì)這些材料還未進(jìn)行系統(tǒng)的赤霉病抗性鑒定，但多年的自然發(fā)病觀察發(fā)現(xiàn)攜帶1S#2染色體的21RK-2和21RK-3抗性較好，可能攜帶新的赤霉病抗性位點(diǎn)，生育期較中國(guó)春早，穗型與中國(guó)春不同，短芒且育性好（圖4）。DS1S#2（1D）二體異代換系材料21RK-2與感赤霉病優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)品種安農(nóng)8455雜交獲得了1S#2與1D雙單體材料，后續(xù)將進(jìn)一步從其自交后代材料中鑒定1DL.1S#S和1DS.1S#L補(bǔ)償性易位系，系統(tǒng)分析安農(nóng)8455遺傳背景下易位系的赤霉病抗性和農(nóng)藝性狀，為小麥抗赤霉病育種提供新種質(zhì)。

圖4 中國(guó)春及中國(guó)春-鵝觀草滲入系穗型Fig.4 Spikes of Chinese Spring and CS-R.kamoji introgression lines