咸莉梅，胡怡，李磊，孫政璽，何心堯，李韜*

1.揚州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，教育部植物功能基因組學(xué)重點實驗室；江蘇省作物基因組學(xué)和分子育種重點實驗室；江蘇省作物遺傳生理重點實驗室，江蘇 揚州225009；

2.國際玉米小麥改良中心，墨西哥 特斯科科CP 56237

小麥赤霉病是由禾谷鐮刀菌[Gibberella zeae(Schw.)Petch]引起的世界性真菌病害，不僅會造成小麥產(chǎn)量降低，其產(chǎn)生的嘔吐毒素（deoxynivalenol,DON）、雪腐鐮刀菌烯醇（nivalenol,NIV）等真菌毒素還會威脅人畜健康[1]。培育抗病和抗毒素積累的品種是目前解決小麥赤霉病及其毒素污染最為可靠的策略。Schroeder和Christensen[2]首先將赤霉病抗性分為TypeⅠ和TypeⅡ兩類，后來，Mesterhazy等[3]在此基礎(chǔ)上將其擴展為5類，分別為TypeⅠ（抗侵染）、TypeⅡ（抗擴展）、TypeⅢ（抗毒素積累）、TypeⅣ（籽粒抗性）和TypeⅤ（耐病性或耐產(chǎn)量損失）。其中TypeⅡ和TypeⅢ研究較多，也是較為重要的兩種抗性類型，反映了產(chǎn)量損失和籽粒毒素的污染程度，與糧食和食品安全直接關(guān)聯(lián)。關(guān)于這兩類抗性已有明確的概念和度量方法[4]。

準(zhǔn)確可靠的表型鑒定是進行基因精細(xì)定位和克隆、機制解析以及抗病品種選育的前提條件，也是限制赤霉病抗性研究的一個瓶頸。已報道的赤霉病表型接種鑒定的方法有自然鑒定、孢子彌霧接種[5]、土表接種[5-6]和單花滴注法[5-7]等，其中單花滴注法比較準(zhǔn)確和穩(wěn)定，是常用的方法[8]，一般指在小麥揚花初期對穗上的一個小穗的單側(cè)小花注射孢子液，接種后18～21 d鑒定病小穗率。此外，我們通過摸索和優(yōu)化改良，提出了一種新的接種鑒定方法——基部穗軸節(jié)間注射法[9]，即在小麥抽穗后，將赤霉菌孢子液注射入穗基部節(jié)間內(nèi)部，在第22～25 d鑒定病小穗率。

本文主要評述了赤霉病抗性類型及其現(xiàn)有評價方法，并提出與抗性類型相對應(yīng)的鑒定和評價方法，以期為赤霉病表型鑒定、遺傳改良以及抗性機制解析提供參考。

1 TypeⅠ（抗侵染）

TypeⅠ抗性反映小麥抵御病原菌初侵染的能力，可理解為在適宜的溫濕度條件下，病原菌與寄主直接接觸時，寄主阻止病原菌在小穗或小花上定殖的能力。一般用孢子彌霧接種或（和）病粒土表接種來模擬自然條件下病原菌的侵染條件。關(guān)于TypeⅠ的度量方法，有學(xué)者建議用病穗率（percentage of infected spikes,PIS）或感染小穗率（percentage of diseased spikelets,PDS）進行評價，且衡量TypeⅠ抗性的重點在于時間點的把握，即在病害進入穗軸擴展之前鑒定，避免與TypeⅡ重疊[10-11]。鑒定時間點與病害壓力有很大關(guān)系，一般來說在接種后14 d左右，如果發(fā)病快的話就需要提前。真菌毒素是小麥-赤霉菌互作過程中的毒力因子[12]，會影響赤霉菌在小麥穗中的擴展。研究表明，與野生型菌株相比，使用Tri5突變體菌株（即不能產(chǎn)生單端孢霉烯族毒素的菌株）接種小麥后基本不擴展或擴展得很慢[13]。因此，使用產(chǎn)毒缺陷型突變體來進行接種可以很大程度排除TypeⅡ的效應(yīng)，從而更好地衡量TypeⅠ抗性。

株高、花期長短、花藥外露程度、穎殼張開程度等形態(tài)和發(fā)育特征均會影響赤霉病發(fā)病程度和感染率[14-15]。自然情況下，與株高較高的小麥植株相比，較矮的植株因與土表的病原菌距離更近，赤霉病發(fā)病情況往往會更嚴(yán)重[3,14]。但是這并不屬于形態(tài)學(xué)上的抗性，因為這些特征不會在感染后抑制病原菌，而是幫助植物逃避病原菌，降低入侵的可能性或幾率，即避病性[16]。隨機性較大，不屬于抗性的范疇，所以不應(yīng)與TypeⅠ抗性混為一談。

在活體營養(yǎng)型病原體（如銹菌和白粉菌）與寄主的互作中，抗侵入意味著寄主對病原菌產(chǎn)生免疫或近免疫反應(yīng)[17-18]。而引起赤霉病的禾谷鐮孢菌是半活體營養(yǎng)型病原體[14]，如果溫度、濕度等環(huán)境條件適宜且小穗發(fā)育時期處在敏感時期，任何一個小穗都會發(fā)病，并不存在免疫類型小麥品種。如果TypeⅠ是真實存在的，這種抗性理論上是可遺傳的，意味著不同品種之間可能存在差異，但純系類個體之間的反應(yīng)型是基本一致或相似的，截至目前還沒有實驗和數(shù)據(jù)支撐上述推斷。當(dāng)然，也不能據(jù)此排除品種在抗侵染方面可能存在的差異。因此，關(guān)于寄主介導(dǎo)的赤霉病TypeⅠ抗性的機制以及鑒定和評價方法仍需探索。

2 TypeⅡ（抗擴展）

TypeⅡ抗性指小麥抵抗赤霉菌在穗部擴展的能力，以接種后每穗感病小穗數(shù)占總小穗數(shù)的百分比，即病小穗率（percentage of symptomatic spikelets,PSS）為衡量指標(biāo)。因其比其他抗性重要且更為穩(wěn)定和易于評價，所以研究報道最多[19]。用于TypeⅡ抗性鑒定的經(jīng)典方法是單花滴注法，該方法鑒定結(jié)果相對穩(wěn)定和準(zhǔn)確，但最好配有額外的保濕措施[8]。由于通量和接種效率較高，孢子彌霧接種和土表接種也用于TypeⅡ抗性鑒定，不過有學(xué)者認(rèn)為這兩種方法反映的實際是TypeⅠ和TypeⅡ的混合效應(yīng)。這兩種接種方法的缺點是個體間發(fā)病差異大，表型難以準(zhǔn)確鑒定，適合育種材料的大規(guī)模初步篩選，不推薦用于抗性表型的精準(zhǔn)鑒定、基因的精細(xì)定位和功能解析。我們提出的基軸節(jié)間注射法[9]也可以反映赤霉病的抗擴展性，該法最大的優(yōu)點是無需保濕措施，接種時間彈性較大（抽穗后-揚花期-灌漿早期），穗軸注射法的侵染路徑是從穗軸到小穗，而單花滴注是從小穗到穗軸，因此與單花滴注法有很好的互補性。

為了在非保濕條件下提高接種成功率和表型鑒定的準(zhǔn)確性，我們在單花滴注法的基礎(chǔ)上發(fā)展了雙花滴注法，又根據(jù)接種位置進一步將雙花滴注法分為穗基部雙花滴注法（接種穗下部倒數(shù)第5個小穗的雙側(cè)小花）和穗頂部雙花滴注法（接種穗上部第7個小穗的雙側(cè)小花）。以Fhb1近等基因系為材料，比較了穗基部雙花滴注法、穗頂部雙花滴注法和基部穗軸注射法的差異，發(fā)現(xiàn)3種接種方法下Fhb1近等基因系間的病小穗率均達(dá)到了極顯著差異（P＜0.01）。另外我們發(fā)現(xiàn)，對于感病品種而言，穗基部雙花滴注法容易引起接種點上方小穗早枯現(xiàn)象；雖然頂部雙花滴注法不會引起穗早枯現(xiàn)象，但會縮小抗、感間病小穗率的差異。因此，我們認(rèn)為迷霧保濕下的穗基部雙花滴注法（或穗中部單花滴注），或者穗基部雙花滴注法（或穗中部單花滴注）和基部穗軸節(jié)間注射法聯(lián)合使用能夠增加TypeⅡ抗性鑒定的可靠性。

3 TypeⅢ（抗毒素積累）

TypeⅢ抗性指小麥抑制毒素積累或降解DON、NIV、T-2等真菌毒素的能力，毒素也包括DON的乙酰化衍生物3-ADON和15-ADON及D3G等隱蔽型真菌毒素。隱蔽型真菌毒素（masked mycotoxins）被定義為特定由植物防御機制形成的源自真菌毒素的化合物[20]。同其他異源物質(zhì)一樣，毒素可被活體植物改變化學(xué)結(jié)構(gòu)而代謝轉(zhuǎn)化，但目前大部分研究發(fā)現(xiàn)TypeⅢ抗性只能不完全降解或減少毒素毒性[21]，且證據(jù)表明，隱蔽型毒素可在人體和動物的消化過程中逆轉(zhuǎn)為DON[22]，對人體和動物仍存在潛在危害。毒素是水溶性的，可在穗部自由運輸，所以一般是整穗收獲再進行毒素檢測。隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，目前毒素檢測方法主要有薄層層析法（thin-layer chromatography,TLC）[23]、氣相色譜法（gas chromatography,GC）[24]、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography,HPLC）[25]、酶 聯(lián) 免 疫 法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）[26]等。ELISA、晶體膠或試紙條法操作簡便、快速且成本較低，適用于育種材料快速篩選；GC、HPLC等儀器法精確度更高，與質(zhì)譜（mass spectrum,MS）聯(lián)用還可精確定量隱形毒素含量，適用于遺傳研究、機制解析或精準(zhǔn)鑒定。目前，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（liquid chromatography mass spectrometry,LCMS）[27]或高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-MS）[28]是實驗室檢測毒素含量及形態(tài)的主要手段。

不同接種方法對于籽粒DON含量也有顯著的影響，我們以Fhb1近等基因系為材料，同時用穗基部雙花滴注法、穗頂部雙花滴注法和基部穗軸注射法進行接種，收獲后測定籽粒中毒素，發(fā)現(xiàn)基部雙花滴注法下DON含量在抗、感近等基因系間無顯著差異（P＞0.05）；基軸節(jié)間注射法下DON含量在抗感間達(dá)到了顯著水平（P＜0.05，平均差值大于100 μg·kg-1），該法也表明病穗率與籽粒毒素含量之間沒有必然的聯(lián)系；而在頂部雙花滴注法下抗、感材料間DON含量差異最大化，達(dá)極顯著差異水平（P＜0.01,平均差值大于1 000 μg·kg-1）。說明毒素含量與接種方法或侵染點有很大的關(guān)系。在自然感染或迷霧鑒定條件下，侵染點是隨機發(fā)生的，這可能是導(dǎo)致籽粒DON含量在重復(fù)間、年度間或同一基因型個體間差異比較大、波動范圍寬的主要原因之一。不同接種方法或侵染點不同導(dǎo)致DON毒素積累差異的機制尚不明確。基部雙花滴注法對感病材料來說容易導(dǎo)致穗早枯，適合判斷抗感總體差異但不推薦用于毒素分析；而頂部接種法不會造成穗早枯現(xiàn)象，雖縮小了病小穗率在抗、感之間的差異，但更適合毒素含量的分析；基軸節(jié)間注射法無需額外保濕措施，既可以分析品種的總體抗、感情況，也適合毒素含量分析，可以作為赤霉病和毒素分析的有益補充方法。孢子彌霧法和土表接種法通量高，適宜大規(guī)模育種材料的鑒定，但需要多重復(fù)多環(huán)境鑒定和測定。

4 TypeⅣ（籽?？剐裕?/h2>

Mesterhazy[3]于1995年提出TypeⅣ抗性，但并未對籽粒抗性進行明確的定義，也未提出具體的評價方法，此后很多研究者將病粒率（Fusariumdamaged kernels,FDK）作為評價籽?？剐缘闹笜?biāo)[29]。FDK指單花滴注或噴霧鑒定條件下，接種麥穗中被赤霉菌感染的籽粒占總穗粒數(shù)的百分比。絕大部分報道認(rèn)為PSS與FDK間呈極顯著正相關(guān)，且控制FDK的多數(shù)QTL與擴展抗性位點重合[30-32]，說明FDK本質(zhì)上是度量擴展抗性的間接方法。

我們借鑒植物抗病的概念對籽?？剐赃M行了明確定義，即在適合病原菌侵染的條件下（如適宜的溫度和濕度），處于同一發(fā)育時期的待評價籽粒有同等機會直接接觸病原菌時籽粒本身所表現(xiàn)出的抗性[33]。根據(jù)此定義，我們還開發(fā)出度量籽?？剐缘脑u價方法[33]，具體做法是在揚花期去除待接種麥穗的中間小花以及穗頂部和穗基部退化小穗，保留小穗兩側(cè)的正常小花，在花后10 d和15 d滴注等量的赤霉菌孢子液，確保每個小花所結(jié)籽粒有均等機會接觸病原菌，并保證接種的一致性，方便不同基因型籽粒間或同一基因型不同發(fā)育時期籽粒間的抗性比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)[33]，不論發(fā)育階段和是否攜帶Fhb1，接種小麥籽粒的千粒重都顯著下降，且令人意外的是攜帶Fhb1的抗病近等基因系R22W比不攜帶Fhb1的感病近等基因系S22V粒重下降幅度更大，這證明了Fhb1負(fù)調(diào)控籽粒抗性，或者至少說明Fhb1與TypeⅣ抗性無關(guān)。在育種工作中可以將接種前后千粒重的降幅作為度量籽?？剐缘闹笜?biāo)，在相同病小穗率的前提下，比較接種和未接種對照籽粒間的千粒重的降幅，降幅越大，籽粒抗性越差。

5 TypeⅤ（耐病性或耐產(chǎn)量損失）

該抗性類型代表品種的耐赤霉病能力，以灌漿期籽粒受赤霉菌侵染后產(chǎn)量的損失大小為度量依據(jù)[14]?；诋a(chǎn)量三要素（畝穗數(shù)、穗粒數(shù)和千粒重），在花后10 d和15 d接種，每畝穗數(shù)和每穗粒數(shù)已基本固定，理論上灌漿期赤霉病接種只影響粒重，因此從該角度講可將TypeⅤ合并到TypeⅣ，簡化抗性類型。

6 展望

綜上，對于不同抗性類型，準(zhǔn)確穩(wěn)定的表型鑒定和評價方法非常關(guān)鍵。我們建議把TypeⅣ和TypeⅤ合并，可將小麥赤霉病抗性類型簡化為四類：TypeⅠ、TypeⅡ、TypeⅢ和TypeⅣ（表1）。不能將避病性與TypeⅠ抗性混為一談，TypeⅠ抗性的本質(zhì)以及鑒定和評價方法仍需探索；TypeⅡ與TypeⅢ抗性較為重要，但二者的關(guān)系復(fù)雜，育種改良中需要兼顧；籽粒毒素含量與接種方法或侵染點有很大關(guān)系；TypeⅣ與擴展抗性沒有必然的聯(lián)系，病粒率（FDK）不宜作為評價TypeⅣ抗性的指標(biāo)。總之，對上述不同抗性本質(zhì)的理解、評價方法的完善、機制的解析以及在育種過程中兼顧不同抗性仍然是未來赤霉病研究的重點。

表1 小麥赤霉病抗性類型及鑒定評價方法Table 1 Resistance types and the corresponding phenotyping methods of Fusarium head blight

續(xù)表