沈曉瑩，劉晶晶，陳曲波，亓垚，陳明敏，楊國翠，金杰，孟影，何紅梅，袁鴿，郜恒駿

作者單位：201203 上海生物芯片有限公司/生物芯片上海國家工程研究中心（沈曉瑩、劉晶晶、亓垚、陳明敏、楊國翠、金杰、孟影、何紅梅、袁鴿、郜恒駿）；510120 廣州，廣東省中醫(yī)院生物資源中心（陳曲波）

腦膠質(zhì)瘤是最常見和最致命的顱內(nèi)腫瘤，具有侵襲性強(qiáng)、惡性高、進(jìn)展快等特點，通常表現(xiàn)為對正常腦組織的破壞以及對整個大腦的廣泛侵襲，常規(guī)的治療方法不能對其產(chǎn)生較好的療效[1-2]。世界衛(wèi)生組織（WHO）根據(jù)其組織病理學(xué)將膠質(zhì)瘤分為四級（I～I(xiàn)V）。即使是得到最佳治療，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（IV 級）的中位生存期僅為 12～15 個月[3-4]。因此，尋找新的靶點和深入了解分子生物學(xué)機(jī)制對于開發(fā)更有效的腦膠質(zhì)瘤治療策略是非常必要的。

SMARCC1（SWI/SNF related,matrix associated,actin dependent regulator of chromatin subfamily c member 1），也稱為 BAF155，連同 SMARCA4、SMARCA2 和 SMARCB1 等均屬于 SWI/SNF 蛋白質(zhì)家族。SMARCC1 是一種螺旋酶和 ATP 酶，可以通過改變基因周圍的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)來調(diào)節(jié)該基因的轉(zhuǎn)錄。SMARCC1 是 ATP 依賴的 SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合物的一部分，它含有一個亮氨酸拉鏈基序，可以與許多典型的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合[5-6]。前期的文獻(xiàn)報道顯示，SMARCC1的表達(dá)與前列腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、腎癌、肝癌、乳腺癌等多種癌癥有關(guān)，但是研究結(jié)論卻并不一致[7-17]。例如，Heeb?ll等[7]證實 SMARCC1 的蛋白表達(dá)與前列腺癌的Gleason 評分、臨床 T 分期和復(fù)發(fā)時間等均顯著正相關(guān)，有明顯染色的患者更容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，這證實了 SMARCC1 的促癌功能。但是，Hansen 等[8]卻發(fā)現(xiàn) SMARCC1 對前列腺癌有抑制作用，免疫組化陽性的臨床局限性前列腺癌患者的無病生存期顯著長于陰性患者。類似的，SMARCC1 在結(jié)腸癌的研究也顯示了相互矛盾的結(jié)論[9-11]。而關(guān)于SMARCC1 在腦膠質(zhì)瘤的研究鮮有報道。

本文采用免疫組化實驗研究了 SMARCC1 蛋白表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤樣本的臨床指標(biāo)及預(yù)后的相關(guān)性；隨后利用 siRNA 技術(shù)降低了 SMARCC1 基因表達(dá)，以檢測目標(biāo)基因?qū)τ谀[瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響；最后，采用 qPCR 技術(shù)檢測了增殖和凋亡相關(guān)基因 ki67 和Bcl2 在 SMARCC1 下調(diào)前后的細(xì)胞中的表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織芯片 腦膠質(zhì)瘤組織芯片（HBraG180Su01）來源于上海芯超生物科技有限公司，包含 180 例腦膠質(zhì)瘤石蠟組織。病人的手術(shù)時間為 2008年2月到 2011年10月，隨訪到 2017年7月，隨訪時間 69～113 個月；失訪1 例。大部分病人提供性別、年齡、病理分級、復(fù)發(fā)狀況等臨床信息（表 1）。

表1 SMARCC1 表達(dá)和腦膠質(zhì)瘤樣本的臨床資料相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis between SMARCC1 expression and clinical data of glioma samples

1.1.2 實驗試劑 一抗 SMARCC1（AB22355）購自英國 Abcam 公司；HRP 標(biāo)記的二抗（DM827）和二氨基聯(lián)苯胺（DAB）購自 Dako 公司；腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株 U251MG 和 U87MG 購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院；10% 胎牛血清（10099141C）和 DMEM 培養(yǎng)液（12430054）購自美國 Gibco 公司；轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000（11668019）和逆轉(zhuǎn)錄酶 SuperScript IV Reverse Transcriptase（18090010）均購自美國 Thermo Fisher 公司；針對 SMARCC1 的小干擾 RNA（small interfering RNAs）siRNA-SMARCC1（簡稱 si-SMARCC1）和對照 siRNA-NC（簡稱 NC）（A10001）由基因制藥公司合成；檢測細(xì)胞增殖的 CCK8 試劑盒（A311-01）購自 Vazyme 公司；凋亡染色液 Hochest和 PI（C1052）采購于 Beyotime Biotechnology 公司；Trizol 試劑（T9424-200 ml）購自美國 Sigma公司；qPCR 反應(yīng)試劑 SYBR?預(yù)混料 Ex-Taq? II（Tli RNaseH Plus）（RR820Q）購自 Takara 公司；各基因的 qPCR 引物由上海生工合成。

1.1.3 實驗儀器 CO2培養(yǎng)箱（HCP-80）購自海爾公司；酶標(biāo)儀（ARM-100）購自 All For Life Science 公司；ACUMEN 掃描儀（ACUMEN eX3）購自 TTP-LabTech 公司；LightCycler480 熒光定量PCR 儀購自羅氏公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)實驗 組織芯片先經(jīng)過脫蠟和抗原修復(fù)，再加入稀釋好的一抗 SMARCC1（1:10 000）在 4 ℃ 下孵育過夜，然后使用 HRP標(biāo)記的二抗孵育，用 PBST 緩沖液沖洗，用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色。結(jié)果判讀：每個組織點的不同區(qū)域隨機(jī)選擇三個視野，每個視野判讀 100 個細(xì)胞，記錄這些細(xì)胞的平均染色強(qiáng)度和染色百分率。染色強(qiáng)度計分為：無染色（0 分）、弱染色（1 分）、中等染色（2 分）和強(qiáng)染色（3 分）。染色百分率計分為：0%（0 分）、1%～20%（1 分）、21%～40%（2 分）、41%～60%（3 分）、61%～80%（4 分）、81%～100%（5 分）?？傇u分=染色強(qiáng)度計分 × 染色百分率計分。得到的總評分的區(qū)間為0～15 分。將腦膠質(zhì)瘤樣本按照總評分分成兩組：IHC 總評分 ≥ 12 分為 SMARCC1 高表達(dá)組，IHC 總評分 <12 分為 SMARCC1 低表達(dá)組。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗 經(jīng)過細(xì)胞核型鑒定的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株 U251MG 和 U87MG 接種于含有 10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)液中，在37 ℃ 的 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，重新調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至 200 000/ml；每孔加入 0.5 ml 細(xì)胞懸浮液，37 ℃ 培養(yǎng)；細(xì)胞貼壁后，去除原培養(yǎng)基；按照說明書加入轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 和 siRNA 的混合物，37 ℃ 轉(zhuǎn)染 6 h 后更換為包含 90% DMEM 培養(yǎng)基和 10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染時，2 個細(xì)胞株都分成對照組和實驗組，分別轉(zhuǎn)染 siRNA-NC（簡稱NC）和 siRNA-SMARCC1（簡稱 si-SMARCC1）。

1.2.3 細(xì)胞增殖實驗 將轉(zhuǎn)染 24 h 的細(xì)胞接種在 96 孔板中，每孔 100 μl 細(xì)胞懸浮液；繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后，每孔加入 10 μl CCK8 在 37 ℃ 孵育2 h，使用酶標(biāo)儀在 450 nm 測定吸光度。按照下面公式計算細(xì)胞增殖率：細(xì)胞增殖率=（實驗組OD值–空白組OD值）/（對照組OD值–空白組OD值）× 100%。

1.2.4 細(xì)胞凋亡實驗 將轉(zhuǎn)染 24 h 的細(xì)胞接種在 96 孔板中，每孔 100 μl 細(xì)胞懸浮液；繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后加入 100 μl 的染色液 Hochest/PI，37 ℃避光染色 20 min。用 ACUMEN 儀器掃描細(xì)胞染色結(jié)果并輸出實驗數(shù)據(jù)。

1.2.5 RNA 抽提和熒光定量 PCR 實驗 腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)染 siRNA 48 h 后被消化和收集。使用 Trizol 試劑提取總 RNA，使用 SuperScript?IV逆轉(zhuǎn)錄酶合成 cDNA。采用熒光定量 PCR（qPCR）實驗檢測各組細(xì)胞的 SMARCC1、ki67 和 Bcl2 的mRNA 表達(dá)，Actin 作為參考基因。每個樣品的反應(yīng)總體積為 50 μl，其中包括 2 μl 0.4 μmol/L 引物混合物、25 μl SYBR 綠色母料混合物、4 μl DNA 模板和 16 μl 無 RNase/Dnase 無菌水。qPCR 程序設(shè)置：初始變性在 95 ℃ 下進(jìn)行 30 s；在 95 ℃ 下進(jìn)行 5 s，60 ℃ 下進(jìn)行 30 s，40 個循環(huán)，在 60 ℃延伸階段收集熒光數(shù)據(jù)；在 95 ℃ 下進(jìn)行 5 s，60 ℃ 下進(jìn)行 1 min，95 ℃ 結(jié)束，在 60～90 ℃ 階段收集熒光數(shù)據(jù)。各基因的 qPCR 引物序列見表 2。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

排除在實驗中脫落的組織病例，實際獲得170 例病人的免疫組織化學(xué)實驗數(shù)據(jù)。將數(shù)據(jù)納入SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，P<0.05 為有統(tǒng)計學(xué)意義。采用 Spearman 相關(guān)分析法計算SMARCC1 蛋白表達(dá)與臨床指標(biāo)的相關(guān)性。生存期單因素分析采用 Kaplan-Meier 法和 log-rank 檢驗，將單因素分析中具有統(tǒng)計學(xué)意義的變量納入COX 多元回歸生存分析。細(xì)胞增殖實驗、細(xì)胞凋亡實驗和 qPCR 實驗數(shù)據(jù)等均采用 GraphPad 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，P<0.05 為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SMARCC1 蛋白表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤的病理分級、復(fù)發(fā)及預(yù)后等臨床指標(biāo)相關(guān)性

免疫組化實驗結(jié)果顯示，SMARCC1 主要定位在腦膠質(zhì)瘤組織的細(xì)胞核，且所有組織樣本均顯示了細(xì)胞核的陽性表達(dá)（圖 1）。相關(guān)染色計算成總評分后納入 SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，P<0.05 為有統(tǒng)計學(xué)意義。

Spearman's rho 分析顯示，SMARCC1 核染色分組分別和腦膠質(zhì)瘤患者的病理分級、復(fù)發(fā)等臨床指標(biāo)顯著正相關(guān)（r=0.197，P=0.010）（r=0.188，P=0.014），而和性別、年齡等臨床指標(biāo)沒有相關(guān)性（P>0.05）（表 1）。生存期單因素分析顯示，SMARCC1 高表達(dá)的腦膠質(zhì)瘤病人擁有顯著更短的總生存期（OS）（54.7% 比 74.3%，P=0.012）和無病生存期（DFS）（34.4% 比 54.3%，P=0.010）（圖 2）。生存期多因素分析顯示，SMARCC1 核染色分組并不是預(yù)后的獨立預(yù)測因素（P>0.05），而年齡、病理分級等分別是腦膠質(zhì)瘤病人的總生存期和無病生存期的獨立預(yù)測因素（P<0.01）（表 3，表 4）。

圖2 采用 Kaplan-Meier 法和 log-rank 法分析 SMARCC1 表達(dá)和腦膠質(zhì)瘤病人的總生存期（OS）及無病生存期（DFS）的相關(guān)性Figure 2 Kaplan-Meier method and log-rank were used to analyze the correlation between SMARCC1 expression and overall survival (OS) as well as disease-free survival (DFS) of glioma patients

2.2 降低 SMARCC1 表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、凋亡的相關(guān)性

轉(zhuǎn)染 48 h 后，我們使用 qPCR 技術(shù)檢測SMARCC1 在細(xì)胞株的表達(dá)變化。檢測結(jié)果顯示，和對照組相比較，SMARCC1 的基因表達(dá)水平在轉(zhuǎn)染 si-SMARCC1 的兩株細(xì)胞 U251MG 和 U87MG中分別下調(diào)了 68.1% 和 69.2%（P<0.001，P<0.001）（圖 3A）。

圖3 qPCR 實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染 si-SMARCC1 顯著降低了 SMARCC1（A）、ki67（B）和 Bcl2（C）在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的表達(dá)（*P <0.05，**P <0.01，***P <0.001）Figure 3 The qPCR results indicated that the expression of SMARCC1 (A),ki67 (B) and Bcl2 (C) were all down-regulated significantly in glioma cells after si-SMARCC1 transfection (*P <0.05,**P <0.01,***P <0.001)

隨后的細(xì)胞學(xué)實驗結(jié)果表明：與對照組細(xì)胞相比較，si-SMARCC1 轉(zhuǎn)染 48 h 后的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株 U251MG 和 U87MG 的細(xì)胞增殖比率分別降低 14.4% 和 18.5%（P<0.01，P<0.001），而細(xì)胞凋亡比率分別提高了 42.6% 和 20.8%（P<0.0001，P<0.01）（圖 4）。

圖4 細(xì)胞功能學(xué)實驗表明，轉(zhuǎn)染 si-SMARCC1 顯著降低了腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞 U251MG（A）和 U87MG（B）的增殖比率而提高了凋亡比率（**P <0.01，***P <0.001，****P <0.0001）Figure 4 Results of cell functional test indicated that the proliferation of glioma cell lines U251MG (A) and U87MG (B) were decreased significantly while the apoptosis was increased after si-SMARCC1 transfection (**P <0.01,***P <0.001,****P <0.0001)

2.3 降低 SMARCC1 表達(dá)對 ki67、Bcl2 表達(dá)的影響

為了研究 SMARCC1 表達(dá)與細(xì)胞增殖和凋亡等信號通路的相關(guān)性，利用 qPCR 方法檢測了SMARCC1 沉默 48 h 后的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的增殖凋亡相關(guān)基因的表達(dá)變化。實驗結(jié)果顯示：和對照組相比，轉(zhuǎn)染 si-SMARCC1 的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株不但抑制了 SMARCC1 的表達(dá)，同時也顯著降低了促增殖基因 ki67 和抗凋亡基因 Bcl2 的基因表達(dá)水平。其中，在 U251MG 細(xì)胞中，ki67、Bcl2 的mRNA 的表達(dá)水平分別降低了 60% 和 30%（P<0.001，P<0.01）；在 U87MG 細(xì)胞中，ki67、Bcl2的 mRNA 的表達(dá)水平分別降低了 41% 和 43%（P<0.01，P<0.05）（圖 3B、3C）。

3 討論

關(guān)于腦膠質(zhì)瘤組織芯片的免疫組化實驗顯示，SMARCC1 蛋白主要定位在細(xì)胞核中。統(tǒng)計學(xué)分析顯示，SMARCC1 核染色分組和腦膠質(zhì)瘤的病理分級、復(fù)發(fā)等顯著正相關(guān)，且 SMARCC1 高表達(dá)的病人擁有顯著更差的總生存期和無病生存期，這提示了 SMARCC1 對于腦膠質(zhì)瘤的促癌作用。

前期關(guān)于 SMARCC1 和各種癌癥的相關(guān)性研究雖然較多，但是結(jié)論卻不一致，甚至關(guān)于同一種癌癥的研究結(jié)果也互相矛盾。例如，Andersen 等[9]通過免疫組化對約 1000 例 I～I(xiàn)II 期大腸腺癌的分析表明，CBFB 和 SMARCC1 蛋白含量高的腫瘤患者的總生存率明顯高于低水平患者，提示SMARCC1 對于結(jié)腸癌具有抑癌作用。而 Ke 等[10]對于大腸癌的細(xì)胞學(xué)實驗卻發(fā)現(xiàn)：SMARCC1 可促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，是抑癌基因miR-202-5p 的直接靶點，且可以逆轉(zhuǎn) miR-202-5p對大腸癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的抑制作用。值得一提的是，近幾年關(guān)于 SMARCC1 和肝癌、乳腺癌的研究均提示了該基因的促癌屬性。例如，Zhou 等[14]一次性研究了 15 個 SWI/SNF 亞基在肝癌樣本的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)包括 SMARCC1 在內(nèi)的 14 個亞基在癌組織中顯著高表達(dá)，11 個亞基與病人的總生存率顯著相關(guān)。之后，他們確定了一個 4 基因的預(yù)后預(yù)測模型，包括 ACTL6A、ARID1A、SMARCC1和 SMARCD1，其過表達(dá)能有效預(yù)測更差的總生存期，提示 SMARCC1 對于肝癌預(yù)后的重要影響。

為了研究 SMARCC1 對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能，我們培養(yǎng)了兩個腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株 U251MG和 U87MG，采用 siRNA 技術(shù)降低了 SMARCC1基因在細(xì)胞中的表達(dá)水平。隨后的細(xì)胞學(xué)功能實驗顯示，與轉(zhuǎn)染 siRNA-NC 的對照組相比較，SMARCC1 基因的表達(dá)下調(diào)顯著抑制了腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖而促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。同時，qPCR 實驗也證實，腫瘤促增殖基因 ki67 和抗凋亡基因 Bcl2的 mRNA 表達(dá)水平也都出現(xiàn)了顯著下降，這與細(xì)胞功能實驗結(jié)果相一致。由此我們推測，SMARCC1可能通過調(diào)節(jié)腫瘤增殖和凋亡相關(guān)基因而促進(jìn)了腦膠質(zhì)瘤的惡化，使其更容易復(fù)發(fā)和死亡；而病理分級差的病人表達(dá)了相對較高的目標(biāo)基因，也加速了疾病的進(jìn)展過程。

關(guān)于肝癌的研究文獻(xiàn)也證實了 SMARCC1 對于腫瘤細(xì)胞的促癌作用——SMARCC1 在肝癌細(xì)胞的表達(dá)下調(diào)能抑制細(xì)胞遷移和細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與下調(diào) MMP-2、MMP-9、Bcl2 表達(dá)而上調(diào) caspase3 表達(dá)有關(guān)[15-16]。同樣，下調(diào) SMARCC1 表達(dá)也能降低乳腺癌細(xì)胞株MCF-7 的細(xì)胞增殖并提高了細(xì)胞凋亡比率，其機(jī)制可能與端粒酶活性被抑制有關(guān)[17]。這些文獻(xiàn)進(jìn)一步證實了我們對于 SMARCC1 的促癌機(jī)制的推測，并使我們更加有理由相信目標(biāo)基因的促癌機(jī)制可能涉及到更多更廣的基因通路，敲除或降低SMARCC1 在腦膠質(zhì)瘤的表達(dá)可能對于病人的復(fù)發(fā)及預(yù)后有良好的影響。

總之，我們的實驗研究發(fā)現(xiàn) SMARCC1 的表達(dá)和腦膠質(zhì)瘤病人的病理分級、復(fù)發(fā)及預(yù)后等臨床指標(biāo)顯著相關(guān)，降低 SMARCC1 基因的表達(dá)水平能顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，同時顯著減少了 ki67 和 Bcl2 等基因的表達(dá)水平。我們推測，SMARCC1 可能通過影響細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)信號通路來促進(jìn)癌癥進(jìn)展，是腦膠質(zhì)瘤預(yù)后的重要標(biāo)記物。

志謝感謝實驗室工作人員對于本研究實驗過程的支持和協(xié)助；感謝綜合管理部對于本研究所用試劑耗材的采購和管理；最后，感謝國家重點研發(fā)計劃對本文的經(jīng)費支持。