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        自養(yǎng)殖池塘中分離出的一株枯草芽孢桿菌對(duì)養(yǎng)殖水質(zhì)的影響

        2021-10-18 07:14:36李海潔董小林郭國(guó)軍楊雪冰林雅云曹亞奇李國(guó)喜劉變枝
        水產(chǎn)學(xué)雜志 2021年4期
        關(guān)鍵詞:枯草芽孢水體

        李海潔,董小林,郭國(guó)軍,楊雪冰,林雅云,曹亞奇,李國(guó)喜,劉變枝

        (1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,河南 鄭州 450002;2.廣東海大集團(tuán)股份有限公司,廣東 廣州 511400;3.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院,河南 鄭州 450046;4.河南省水產(chǎn)技術(shù)推廣站,河南 鄭州 450008)

        水質(zhì)是影響水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物生長(zhǎng)和發(fā)育的重要因子。近年來(lái),隨著我國(guó)高密度集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展,水體中殘餌、糞便等內(nèi)源性有機(jī)污染日趨嚴(yán)重,養(yǎng)殖水體中氨態(tài)氮(NH4+-N)、亞硝態(tài)氮(NO2--N)、化學(xué)需氧量(COD)等有毒有害物質(zhì)含量急劇增加,嚴(yán)重超標(biāo),成了制約水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境的主要因子[1,2]。水體中的非離子氨是氨氮對(duì)養(yǎng)殖生物的主要危害形式,其濃度直接反映水體氨氮的毒性。亞硝酸鹽是養(yǎng)殖水體中另一種常見(jiàn)的含氮毒性污染物,被視為養(yǎng)殖水域中誘發(fā)魚(yú)類(lèi)爆發(fā)性疾病的重要因素和致病的根源[3]。COD 是反映水體中有機(jī)及無(wú)機(jī)氧化物污染的常用指標(biāo),COD 含量高說(shuō)明水體還原性物質(zhì)過(guò)高,水體受污染程度大,嚴(yán)重時(shí)造成魚(yú)類(lèi)死亡[4,5]。養(yǎng)殖水體中有機(jī)氮(殘餌、代謝物)的不斷累積是水體中氮超標(biāo)的根本原因,亞硝酸鹽濃度和水體COD 含量與養(yǎng)殖過(guò)程中的殘餌、糞便以及肥料、浮游植物豐度等關(guān)系密切。因此,尋找安全、快速便捷的養(yǎng)殖水體水質(zhì)凈化處理技術(shù),有效解決高密度養(yǎng)殖水體中水質(zhì)問(wèn)題將是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康、可持續(xù)發(fā)展的必然舉措,是目前水產(chǎn)從業(yè)人員亟待解決的問(wèn)題。

        在眾多養(yǎng)殖水體凈化技術(shù)中,微生態(tài)制劑以經(jīng)濟(jì)、環(huán)保、安全、無(wú)抗藥性等成為養(yǎng)殖水域生態(tài)環(huán)境治理的熱門(mén)研究領(lǐng)域。芽孢桿菌Bacillus 分布廣、增殖快、抗逆性強(qiáng),能分泌多種高活性的消化酶和抑菌物質(zhì),是現(xiàn)代微生物研究的熱門(mén)對(duì)象??莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis,BS)是芽孢桿菌屬中研究和應(yīng)用較為廣泛的一種,是我國(guó)農(nóng)業(yè)部正式批準(zhǔn)使用的益生菌,具有耐高溫、耐酸、耐鹽、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn),可作為添加劑提高飼料利用效率、促進(jìn)機(jī)體健康,還具有消耗水體中有機(jī)物、抑制致病菌繁殖、凈化養(yǎng)殖水體的作用[6-8],是水質(zhì)調(diào)控中常用的微生物種類(lèi)。目前,有關(guān)枯草芽孢桿菌凈水效果的研究較多,但由于評(píng)價(jià)方法和試驗(yàn)周期不一致、試驗(yàn)方法不嚴(yán)謹(jǐn)?shù)葐?wèn)題,研究結(jié)果可比性差,部分研究菌株并非來(lái)自水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè),評(píng)價(jià)中未能充分考慮水體自?xún)糇饔玫龋M管目前市場(chǎng)上枯草芽孢桿菌產(chǎn)品較多,但市場(chǎng)現(xiàn)有枯草芽孢桿菌使用效果參差不齊,效果不穩(wěn)定。與物化法相比,生物脫氮法雖具有環(huán)保、安全等特點(diǎn),但其凈水效果受菌株投放數(shù)量、菌株定植特性與定植能力、水體微生物種類(lèi)與數(shù)量、水體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、水體理化指標(biāo)(如溶氧、溫度等)等多方面的影響。養(yǎng)殖中天氣、溫度、溶氧等環(huán)境因子改變均可導(dǎo)致上述因素改變,影響菌株的凈水能力。因此,篩選來(lái)源于養(yǎng)殖水體、降解效率高、起效快的有效發(fā)揮凈水作用的枯草芽孢桿菌菌株,對(duì)快速改善水質(zhì),避免或緩解魚(yú)類(lèi)急性中毒,保障水產(chǎn)養(yǎng)殖安全具有重要意義。

        本試驗(yàn)評(píng)價(jià)廣東海大集團(tuán)股份有限公司畜牧水產(chǎn)研究中心從養(yǎng)殖池塘中分離出的一株枯草芽孢桿菌在短時(shí)間對(duì)常規(guī)羅非魚(yú)養(yǎng)殖池塘水體的凈化效果,以期篩選快速、高效降解水體有害物質(zhì)的枯草芽孢桿菌菌株,為本土化微生物凈水產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        本試驗(yàn)用枯草芽孢桿菌由廣東海大集團(tuán)股份有限公司畜牧水產(chǎn)研究中心動(dòng)保技術(shù)研究所從廣東海大集團(tuán)海鷗島基地養(yǎng)殖池塘中分離提供。正式試驗(yàn)前,用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h,制備濃度約109cfu/mL 的應(yīng)用菌液,冷藏備用。

        試驗(yàn)用水取自廣東海大集團(tuán)股份有限公司研究中心海鷗島研究基地的常規(guī)羅非魚(yú)暫養(yǎng)塘。試驗(yàn)開(kāi)始前,連續(xù)檢測(cè)池塘水質(zhì)指標(biāo),至池水氨態(tài)氮(NH4+-N)含量為0.5007 mg/L,亞硝態(tài)氮(NO2--N)含量為0.0558 mg/L,化學(xué)需氧量(COD)6.9009 mg/L 時(shí)開(kāi)展試驗(yàn)。

        試驗(yàn)前,將池水抽入24 個(gè)有效水體積250 L 循環(huán)水養(yǎng)殖缸內(nèi),循環(huán)12 h,然后取水樣檢測(cè),確保各養(yǎng)殖缸內(nèi)水質(zhì)指標(biāo)完全一致后,停止水體循環(huán),改為靜水,微曝氣,開(kāi)始試驗(yàn)。整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中,試驗(yàn)缸內(nèi)不放置底泥、魚(yú)類(lèi)等生物,不投餌。

        1.2 方法

        試驗(yàn)共設(shè)8 個(gè)處理組,分別量取0.25 mL(BS1)、1.25 mL(BS2)、2.5 mL(BS3)、12.5 mL(BS4)、25 mL(BS5)、62.5 mL(BS6)和125 mL(BS7)的應(yīng)用菌液,水體菌液終濃度分別為1×103cfu/mL、5×103cfu/mL、1×104cfu/mL、5×104cfu/mL、1×105cfu/mL、2.5×105cfu/mL 和5×105cfu/mL,每組3 個(gè)平行,以無(wú)添加組為空白對(duì)照(C 組)。試驗(yàn)進(jìn)行5 d。

        試驗(yàn)期間,水溫保持在(29.2±0.6)℃,自然光照,微管曝氣。試驗(yàn)開(kāi)始后第1 d、2 d、3 d、4 d、5 d 的早上7:00,利用虹吸法在水面下方30 cm 處采集水樣,測(cè)定氨態(tài)氮(NH4+-N)含量、亞硝態(tài)氮(NO2--N)含量和化學(xué)需氧量(COD)。所取水樣保存在4℃冰箱待測(cè),當(dāng)天測(cè)定完畢。

        NH4+-N含量按照HJ 535-2009 標(biāo)準(zhǔn)采取納氏試劑分光光度法測(cè)定;NO2--N 含量按照GB 7493-87 標(biāo)準(zhǔn)采用N-(1-萘基)-己二胺分光光度法測(cè)定;COD 含量按照按GB 11892-89 標(biāo)準(zhǔn)采用酸式高錳酸鉀指數(shù)法測(cè)定。

        1.3 數(shù)據(jù)分析

        數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示,用SPSS(20.0)軟件進(jìn)行分析處理。數(shù)據(jù)經(jīng)齊性檢驗(yàn)(Homogeneity of variances)后,采用one-way ANOVA 方法做一元方差分析。若數(shù)據(jù)差異顯著,則進(jìn)行Duncan’s 多重比較(Duncan’s multiple range test),P<0.05 表示差異顯著。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 不同濃度枯草芽孢桿菌對(duì)水體NH4+-N含量的影響

        由表1 可知,各組水體中NH4+-N含量均隨時(shí)間延長(zhǎng)而顯著上升至最高后下降(P<0.05),實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)添加濃度≥1×105cfu/mL 組仍顯著高于初始水平(P<0.05)。同一時(shí)間,添加劑量≥2.5×105cfu/mL時(shí)1 d 內(nèi)顯著降低水體NH4+-N含量(P<0.05),隨后水體NH4+-N含量明顯反彈,前期降幅越大,后期反彈幅度越大(P<0.05)。在同一取樣時(shí)間,對(duì)照組NH4+-N含量為基準(zhǔn)計(jì)算得到的去除率,表明高劑量添加下短期內(nèi)可有效去除水體NH4+-N,后期出現(xiàn)反彈(圖1)。

        表1 不同濃度BS 對(duì)水體NH4+-N 含量的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤,n=3)Tab.1 Effect of different concentrations of BS on ammonia-nitrogen content in the water(Mean ± SE,n=3)/mg·L-1

        圖1 各取樣時(shí)間點(diǎn)以對(duì)照組為基準(zhǔn)的NH4+-N去除率Fig.1 Removal rate of NH4+-N at each sampling time compared with the control group

        2.2 不同濃度枯草芽孢桿菌對(duì)水體NO2--N含量的影響

        由表2 可知,盡管各組水體NO2--N 含量均隨試驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)顯著升高(P<0.05),以同一取樣時(shí)間對(duì)照組水體NO2--N 含量為基準(zhǔn)計(jì)算的去除率數(shù)據(jù)表明,該菌株添加濃度>1×105cfu/mL 時(shí)具有明顯的劑量依賴(lài)降NO2--N 的作用(P<0.05)。添加劑量5×105cfu/mL 對(duì)水體NO2--N 去除率可高出水體自?xún)裟芰Φ?5%(圖2)。

        表2 不同濃度BS 對(duì)水體NO2ˉ-N含量的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤,n=3)Tab.2 Effect of different concentrations of BS on nitrite content in the water(Mean ± SE,n=3)/mg·L-1

        圖2 各取樣時(shí)間點(diǎn)以對(duì)照組為基準(zhǔn)的試驗(yàn)組NO2--N去除率Fig.2 Removal rate of NO2--N at each sampling time compared with the control group

        2.3 不同濃度枯草芽孢桿菌對(duì)水體COD 含量的影響

        由表3 可知,對(duì)照組、添加劑量≤5×104cfu/mL組水體COD 含量于第2 d 即顯著降至最低(P<0.05)。添加劑量≥1×105處理組水體COD 含量則在第2 d 顯著升至最高后又恢復(fù)至初始水平。同一取樣時(shí)間點(diǎn)添加劑量≤5×104cfu/mL 組水體中COD 含量無(wú)顯著差異(P>0.05),添加劑量≥1×105cfu/mL 組水體COD 含量呈明顯劑量遞增(P<0.05)。以同一取樣時(shí)間對(duì)照組水體COD 含量為基準(zhǔn)計(jì)算的去除率數(shù)據(jù)表明:該枯草芽孢桿菌各添加濃度對(duì)水體COD 無(wú)明顯去除作用(圖3)。

        表3 不同濃度BS 對(duì)水體COD 含量的處理(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤,n=3)Tab.3 Effect of different concentrations of BS on COD content in the water(Mean ± SE,n=3)/mg·L-1

        圖3 各取樣時(shí)間點(diǎn)以對(duì)照組為基準(zhǔn)的試驗(yàn)組COD 去除率Fig.3 Removal rate of COD at each sampling time compared with the control group

        3 討論

        3.1 不同濃度枯草芽孢桿菌對(duì)水體NH4+-N含量的影響

        本試驗(yàn)中,各組水體中NH4+-N含量均出現(xiàn)短期升高的現(xiàn)象,推測(cè)是水體有機(jī)質(zhì)有氧氧化分解所致[9,10]。同一取樣時(shí)間點(diǎn)以對(duì)照組NH4+-N含量為基準(zhǔn)計(jì)算的去除率數(shù)據(jù)表明:添加劑量(≥2.5×105cfu/mL)時(shí)該菌株具有短期劑量依賴(lài)效應(yīng)去除水體NH4+-N含量的作用,隨后出現(xiàn)劑量依賴(lài)性反彈,推測(cè)是添加濃度≥2.5×105cfu/mL 時(shí)引起水體生物間競(jìng)爭(zhēng)性死亡、水體中增加的還原性物質(zhì)向NH4+-N轉(zhuǎn)化所致。本試驗(yàn)中,高濃度添加組(≥2.5×105cfu/mL)水體COD 含量于試驗(yàn)第2 d 顯著升高后下降,水體NH4+-N含量于第3 d 顯著上升也一定程度上說(shuō)明該菌添加初期導(dǎo)致水體還原性物質(zhì)增多,增多的還原性物質(zhì)向NH4+-N轉(zhuǎn)化,添加枯草芽孢桿菌后水體氨氮先下降后上升的現(xiàn)象,在其他研究中也有報(bào)道[11]??莶菅挎邨U菌是具有高活性消化酶的需氧異養(yǎng)菌,無(wú)淤泥、無(wú)投餌等外源性有機(jī)質(zhì)輸入下高劑量添加勢(shì)必會(huì)引起水體微生物群落間的競(jìng)爭(zhēng)性改變和水體還原性物質(zhì)增多[11]。張念海[12]研究發(fā)現(xiàn),芽孢桿菌的添加可競(jìng)爭(zhēng)性地抑制水體中某些優(yōu)勢(shì)藻類(lèi)的生長(zhǎng)。王月霞等[13]也發(fā)現(xiàn),魚(yú)塘水體中色球藻Chroococcus 數(shù)量與芽孢桿菌添加量呈典型負(fù)相關(guān)。本試驗(yàn)?zāi)康氖菫榱藱z測(cè)該菌株的短期水質(zhì)凈化能力,故未對(duì)長(zhǎng)時(shí)間下水體微生物間的相互作用及其動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)進(jìn)行研究。

        3.2 不同濃度枯草芽孢桿菌對(duì)水體NO2ˉ-N含量的影響

        水體中NO2--N 能將魚(yú)類(lèi)血紅蛋白中的二價(jià)鐵氧化為三價(jià)鐵,損害血液的運(yùn)氧能力,引起魚(yú)類(lèi)窒息死亡[14,15]。有效控制水體中NO2--N 含量是決定養(yǎng)殖成敗的重要因素。本試驗(yàn)中,各組水體NO2--N呈上升趨勢(shì),NH4+-N在升至最高后下降,說(shuō)明該菌株添加初期水體氨氧化引起的亞硝化占主導(dǎo)作用[16]。同一時(shí)間下,高劑量添加組(>1×105cfu/mL)水體中NO2--N 含量呈現(xiàn)明顯劑量遞減效應(yīng),添加濃度>1×105cfu/mL 時(shí)該菌株對(duì)水體NO2--N 的清除效率比對(duì)照組高75%,表明一定劑量下該菌株具有明顯的降低NO2--N的作用。

        枯草芽孢桿菌對(duì)水體NO2--N 的去除效果受菌株投放數(shù)量、菌株定植特性和能力、水體微生物種類(lèi)與數(shù)量、水體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量、溶氧、溫度等多因素的影響。朱長(zhǎng)生等[5]研究發(fā)現(xiàn),潑灑復(fù)合芽孢桿菌菌劑(水體終濃度為1.5×104cfu/mL)后,短期(1 d)可有效降低水體NO2ˉ-N,7 d 后效果喪失;鄒文娟等[17]在水體中投放終濃度為0.25×105cfu/mL 的枯草芽孢桿菌后,水體中NO2--N含量前期顯著上升,7 d后下降;溫志新等[18]在刺參Apostichopus japoncus養(yǎng)殖水體中發(fā)現(xiàn),未充氣狀態(tài)下,枯草芽孢桿菌對(duì)養(yǎng)殖廢水中的氨氮和亞硝酸鹽無(wú)有效去除作用;王月霞等[13]發(fā)現(xiàn),池塘水體溶氧量上升至6 mg/mL時(shí),所用枯草芽孢桿菌才有明顯去除水體NO2--N的效應(yīng);湯寶貴等[19]在對(duì)蝦養(yǎng)殖池的凈化研究中發(fā)現(xiàn),添加1.04×105~2.08×105cfu/mL 芽孢桿菌,短時(shí)間(≤24 h)內(nèi)可顯著降低水體NO2--N的含量,但隨著時(shí)間延長(zhǎng)劑量相關(guān)效應(yīng)消失。也有研究發(fā)現(xiàn),簡(jiǎn)單水體中添加過(guò)量枯草芽孢桿菌會(huì)導(dǎo)致水體負(fù)荷增大,影響水體生態(tài)平衡,不利于發(fā)揮凈水作用[12],水體氧氣不足或水體添加濃度過(guò)高,均會(huì)導(dǎo)致菌種密度、水體空間和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的制約效應(yīng),抑制其對(duì)水體氨氮和NO2--N的去除作用。本實(shí)驗(yàn)中,該菌株添加量為5×105cfu/mL 時(shí),降NO2--N效果顯著高于湯寶貴等[19]、溫志新等[18]研究中所用菌株,與朱長(zhǎng)生等[5]所用復(fù)合芽孢桿菌菌劑效果相當(dāng)。總體而言,本試驗(yàn)所用菌株可作為快速有效降低水體NO2--N含量的目標(biāo)菌株,但尚需與其他有效降低水體NH4+-N 和COD 的產(chǎn)品進(jìn)行配伍,以更好地發(fā)揮凈水作用。

        3.3 不同濃度枯草芽孢桿菌對(duì)水體COD 含量的影響

        本試驗(yàn)中,試驗(yàn)期間對(duì)照組水體COD 含量持續(xù)降低,說(shuō)明水體具有一定的自?xún)糇饔?,是水體自養(yǎng)型生物同化和異養(yǎng)型生物分解作用的共同體現(xiàn)[20 ]。

        同一取樣時(shí)間添加濃度≤5×104cfu/mL 組水體COD 含量與對(duì)照組無(wú)顯著差異,說(shuō)明低濃度該菌株(≤5×104cfu/mL)下水體自?xún)糇饔谜贾鲗?dǎo)因素;高劑量(≥1×105cfu/mL)添加時(shí),試驗(yàn)第2 d 水體COD 含量明顯呈劑量依賴(lài)上升效應(yīng),是高濃度添加導(dǎo)致水體還原性物質(zhì)短期快速增多所致。從時(shí)間上看,添加劑量≥1×105cfu/mL 組水體中COD 先迅速上升至最高又迅速下降至初始水平,說(shuō)明該菌株具有一定的COD 清除能力。試驗(yàn)結(jié)束時(shí),BS6 和BS7 組水體COD 含量仍高于同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組水體COD 含量,推測(cè)應(yīng)是試驗(yàn)周期短所致。添加一定濃度枯草芽孢桿菌時(shí),水體COD 含量先升后降與劉樹(shù)彬等[21]評(píng)價(jià)枯草芽孢桿菌HAINUP40 對(duì)養(yǎng)殖廢水中COD 的去除趨勢(shì)一致。

        3.4 結(jié)論

        本試驗(yàn)所用枯草芽孢桿菌菌株添加量為2.5×105~5×105cfu/mL 時(shí),可在短期內(nèi)有效降低養(yǎng)殖水體中NO2--N 含量,對(duì)去除水體NH4+-N含量和COD 也有一定效果,故該菌株可作為有效去除水體NO2--N的目標(biāo)菌株,但因枯草芽孢桿菌是嚴(yán)格的需氧型異養(yǎng)菌,添加的芽孢桿菌直接參與到水體微生物群落間的相互競(jìng)爭(zhēng)中,短期內(nèi)易造成水體中還原性物質(zhì)增多,故使用該菌株應(yīng)與其他能有效去除水體NH4+-N和COD 的菌株配合使用。

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