李海潔，董小林，郭國(guó)軍，楊雪冰，林雅云，曹亞奇，李國(guó)喜，劉變枝

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.廣東海大集團(tuán)股份有限公司，廣東 廣州 511400；3.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，河南 鄭州 450046；4.河南省水產(chǎn)技術(shù)推廣站，河南 鄭州 450008）

水質(zhì)是影響水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物生長(zhǎng)和發(fā)育的重要因子。近年來(lái)，隨著我國(guó)高密度集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，水體中殘餌、糞便等內(nèi)源性有機(jī)污染日趨嚴(yán)重，養(yǎng)殖水體中氨態(tài)氮（NH4+-N）、亞硝態(tài)氮（NO2--N）、化學(xué)需氧量（COD）等有毒有害物質(zhì)含量急劇增加，嚴(yán)重超標(biāo)，成了制約水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境的主要因子[1,2]。水體中的非離子氨是氨氮對(duì)養(yǎng)殖生物的主要危害形式，其濃度直接反映水體氨氮的毒性。亞硝酸鹽是養(yǎng)殖水體中另一種常見(jiàn)的含氮毒性污染物，被視為養(yǎng)殖水域中誘發(fā)魚(yú)類(lèi)爆發(fā)性疾病的重要因素和致病的根源[3]。COD 是反映水體中有機(jī)及無(wú)機(jī)氧化物污染的常用指標(biāo)，COD 含量高說(shuō)明水體還原性物質(zhì)過(guò)高，水體受污染程度大，嚴(yán)重時(shí)造成魚(yú)類(lèi)死亡[4,5]。養(yǎng)殖水體中有機(jī)氮（殘餌、代謝物）的不斷累積是水體中氮超標(biāo)的根本原因，亞硝酸鹽濃度和水體COD 含量與養(yǎng)殖過(guò)程中的殘餌、糞便以及肥料、浮游植物豐度等關(guān)系密切。因此，尋找安全、快速便捷的養(yǎng)殖水體水質(zhì)凈化處理技術(shù)，有效解決高密度養(yǎng)殖水體中水質(zhì)問(wèn)題將是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康、可持續(xù)發(fā)展的必然舉措，是目前水產(chǎn)從業(yè)人員亟待解決的問(wèn)題。

在眾多養(yǎng)殖水體凈化技術(shù)中，微生態(tài)制劑以經(jīng)濟(jì)、環(huán)保、安全、無(wú)抗藥性等成為養(yǎng)殖水域生態(tài)環(huán)境治理的熱門(mén)研究領(lǐng)域。芽孢桿菌Bacillus 分布廣、增殖快、抗逆性強(qiáng)，能分泌多種高活性的消化酶和抑菌物質(zhì),是現(xiàn)代微生物研究的熱門(mén)對(duì)象?？莶菅挎邨U菌（Bacillus subtilis，BS）是芽孢桿菌屬中研究和應(yīng)用較為廣泛的一種，是我國(guó)農(nóng)業(yè)部正式批準(zhǔn)使用的益生菌，具有耐高溫、耐酸、耐鹽、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)，可作為添加劑提高飼料利用效率、促進(jìn)機(jī)體健康，還具有消耗水體中有機(jī)物、抑制致病菌繁殖、凈化養(yǎng)殖水體的作用[6-8]，是水質(zhì)調(diào)控中常用的微生物種類(lèi)。目前，有關(guān)枯草芽孢桿菌凈水效果的研究較多，但由于評(píng)價(jià)方法和試驗(yàn)周期不一致、試驗(yàn)方法不嚴(yán)謹(jǐn)?shù)葐?wèn)題，研究結(jié)果可比性差，部分研究菌株并非來(lái)自水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，評(píng)價(jià)中未能充分考慮水體自?xún)糇饔玫龋M管目前市場(chǎng)上枯草芽孢桿菌產(chǎn)品較多，但市場(chǎng)現(xiàn)有枯草芽孢桿菌使用效果參差不齊，效果不穩(wěn)定。與物化法相比，生物脫氮法雖具有環(huán)保、安全等特點(diǎn)，但其凈水效果受菌株投放數(shù)量、菌株定植特性與定植能力、水體微生物種類(lèi)與數(shù)量、水體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、水體理化指標(biāo)（如溶氧、溫度等）等多方面的影響。養(yǎng)殖中天氣、溫度、溶氧等環(huán)境因子改變均可導(dǎo)致上述因素改變，影響菌株的凈水能力。因此，篩選來(lái)源于養(yǎng)殖水體、降解效率高、起效快的有效發(fā)揮凈水作用的枯草芽孢桿菌菌株，對(duì)快速改善水質(zhì)，避免或緩解魚(yú)類(lèi)急性中毒，保障水產(chǎn)養(yǎng)殖安全具有重要意義。

本試驗(yàn)評(píng)價(jià)廣東海大集團(tuán)股份有限公司畜牧水產(chǎn)研究中心從養(yǎng)殖池塘中分離出的一株枯草芽孢桿菌在短時(shí)間對(duì)常規(guī)羅非魚(yú)養(yǎng)殖池塘水體的凈化效果，以期篩選快速、高效降解水體有害物質(zhì)的枯草芽孢桿菌菌株，為本土化微生物凈水產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)用枯草芽孢桿菌由廣東海大集團(tuán)股份有限公司畜牧水產(chǎn)研究中心動(dòng)保技術(shù)研究所從廣東海大集團(tuán)海鷗島基地養(yǎng)殖池塘中分離提供。正式試驗(yàn)前，用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，制備濃度約109cfu/mL 的應(yīng)用菌液，冷藏備用。

試驗(yàn)用水取自廣東海大集團(tuán)股份有限公司研究中心海鷗島研究基地的常規(guī)羅非魚(yú)暫養(yǎng)塘。試驗(yàn)開(kāi)始前，連續(xù)檢測(cè)池塘水質(zhì)指標(biāo)，至池水氨態(tài)氮（NH4+-N）含量為0.5007 mg/L，亞硝態(tài)氮（NO2--N）含量為0.0558 mg/L，化學(xué)需氧量（COD）6.9009 mg/L 時(shí)開(kāi)展試驗(yàn)。

試驗(yàn)前，將池水抽入24 個(gè)有效水體積250 L 循環(huán)水養(yǎng)殖缸內(nèi)，循環(huán)12 h，然后取水樣檢測(cè)，確保各養(yǎng)殖缸內(nèi)水質(zhì)指標(biāo)完全一致后，停止水體循環(huán)，改為靜水，微曝氣，開(kāi)始試驗(yàn)。整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，試驗(yàn)缸內(nèi)不放置底泥、魚(yú)類(lèi)等生物，不投餌。

1.2 方法

試驗(yàn)共設(shè)8 個(gè)處理組，分別量取0.25 mL（BS1）、1.25 mL（BS2）、2.5 mL（BS3）、12.5 mL（BS4）、25 mL（BS5）、62.5 mL（BS6）和125 mL（BS7）的應(yīng)用菌液，水體菌液終濃度分別為1×103cfu/mL、5×103cfu/mL、1×104cfu/mL、5×104cfu/mL、1×105cfu/mL、2.5×105cfu/mL 和5×105cfu/mL，每組3 個(gè)平行，以無(wú)添加組為空白對(duì)照（C 組）。試驗(yàn)進(jìn)行5 d。

試驗(yàn)期間，水溫保持在（29.2±0.6）℃，自然光照，微管曝氣。試驗(yàn)開(kāi)始后第1 d、2 d、3 d、4 d、5 d 的早上7：00，利用虹吸法在水面下方30 cm 處采集水樣，測(cè)定氨態(tài)氮（NH4+-N）含量、亞硝態(tài)氮（NO2--N）含量和化學(xué)需氧量（COD）。所取水樣保存在4℃冰箱待測(cè)，當(dāng)天測(cè)定完畢。

NH4+-N含量按照HJ 535-2009 標(biāo)準(zhǔn)采取納氏試劑分光光度法測(cè)定；NO2--N 含量按照GB 7493-87 標(biāo)準(zhǔn)采用N-（1-萘基）-己二胺分光光度法測(cè)定；COD 含量按照按GB 11892-89 標(biāo)準(zhǔn)采用酸式高錳酸鉀指數(shù)法測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，用SPSS（20.0）軟件進(jìn)行分析處理。數(shù)據(jù)經(jīng)齊性檢驗(yàn)（Homogeneity of variances）后，采用one-way ANOVA 方法做一元方差分析。若數(shù)據(jù)差異顯著，則進(jìn)行Duncan’s 多重比較（Duncan’s multiple range test），P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度枯草芽孢桿菌對(duì)水體NH4+-N含量的影響

由表1 可知，各組水體中NH4+-N含量均隨時(shí)間延長(zhǎng)而顯著上升至最高后下降（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)添加濃度≥1×105cfu/mL 組仍顯著高于初始水平（P＜0.05）。同一時(shí)間，添加劑量≥2.5×105cfu/mL時(shí)1 d 內(nèi)顯著降低水體NH4+-N含量（P＜0.05），隨后水體NH4+-N含量明顯反彈，前期降幅越大，后期反彈幅度越大（P＜0.05）。在同一取樣時(shí)間，對(duì)照組NH4+-N含量為基準(zhǔn)計(jì)算得到的去除率，表明高劑量添加下短期內(nèi)可有效去除水體NH4+-N，后期出現(xiàn)反彈（圖1）。

表1 不同濃度BS 對(duì)水體NH4+-N 含量的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n=3）Tab.1 Effect of different concentrations of BS on ammonia-nitrogen content in the water（Mean ± SE,n=3）/mg·L-1

圖1 各取樣時(shí)間點(diǎn)以對(duì)照組為基準(zhǔn)的NH4+-N去除率Fig.1 Removal rate of NH4+-N at each sampling time compared with the control group

2.2 不同濃度枯草芽孢桿菌對(duì)水體NO2--N含量的影響

由表2 可知，盡管各組水體NO2--N 含量均隨試驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)顯著升高（P＜0.05），以同一取樣時(shí)間對(duì)照組水體NO2--N 含量為基準(zhǔn)計(jì)算的去除率數(shù)據(jù)表明，該菌株添加濃度＞1×105cfu/mL 時(shí)具有明顯的劑量依賴(lài)降NO2--N 的作用（P＜0.05）。添加劑量5×105cfu/mL 對(duì)水體NO2--N 去除率可高出水體自?xún)裟芰Φ?5%（圖2）。

表2 不同濃度BS 對(duì)水體NO2ˉ-N含量的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n=3）Tab.2 Effect of different concentrations of BS on nitrite content in the water（Mean ± SE,n=3）/mg·L-1

圖2 各取樣時(shí)間點(diǎn)以對(duì)照組為基準(zhǔn)的試驗(yàn)組NO2--N去除率Fig.2 Removal rate of NO2--N at each sampling time compared with the control group

2.3 不同濃度枯草芽孢桿菌對(duì)水體COD 含量的影響

由表3 可知，對(duì)照組、添加劑量≤5×104cfu/mL組水體COD 含量于第2 d 即顯著降至最低（P＜0.05）。添加劑量≥1×105處理組水體COD 含量則在第2 d 顯著升至最高后又恢復(fù)至初始水平。同一取樣時(shí)間點(diǎn)添加劑量≤5×104cfu/mL 組水體中COD 含量無(wú)顯著差異（P＞0.05），添加劑量≥1×105cfu/mL 組水體COD 含量呈明顯劑量遞增（P＜0.05）。以同一取樣時(shí)間對(duì)照組水體COD 含量為基準(zhǔn)計(jì)算的去除率數(shù)據(jù)表明：該枯草芽孢桿菌各添加濃度對(duì)水體COD 無(wú)明顯去除作用（圖3）。

表3 不同濃度BS 對(duì)水體COD 含量的處理（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n=3）Tab.3 Effect of different concentrations of BS on COD content in the water（Mean ± SE,n=3）/mg·L-1

圖3 各取樣時(shí)間點(diǎn)以對(duì)照組為基準(zhǔn)的試驗(yàn)組COD 去除率Fig.3 Removal rate of COD at each sampling time compared with the control group

3 討論

3.1 不同濃度枯草芽孢桿菌對(duì)水體NH4+-N含量的影響

本試驗(yàn)中，各組水體中NH4+-N含量均出現(xiàn)短期升高的現(xiàn)象，推測(cè)是水體有機(jī)質(zhì)有氧氧化分解所致[9,10]。同一取樣時(shí)間點(diǎn)以對(duì)照組NH4+-N含量為基準(zhǔn)計(jì)算的去除率數(shù)據(jù)表明：添加劑量（≥2.5×105cfu/mL）時(shí)該菌株具有短期劑量依賴(lài)效應(yīng)去除水體NH4+-N含量的作用，隨后出現(xiàn)劑量依賴(lài)性反彈，推測(cè)是添加濃度≥2.5×105cfu/mL 時(shí)引起水體生物間競(jìng)爭(zhēng)性死亡、水體中增加的還原性物質(zhì)向NH4+-N轉(zhuǎn)化所致。本試驗(yàn)中，高濃度添加組（≥2.5×105cfu/mL）水體COD 含量于試驗(yàn)第2 d 顯著升高后下降，水體NH4+-N含量于第3 d 顯著上升也一定程度上說(shuō)明該菌添加初期導(dǎo)致水體還原性物質(zhì)增多，增多的還原性物質(zhì)向NH4+-N轉(zhuǎn)化，添加枯草芽孢桿菌后水體氨氮先下降后上升的現(xiàn)象，在其他研究中也有報(bào)道[11]?？莶菅挎邨U菌是具有高活性消化酶的需氧異養(yǎng)菌，無(wú)淤泥、無(wú)投餌等外源性有機(jī)質(zhì)輸入下高劑量添加勢(shì)必會(huì)引起水體微生物群落間的競(jìng)爭(zhēng)性改變和水體還原性物質(zhì)增多[11]。張念海[12]研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌的添加可競(jìng)爭(zhēng)性地抑制水體中某些優(yōu)勢(shì)藻類(lèi)的生長(zhǎng)。王月霞等[13]也發(fā)現(xiàn)，魚(yú)塘水體中色球藻Chroococcus 數(shù)量與芽孢桿菌添加量呈典型負(fù)相關(guān)。本試驗(yàn)?zāi)康氖菫榱藱z測(cè)該菌株的短期水質(zhì)凈化能力，故未對(duì)長(zhǎng)時(shí)間下水體微生物間的相互作用及其動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)進(jìn)行研究。

3.2 不同濃度枯草芽孢桿菌對(duì)水體NO2ˉ-N含量的影響

水體中NO2--N 能將魚(yú)類(lèi)血紅蛋白中的二價(jià)鐵氧化為三價(jià)鐵，損害血液的運(yùn)氧能力，引起魚(yú)類(lèi)窒息死亡[14,15]。有效控制水體中NO2--N 含量是決定養(yǎng)殖成敗的重要因素。本試驗(yàn)中，各組水體NO2--N呈上升趨勢(shì)，NH4+-N在升至最高后下降，說(shuō)明該菌株添加初期水體氨氧化引起的亞硝化占主導(dǎo)作用[16]。同一時(shí)間下，高劑量添加組（＞1×105cfu/mL）水體中NO2--N 含量呈現(xiàn)明顯劑量遞減效應(yīng)，添加濃度＞1×105cfu/mL 時(shí)該菌株對(duì)水體NO2--N 的清除效率比對(duì)照組高75%，表明一定劑量下該菌株具有明顯的降低NO2--N的作用。

枯草芽孢桿菌對(duì)水體NO2--N 的去除效果受菌株投放數(shù)量、菌株定植特性和能力、水體微生物種類(lèi)與數(shù)量、水體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量、溶氧、溫度等多因素的影響。朱長(zhǎng)生等[5]研究發(fā)現(xiàn)，潑灑復(fù)合芽孢桿菌菌劑（水體終濃度為1.5×104cfu/mL）后，短期（1 d）可有效降低水體NO2ˉ-N，7 d 后效果喪失；鄒文娟等[17]在水體中投放終濃度為0.25×105cfu/mL 的枯草芽孢桿菌后，水體中NO2--N含量前期顯著上升，7 d后下降；溫志新等[18]在刺參Apostichopus japoncus養(yǎng)殖水體中發(fā)現(xiàn)，未充氣狀態(tài)下，枯草芽孢桿菌對(duì)養(yǎng)殖廢水中的氨氮和亞硝酸鹽無(wú)有效去除作用；王月霞等[13]發(fā)現(xiàn)，池塘水體溶氧量上升至6 mg/mL時(shí)，所用枯草芽孢桿菌才有明顯去除水體NO2--N的效應(yīng)；湯寶貴等[19]在對(duì)蝦養(yǎng)殖池的凈化研究中發(fā)現(xiàn)，添加1.04×105～2.08×105cfu/mL 芽孢桿菌，短時(shí)間（≤24 h）內(nèi)可顯著降低水體NO2--N的含量，但隨著時(shí)間延長(zhǎng)劑量相關(guān)效應(yīng)消失。也有研究發(fā)現(xiàn)，簡(jiǎn)單水體中添加過(guò)量枯草芽孢桿菌會(huì)導(dǎo)致水體負(fù)荷增大，影響水體生態(tài)平衡，不利于發(fā)揮凈水作用[12]，水體氧氣不足或水體添加濃度過(guò)高，均會(huì)導(dǎo)致菌種密度、水體空間和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的制約效應(yīng)，抑制其對(duì)水體氨氮和NO2--N的去除作用。本實(shí)驗(yàn)中，該菌株添加量為5×105cfu/mL 時(shí)，降NO2--N效果顯著高于湯寶貴等[19]、溫志新等[18]研究中所用菌株，與朱長(zhǎng)生等[5]所用復(fù)合芽孢桿菌菌劑效果相當(dāng)。總體而言，本試驗(yàn)所用菌株可作為快速有效降低水體NO2--N含量的目標(biāo)菌株，但尚需與其他有效降低水體NH4+-N 和COD 的產(chǎn)品進(jìn)行配伍，以更好地發(fā)揮凈水作用。

3.3 不同濃度枯草芽孢桿菌對(duì)水體COD 含量的影響

本試驗(yàn)中，試驗(yàn)期間對(duì)照組水體COD 含量持續(xù)降低，說(shuō)明水體具有一定的自?xún)糇饔?，是水體自養(yǎng)型生物同化和異養(yǎng)型生物分解作用的共同體現(xiàn)[20 ]。

同一取樣時(shí)間添加濃度≤5×104cfu/mL 組水體COD 含量與對(duì)照組無(wú)顯著差異，說(shuō)明低濃度該菌株（≤5×104cfu/mL）下水體自?xún)糇饔谜贾鲗?dǎo)因素；高劑量（≥1×105cfu/mL）添加時(shí)，試驗(yàn)第2 d 水體COD 含量明顯呈劑量依賴(lài)上升效應(yīng)，是高濃度添加導(dǎo)致水體還原性物質(zhì)短期快速增多所致。從時(shí)間上看，添加劑量≥1×105cfu/mL 組水體中COD 先迅速上升至最高又迅速下降至初始水平，說(shuō)明該菌株具有一定的COD 清除能力。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，BS6 和BS7 組水體COD 含量仍高于同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組水體COD 含量，推測(cè)應(yīng)是試驗(yàn)周期短所致。添加一定濃度枯草芽孢桿菌時(shí)，水體COD 含量先升后降與劉樹(shù)彬等[21]評(píng)價(jià)枯草芽孢桿菌HAINUP40 對(duì)養(yǎng)殖廢水中COD 的去除趨勢(shì)一致。

3.4 結(jié)論

本試驗(yàn)所用枯草芽孢桿菌菌株添加量為2.5×105～5×105cfu/mL 時(shí)，可在短期內(nèi)有效降低養(yǎng)殖水體中NO2－-N 含量，對(duì)去除水體NH4+-N含量和COD 也有一定效果，故該菌株可作為有效去除水體NO2－-N的目標(biāo)菌株，但因枯草芽孢桿菌是嚴(yán)格的需氧型異養(yǎng)菌，添加的芽孢桿菌直接參與到水體微生物群落間的相互競(jìng)爭(zhēng)中，短期內(nèi)易造成水體中還原性物質(zhì)增多，故使用該菌株應(yīng)與其他能有效去除水體NH4+-N和COD 的菌株配合使用。