胡欣雨 姚暉 夏冬 Sami UL Haq Niazi

在我國，胃癌的發(fā)病率僅次于肺癌，死亡率排第3位，全球每年胃癌新發(fā)病例約120萬，中國約占40%。早期胃癌病人的生存率能達(dá)到90%，但早期胃癌缺乏特異性癥狀與體征,導(dǎo)致其早期檢出率較低。我國早期胃癌的檢出率僅10% 左右,嚴(yán)重影響病人的預(yù)后[1]。有研究表明，腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移與病人的預(yù)后密切相關(guān)，取決于腫瘤遷移和侵襲中信號通路的失調(diào)。Rap蛋白(Ras-associated-Protein)是小GTP酶Ras家族中的一員，參與細(xì)胞黏附、細(xì)胞連接、侵襲、遷移等功能，同時又是細(xì)胞信號傳遞過程中多個信號通路交叉點的關(guān)鍵分子[2]。Rap鳥苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factors,GEFs)可從無活性的Rap1蛋白釋放GDP，結(jié)合GTP從而激動Rap蛋白，促進(jìn)其后續(xù)活化。Crk蛋白通過介導(dǎo)蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成在細(xì)胞信號通路中發(fā)揮重要作用，并已在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)其過表達(dá)促進(jìn)了細(xì)胞的擴散及侵襲[3]，其中C3G(Crk SH3-domain-binding guanine-nucleotide exchange factor)就是最普遍表達(dá)的Rap鳥苷酸交換因子。有研究表明，在腫瘤中C3G基因存在的一些突變與病人存活率的降低有關(guān)[4]。來自不同的公共基因數(shù)據(jù)庫的信息顯示，C3G表達(dá)水平在胃癌中有所增加。C3G可能可以作為一種新的胃癌診斷、預(yù)后標(biāo)志以及一個新的治療靶點。我們通過國外公共信息大數(shù)據(jù)分析C3G蛋白在胃癌組織及正常組織中的表達(dá)，采用免疫組化分析檢測胃癌及癌旁組織中C3G的表達(dá)并分析其相關(guān)臨床、病理資料，了解胃癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后是否與C3G的表達(dá)有相關(guān)性，探討C3G在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程的作用。

對象與方法

一、對象

2012年12月～2015年12月我院就診的符合納入標(biāo)準(zhǔn)的胃癌病人121例。男性62例，女性59例；年齡≥60歲66例，<60歲55例；中-高分化腺癌76例，低分化腺癌45例；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移64例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移57例；浸潤深度T1-2 49例，T3-4 72例。收集所有符合納入標(biāo)準(zhǔn)的胃癌病人的癌組織及癌旁組織(距離病灶組織距離至少5 cm以上的正常胃黏膜組織)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)一般臨床資料及病理資料均保存完整；(2)術(shù)前均未接受放療、化療及生物治療輔助治療手段；(3)未合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤；(4)手術(shù)方式為根治性切除術(shù)，術(shù)后病檢確診為胃癌；(5)術(shù)后接受常規(guī)隨訪，未失聯(lián)。

二、方法

1.C3G的表達(dá)采用免疫組化法。病理組織蠟塊經(jīng)資深病理醫(yī)師閱片確認(rèn)后切片、烤片，用二甲苯常規(guī)脫蠟、水化，置于EDTA緩沖液中微波修復(fù)，5%BSA(牛血清白蛋白)封閉后加入一抗，4 ℃過夜，PBS溶液清洗后滴加相應(yīng)種屬的二抗，37 ℃孵育，其后每片加入50～100 ml DAB溶液，顯色完全沖洗后蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，再次沖洗后氨水反藍(lán)，流水沖洗，經(jīng)過梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。顯微鏡下閱片，每張切片中含有的正常胃黏膜、炎性細(xì)胞等作為內(nèi)對照，先使用低倍鏡，后用高倍鏡。結(jié)果判定：C3G陽性細(xì)胞為位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的棕黃色顆粒或團(tuán)塊，且觀察不少于5個高倍鏡視野。當(dāng)陽性染色的細(xì)胞≤10%時定為陰性表達(dá)，即弱表達(dá)；>10%為陽性表達(dá)。使用Image J軟件計算其陽性面積及IOD值，分析所選病例癌組織及癌旁組織平均光密度(IOD/area)。

2.基因數(shù)據(jù)庫分析：登陸Oncomine數(shù)據(jù)庫(https://www.oncomine.org/)獲取權(quán)限后按以下數(shù)據(jù)檢索條件進(jìn)行檢索：(1)Gene:C3G(RapGEF1)；(2)Analysis Type:CANCER vs NORMAL；(3)Cancer Type:gastric cancer。以上篩選條件均設(shè)置為p-Value:1E-4；Fold Change。

3.隨訪：采用電話與臨床查閱病歷的方式隨訪，記錄所納入研究的病人生存時間，隨訪日期截止至2020年8月10日，平均隨訪時間為55.10個月。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié)果

1.基因數(shù)據(jù)庫結(jié)果：根據(jù)檢索條件搜索到6個數(shù)據(jù)集，篩選符合條件的研究數(shù)據(jù)(排除胃腸道腫瘤類別)。薈萃分析表明，與正常組織比較，C3G在胃癌組織中表達(dá)高于正常組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 Oncomine數(shù)據(jù)庫中C3G在胃癌組織及癌旁組織中表達(dá)的薈萃分析

2.免疫組化染色：在胃癌及癌旁組織中，C3G蛋白陽性表達(dá)率分別為70%(112/160)及31.25%(50/160)。計算其平均光密度(IOD/area)，C3G在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)為(0.108±0.025)，在癌旁組織中表達(dá)為(0.059±0.017)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，證明C3G在胃癌組織中呈高表達(dá)。見圖2、圖3。

A：癌旁組織C3G陽性(蘇木素染色×400)；B：癌旁組織C3G陰性(蘇木素染色×400)；C：胃癌組織C3G陽性(蘇木素染色×400)；D：胃癌組織C3G陰性(蘇木素染色×400)

圖3 C3G蛋白在胃癌組織及癌旁組織表達(dá)結(jié)果

3.C3G蛋白表達(dá)與胃癌病人預(yù)后的關(guān)系 ：隨訪結(jié)果顯示，截至2020年8月10日，C3G蛋白陽性表達(dá)68例，死亡30例，存活38例；C3G蛋白表達(dá)陰性53例，死亡8例，存活45例。通過Kaplan-Merier生存曲線分析，C3G蛋白陰性表達(dá)組平均生存時間為58.1個月(95%CI：56.2～59.9)，C3G蛋白陽性表達(dá)組平均生存時間為53.7個月(95%CI：51.3～56.1)，C3G蛋白陽性表達(dá)組生存結(jié)局劣于C3G蛋白陰性表達(dá)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 胃癌病人C3G蛋白陽性表達(dá)與陰性表達(dá)的總生存曲線

4.終點事件：以隨訪結(jié)束時，病人是否死亡為因變量，以C3G蛋白表達(dá)情況、年齡、性別、腫瘤浸潤深度、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移為自變量，通過χ2檢驗可知，與存活組比較，死亡組女性偏多，腫瘤浸潤深、分化程度高、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、C3G蛋白陽性表達(dá)的病人所占比例較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 存活組與死亡組臨床、病理資料對比(例，%)

5.胃癌組織中C3G蛋白陽性表達(dá)與病人臨床資料的關(guān)系： 單因素分析顯示，性別、C3G蛋白陽性表達(dá)、腫瘤浸潤深度及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移是為影響胃癌病人死亡的獨立危險因素(P<0.05)。根據(jù)單因素分析的結(jié)果進(jìn)一步納入風(fēng)險比例回歸模型分析，結(jié)果表明，蛋白的陽性表達(dá)、胃癌腫瘤浸潤深度及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移仍是有意義(P>0.05)。見表2、表3。

表2 影響胃癌病人死亡的單因素Cox分析

表3 影響胃癌病人死亡因素的多因素Cox分析

討論

C3G，也稱RapGEF1，作為Ras大家族中重要成員，如Rap1及R-Ras的鳥苷酸核酸因子[5]，在癌癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。有研究表明，Rap 1通過抑制小GTP結(jié)合蛋白Ras到c-Raf-1的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來抑制促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路的活化[6-7]，也可以通過B-Raf蛋白激活MAPK級聯(lián)反應(yīng)，同時也激活MAPK蛋白家族的其他成員，所以Rap1可以在不同的細(xì)胞環(huán)境中促進(jìn)或抑制其生長。C3G在癌癥中既有抑制癌癥的發(fā)生發(fā)展的作用，亦有促進(jìn)癌細(xì)胞增殖作用[4-9]。在小鼠的成纖維細(xì)胞中，外源性的C3G的過表達(dá)通過介導(dǎo)sis、ras和v-raf等致癌基因的活化和共轉(zhuǎn)染來抑制其錨定非依賴性生長而作為抑癌基因[10]；卵巢癌中通過C3G/Rap1通路促進(jìn)MMP-2、MMP-9的分泌,增強細(xì)胞浸潤能力[11]；在腎小球腎炎中增強腎小球上皮細(xì)胞的遷徙而抑制高侵襲性乳腺癌細(xì)胞[12-15]；宮頸癌中通過上游調(diào)控序列頻繁甲基化減少C3G表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞的增殖[16-20]；肝臟中低水平的C3G可能會促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲[21]；在非小細(xì)胞肺癌中，內(nèi)源性的C3G的上調(diào)及過表達(dá)可通過影響CRK-Rap1信號通路來發(fā)揮致癌作用[22]。

DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的基因表觀修飾方式之一，可參與癌癥的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移[23]。檢索生物信息數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，在胃癌及癌旁組織中，C3G表達(dá)在癌組織中較正常組織高表達(dá)且具有統(tǒng)計學(xué)意義。有研究表明，在胃癌中基因組序列band CA-8主要表現(xiàn)為去甲基化，其定位于C3G的第一個內(nèi)含子的酶切位點NotI上(GeneID:2889,chr 9q34.3)，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與C3G內(nèi)含子序列發(fā)生頻繁去甲基化有關(guān)。有研究表明，腫瘤的預(yù)防和治療可通過去甲基化恢復(fù)某些關(guān)鍵的抑癌基因或DNA修復(fù)基因的活性這一手段來達(dá)到[24-25]。因此，C3G蛋白的表達(dá)可能成為評估罹患胃癌風(fēng)險及胃癌治療的指標(biāo)。

結(jié)合既往研究可知，C3G對細(xì)胞的生長、分化、增殖、遷移等有一定的作用，但其在胃癌細(xì)胞中的具體作用尚不明確。本研究結(jié)合免疫組化的結(jié)果及臨床病理資料的分析，胃癌組織中C3G蛋白呈高表達(dá)，且C3G蛋白陽性表達(dá)病人生存時間明顯低于陰性表達(dá)組，分析影響胃癌病人預(yù)后的單因素、多因素COX風(fēng)險比例回歸模型，C3G蛋白的表達(dá)為影響胃癌病人預(yù)后的獨立危險因素，與其他學(xué)者在卵巢癌及肝癌中的發(fā)現(xiàn)一致[4,7]。綜合研究結(jié)果表明，C3G蛋白可能參與腫瘤的分化、侵襲、遷徙等過程，并且能在一定程度上反應(yīng)腫瘤的惡性程度。C3G的高表達(dá)可成為病人不良預(yù)后的因素之一，但具體如何參與了細(xì)胞的增殖、遷移等過程尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，C3G在胃癌組織中表達(dá)較正常組織上調(diào)，對胃癌的發(fā)生發(fā)展具有一定的促進(jìn)作用，其高表達(dá)病人預(yù)后生存周期較低。C3G可能成為胃癌的治療、預(yù)后監(jiān)測指標(biāo)之一。