龔 平，陳 嫻，李詠梅，曾 艷，唐冰璇，蔣海燕，劉冬華，伍善東

（湖南省微生物研究院，湖南 長沙 410009）

植物內生菌（Plant endophyte）是指能夠定殖在植物組織內部，對宿主植物不造成任何感染或負面影響的一類微生物。植物內生菌對宿主植物的已知有益作用有固氮作用、促進植物生長、增強抗逆性、抗病原真菌及細菌能力等?；谥参飪壬@些有益作用，其可作為優(yōu)良的潛在生防資源和外源基因載體。近年來，隨著人類環(huán)境保護意識的增強，綠色農業(yè)的興起，內生菌已逐漸成為國內外研究的熱點[1-7]。湖南省微生物研究院前期在對從油菜植株中分離得到的內生菌進行功能篩選時，發(fā)現一株優(yōu)秀內生菌株4-3，該菌株不僅具有很強的拮抗菌核病核盤病菌的能力，還具有優(yōu)良的溶磷解鉀的功能，具有良好的應用前景。試驗對內生菌4-3的培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，以期為該菌株的進一步研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 內生菌株4-3為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），油菜內生菌，由課題組分離、篩選，該菌株具有很強的拮抗菌核病核盤病菌的能力，還具有優(yōu)良的溶磷解鉀的功能。保藏編號為CCTCC M NO:2014320。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA加富培養(yǎng)基：20%土豆（煮汁），2.0%葡萄糖，0.2%酵母膏，0.05%硫酸鎂，0.1%磷酸二氫鉀，1.8%瓊脂，pH值7.0，用于菌株4-3斜面培養(yǎng)與活化；PDA液體培養(yǎng)基：20%土豆（煮汁），2.0%蔗糖，0.2%酵母膏，0.1%硫酸鎂，0.2%磷酸二氫鉀，pH值7.0，用于菌株4-3液體培養(yǎng)。

1.2 試驗方法

1.2.1 活菌計數方法 吸取試驗菌液5 mL至裝有玻璃珠、45 mL無菌水的錐瓶中，180 r/min震蕩30 min，吸取震蕩好的菌液0.5 mL至4.5 mL無菌蒸餾水中進行稀釋至8階(含三角瓶稀釋的一階)。每次吸取前均將稀釋菌液在振蕩器上振蕩1分鐘，隨后倒序吸取0.5 mL稀釋菌液于滅過菌的平皿中；平行3皿。然后倒入已經融化好的滅菌的PDA固體培養(yǎng)基(約40～45℃)20 mL左右。充分搖勻，待其完全冷卻后倒置；30℃恒溫培養(yǎng)48 h進行活菌計數。

1.2.2 培養(yǎng)溫度的優(yōu)化 按 2% 的接種量將菌株4-3種子液轉接至 100 mL PDA液體培養(yǎng)基，分別置于20、24、28、32、36℃搖床上發(fā)酵培養(yǎng)48 h，按1.2.1方法測定發(fā)酵液的活菌數，確定最佳培養(yǎng)溫度。每個處理3個重復。

1.2.3 最佳初始pH值的優(yōu)化 調節(jié)基礎培養(yǎng)基的初始pH為 6.0、6.4、7.0、7.2、7.6、8.0，其他條件同1.2.2，在最佳培養(yǎng)溫度條件下發(fā)酵培養(yǎng)48 h。測定發(fā)酵液中的活菌數，確定最佳初始pH值。每個處理3個重復。1.2.4 最佳接種量的確定 在最佳培養(yǎng)溫度和初始pH 值條件下，分別按 1%、2%、3%、4%、5% 接種，發(fā)酵培養(yǎng)48 h，測定發(fā)酵液中的活菌數，確定最佳接種量。每個處理3個重復。

1.2.5 液體培養(yǎng)搖床轉速的確定 在最佳培養(yǎng)溫度和初始 pH 值條件下，以3%的初始接種量接種菌株4-3，放到不同轉速的搖床上培養(yǎng)，轉速分別調為 160、180、200、220、240 r/min；其余條件不變。按前述的實驗方法進行活菌計數。每個處理3個重復。

1.2.6 培養(yǎng)時間的優(yōu)化 在最佳培養(yǎng)溫度和初始 pH值條件下，以3%的初始接種量接種菌株4-3，培養(yǎng)轉速220 r/min ；其余條件不變。發(fā)酵時間分別調為40、44、48、52、56、60和 64 h，按前述的實驗方法進行活菌計數。每個處理3個重復。

2 結果與分析

2.1 最佳培養(yǎng)溫度的確定

分別在 20～36℃溫度條件下對菌株 4-3培養(yǎng) 48 h，如圖1所示，不同培養(yǎng)溫度對菌株4-3 的活菌量有較大影響，該菌株在20～36℃均可生長，但低于24℃時長勢不佳，但在28～36℃條件下活菌數均超過 108CFU/mL，其中當溫度為 32℃時達到1.99×108CFU/mL，活菌數最高。故可認為菌株4-3 的最佳培養(yǎng)溫度為 32℃。

圖1 培養(yǎng)溫度對菌株4-3生長的影響

2.2 最佳初始pH值的確定

分別在初始pH值為6.0、6.4、7.0、7.2、7.6、8.0的條件下對菌株4-3進行培養(yǎng)，如圖2所示，菌株4-3在pH值6.4～8.0范圍內生長較好，說明該菌株有一定的耐酸、堿能力。其中在 pH值7.0～7.2 時菌體生長量較高，因此，將初始 pH 值設定為7.2，此條件下菌株4-3活菌數最高，達到1.65×108CFU/mL。

圖2 初始pH值對菌株4-3生長的影響

2.3 初始接種量的確定

如圖3所示，當接種量為1%～5% 時，菌株4-3活 菌 數 分 別 為 1.22×108、1.71×108、2.12×108、2.29×108、2.18×108CFU/mL。隨著接種量的增加，菌株4-3的活菌數呈上升趨勢；但當接種量超過3%時，活菌數增加不明顯，并且接種量過大，或導致培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的過度消耗所引起活菌數下降，因此選擇 3% 作為菌株4-3的最佳接種量。

圖3 接種量對菌株4-3生長的影響

2.4 最佳培養(yǎng)轉速的確定

當培養(yǎng)轉速為 160～220 r/min 時，隨著轉速的增加，菌體生長量逐漸增加，并且在220 r/min時達到最大值。當轉速超過220 r/min 時，菌體生長量明顯下降，說明轉速太高不利于菌株生長，可能是由于高轉速導致菌體細胞機械損傷而影響其生長，或引起菌體自溶，從而導致活菌數降低。因此，選擇 220 r/min作為液體培養(yǎng)菌株4-3的最適轉速（圖 4）。

圖4 培養(yǎng)轉速對菌株4-3生長的影響

2.5 最適培養(yǎng)時間的確定

從圖5可以看出，菌株4-3在培養(yǎng)40～64 h 時，菌體生長量整體維持在一個穩(wěn)定并且較高的水平；在40～56 h，隨著時間的增加，4-3菌體活菌數呈現增長的趨勢，并在 56 h 時到達最大值；在 56～64 h，隨著時間的延長，菌體生長量呈下降趨勢，可能是由于營養(yǎng)物質的消耗和代謝物的產生導致菌體生長速度變緩，綜合以上結果，確定 56 h 為 4-3 菌株最佳培養(yǎng)時間。

圖5 培養(yǎng)時間對菌株4-3生長的影響

3 結論與討論

對一株優(yōu)秀內生菌株4-3的培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化。優(yōu)化后的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度 32℃，初始pH值7.2，培養(yǎng)轉速220 r/min，接種量3% ，培養(yǎng)56 h，該條件下可獲得較高濃度的菌體。

內生菌株4-3具有很強的拮抗菌核病核盤病菌的能力。核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）是一種廣譜性病原真菌，由其引起的菌核病是油菜的主要病害之一。在中國，菌核病可引起油菜減產10%～80%[7-8]；目前，在生產上以選擇抗病品種和化學藥劑進行防治，但存在抗病品種資源缺乏，以及化學藥劑污染農產品和環(huán)境等問題，而生物防治具有對環(huán)境污染小、成本低、作用持久等優(yōu)點，越來越受到人們的重視，因而內生菌4-3具有潛在的巨大應用價值。此外，內生細菌4-3還具有優(yōu)良的溶磷解鉀的功能，制成生物菌肥，能減少化肥的使用量，因此內生菌4-3在發(fā)展我國綠色農業(yè)方面具有巨大的應用前景。要將內生菌4-3制成生物產品，進行工業(yè)化生產，就必須確定其最佳發(fā)酵條件。研究對該菌株液體發(fā)酵條件進行優(yōu)化，將為其應用推廣提供有效數據，能有效降低未來生產成本。不過，內生菌4-3與宿主植物體聯合代謝產生更優(yōu)生理特性的具體機制有待進一步研究。