姜雪琴，劉 禮，李 昊，何陽(yáng)森，呂沐瀚，吳建明，梁思成，詹會(huì)智，齊曉怡

（1.西南醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，四川 瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，四川 瀘州 646000；3.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 皮膚科，四川 瀘州 646000；4.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 胸外科，四川 瀘州 646000）

熒光染料具有良好的發(fā)光特性，被廣泛運(yùn)用于生物學(xué)研究以及疾病診療，例如，蛋白標(biāo)記、核酸檢測(cè)、免疫分析以及水質(zhì)污染物的監(jiān)測(cè)等。細(xì)胞內(nèi)pH值的變化與腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生密切相關(guān)［1］。近年來(lái)，基于不同熒光團(tuán)的pH熒光探針（如姜黃素、半花菁、萘等）已有報(bào)道［2－4］。但這些探針存在選擇性較差、Stokes位移小等缺點(diǎn)，導(dǎo)致實(shí)際樣品檢測(cè)困難［5－7］。

香豆素類化合物是一種以苯并吡喃酮結(jié)構(gòu)為骨架，具有光學(xué)特性突出、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)的化合物，在熒光增白劑［8］、熒光染料［9］和非線性光學(xué)材料中應(yīng)用廣泛［10］。據(jù)報(bào)道，在香豆素3位引入苯并咪唑雜環(huán)，能增加分子內(nèi)共軛體系的穩(wěn)定性，使發(fā)射波長(zhǎng)紅移、熒光強(qiáng)度增強(qiáng)［11］。而對(duì)于細(xì)胞內(nèi)pH值的檢測(cè)，7-羥基香豆素（pKa=7.50 ）可能為優(yōu)選結(jié)構(gòu)［12］。結(jié)合羥基香豆素和苯并咪唑結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，本研究組前期設(shè)計(jì)合成的一種新型pH探針（3-苯并咪唑-7-羥基香豆素）在pH6.50 ～8.30 范圍內(nèi)具有良好的線性（pKa=7.20 ），可作為一種優(yōu)良的熒光探針，選擇性地感知線粒體pH值的變化［13］。但需要指出的是，線粒體偏弱堿性，其pH值與細(xì)胞功能密切相關(guān)，線粒體自噬和細(xì)胞凋亡通常與線粒體酸化有關(guān)。例如，與野生型膠質(zhì)細(xì)胞相比，帕金森病的膠質(zhì)細(xì)胞中線粒體的pH值偏酸性［14］?；诖耍拘〗M對(duì)3-苯并咪唑-7-羥基香豆素進(jìn)一步改造：根據(jù)分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）原理在苯并咪唑基團(tuán)上引入甲氧基基團(tuán)，增加電子云密度，降低吸電子能力；同時(shí)通過改變體系中分子電荷的轉(zhuǎn)移能力，使探針激發(fā)態(tài)比基態(tài)更具極性。ICT感應(yīng)探頭羥基對(duì)pH值具有高敏感性，可觀察到熒光探針發(fā)生紅移現(xiàn)象［15－16］。本研究合成了一種對(duì)pH值敏感的香豆素?zé)晒馊玖?-（6-甲氧基-1H-苯并咪唑）-7-羥基香豆素（BC），通過熒光和紫外?可見吸收光譜、pKa、探針穩(wěn)定性和選擇性以及熒光成像實(shí)驗(yàn)，明確了探針的熒光屬性，并利用密度泛函理論計(jì)算研究了探針的香豆素羰基和苯并咪唑基是否存在激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移（ESIPT）過程，為生物醫(yī)學(xué)研究和應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

質(zhì)譜測(cè)定采用X500R QTOF－SCIEX高分辨質(zhì)譜儀（美國(guó)SCIEX公司），在Bruker AMX－400（德國(guó)BRUKER公司）上獲得1H NMR（400MHz）和13C NMR（100MHz）光譜；18.2 MΩ·cm超純水采用Milli-Q超純水儀（美國(guó)MILLIPORE公司）制備；pH值測(cè)定使用PHS－3E型精密pH計(jì)（中國(guó)上海INESA公司）；熒光和紫外－可見吸收光譜測(cè)定采用Cytation3細(xì)胞成像多功能微孔板檢測(cè)儀（美國(guó)BIOTEK公司）；細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)所用儀器為尼康Ts2R－LS顯微鏡（北京SUNJOY公司）。

2，4-二羥基苯甲醛、氰乙酸乙酯、4-甲苯-1，2-二胺、苯甲酸以及各種金屬離子硝酸鹽購(gòu)于中國(guó)成都科隆化學(xué)品有限公司，氨基酸購(gòu)于成都潤(rùn)澤本土化工有限公司；丁醇購(gòu)于廣州文度科學(xué)儀器有限公司；乙醇購(gòu)于上海吉至生化科技有限公司。以上所用試劑均為分析純，如無(wú)特殊說明未進(jìn)一步純化。

1.2 探針BC的合成與表征

將2，4-二羥基苯甲醛（0.56 g，4.0 mmol）、氰乙酸乙酯（0.56 g，5.0 mmol），4-甲苯-1，2-二胺（0.16 g，1.3 mmol）和苯甲酸（0.05 g，0.44 mmol）的混合物分別溶于10mL丁醇中，回流約12h，所得混合物室溫下冷卻，過濾并收集沉淀。沉淀經(jīng)乙醇再結(jié)晶，得到深黃色到淺棕色的固體化合物（BC），真空干燥，得到BC0.37 g，得率98.4 %。BC的1H NMR數(shù)據(jù)為：1H NMR（400MHz，DMSO）：δ12.35（s，1H），8.98 （s，1H），8.36 （s，1H），7.83 ～7.81 （d，J=8Hz，1H），7.55 ～7.53 （d，J=8Hz，1H），7.17 ～7.16 （d，J=4Hz，1H），6.92 ～6.85 （m，3H），3.80 （s，1H）；BC的13C NMR數(shù)據(jù)（ppm）：163.2 、161.8 、160.3 、156.2 、146.7 、143.4 、143.2 、135.1 、131.5 、118.6 、115.2 、113.7 、112.2 、112.1 、108.2 、102.3 、55.8 。HR－MS（ESI）正離子模式下測(cè)定化合物（C17H13N2O4+）分子量為309.0805 ，接近理論值309.0813 。熒光探針BC的合成路線如圖1所示。

圖1 3-苯并咪唑-7-羥基香豆素（BHC）和3-（6-甲氧基-1H-苯并咪唑）-7-羥基香豆素（BC）的合成Fig.1 Synthesis of3-benzimidazole-7-hydroxycoumarin（BHC）and3-（6-methoxy-1H-benzimidazole）-7-hydroxycoumarin（BC）

1.3 BC溶液的制備與檢測(cè)

將化合物BC溶解于二甲基亞砜（DMSO），超聲處理5min后，配制成探針儲(chǔ)液（20mmol/L），臨用前稀釋成工作溶液。pH值滴定實(shí)驗(yàn)中，采用Britton－Robinson（B－R）緩沖液（由40mmol/L的磷酸、硼酸和醋酸混合而成，實(shí)際pH值通過加入一定量的0.2 mol/L氫氧化鈉或鹽酸進(jìn)行調(diào)節(jié)）將BC儲(chǔ)液稀釋至10μmol/L。此外，所有實(shí)驗(yàn)均在含1% DMSO溶液的條件下進(jìn)行，測(cè)定前將稀釋的BC儲(chǔ)液平衡5min。吸收光譜和熒光光譜在室溫下進(jìn)行測(cè)定，且激發(fā)波長(zhǎng)（λex）為420nm，發(fā)射波長(zhǎng)（λem）為490nm，狹縫寬度設(shè)置為5nm。

1.4 HeLa細(xì)胞的培養(yǎng)與成像研究

以HeLa細(xì)胞（細(xì)胞株由西南醫(yī)科大學(xué)藥劑實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送）為模型，將細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/鏈霉素（100U/mL）的改良培養(yǎng)基（DMEM）中，在含5% CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：將細(xì)胞接種于96孔板中，24h后加入不同濃度的BC，繼續(xù)培養(yǎng)24h后棄去培養(yǎng)基，加入CCK－8檢測(cè)試劑孵育1h。待指定時(shí)間和溫度時(shí)，使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸收值，計(jì)算得到BC在不同濃度下的細(xì)胞活性值。

細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)：將細(xì)胞以1.5 ×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在直徑為20mm的圓形玻璃培養(yǎng)皿中，置于含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，棄去培養(yǎng)液后加入含BC的新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)一定時(shí)間后棄去培養(yǎng)基并用PBS（pH7.4）清洗細(xì)胞3次，采用熒光成像顯微鏡觀察拍照。

1.5 密度泛函理論計(jì)算

為了研究化合物BC的香豆素羰基和苯并咪唑基是否存在ESIPT過程，基于已有報(bào)道［17］，借助Gaussian09軟件，使用6－31G的B3LYP交換泛函，對(duì)其進(jìn)行密度泛函理論（DFT）計(jì)算。優(yōu)化后的結(jié)構(gòu)滿足局部能量最小。

2 結(jié)果與討論

2.1 BC的熒光性質(zhì)

2.1.1 熒光光譜及紫外－可見吸收光譜香豆素本身無(wú)熒光，通過在香豆素環(huán)上引入基團(tuán)可構(gòu)建推－拉電子體系，如在母核上引入甲氧基－苯并咪唑雜環(huán)會(huì)改變咪唑環(huán)電子云密度，導(dǎo)致其發(fā)射波長(zhǎng)紅移，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。從BC隨pH值變化的紫外?可見吸收光譜（圖2A）和熒光光譜（圖2B）可以看出，BC的最大紫外吸收峰和發(fā)射峰分別在420nm和490nm處最明顯；在pH10.0 的堿性條件下，BC的最大吸收波長(zhǎng)（λabs）位于420nm，發(fā)射波長(zhǎng)位于490nm；隨著pH值的降低，420nm處的吸收峰和490nm處的發(fā)射峰明顯降低，且在pH5.5 時(shí)達(dá)到最低，幾乎觀察不到吸收峰和熒光發(fā)射峰。值得注意的是，在pH值由5.5 升至10.0 的過程中，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)了15倍。此外，在偏堿性條件下，Stokes位移明顯增加。說明BC對(duì)pH值的變化敏感，有望進(jìn)一步應(yīng)用于生物體內(nèi)pH值的變化監(jiān)測(cè)。

圖2 BC（10μmol/L）在B－R緩沖溶液中的紫外－可見吸收光譜（A）和熒光光譜（B）Fig.2 UV－Vis absorption spectra（A）and fluorescence spectra（B）of BC（10μmol/L）in B－R buffer solution

2.1.2 pKa的測(cè)定線粒體基質(zhì)的pH值呈現(xiàn)堿性（～8.0 ），其pH值的輕微改變將嚴(yán)重影響生理機(jī)能，關(guān)鍵官能團(tuán)pKa的測(cè)定是研究探針pH值依賴行為的關(guān)鍵。目前已開發(fā)出一些pKa呈弱堿性的熒光探針［18－19］用于線粒體pH值的監(jiān)測(cè)。

本研究測(cè)定了探針在pH5.5 ～10.0 ，激發(fā)波長(zhǎng)為420nm，發(fā)射波長(zhǎng)為490nm處的熒光強(qiáng)度。如圖3A所示，對(duì)探針在λem=490nm處的熒光強(qiáng)度進(jìn)行Sigmoidal曲線擬合，并繪制校正曲線。結(jié)果顯示，該探針的pKa值為8.36 ，相關(guān)系數(shù)（r2）為0.9815 。這一良好的線性關(guān)系表明熒光探針的pKa與pH值范圍能很好地匹配，且該探針在pKa附近有可用的、良好的pH值響應(yīng)范圍（pH7.8 ～9.0 ）。

圖3 BC（10μmol/L）熒光強(qiáng)度隨pH值變化的Sigmoidal擬合曲線（A），BC在pH5.5 和pH10.0 B－R緩沖液中的穩(wěn)定性（B）、可逆熒光變化（C）以及溫度的影響（D）Fig.3 Sigmoidal fitting of the fluorescence intensity for10μmol/L BC（A），as well as stability（B），reversible fluorescence changes（C）of BC in B－R buffer solutions at pH5.5 and pH10.0 ，and effect of temperature（D）

2.1.3 光學(xué)穩(wěn)定性與可逆性研究本研究通過監(jiān)測(cè)探針2h內(nèi)熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化測(cè)定了BC的光學(xué)穩(wěn)定性。由圖3B可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，檢測(cè)體系的熒光信號(hào)在pH5.5 和pH10.0 時(shí)基本穩(wěn)定，表明該探針的熒光強(qiáng)度不易受外界溶液的干擾。探針的可逆性也是實(shí)際應(yīng)用中的另一個(gè)重要因素，進(jìn)一步監(jiān)測(cè)了pH5.5 和pH10.0 時(shí)熒光強(qiáng)度的動(dòng)態(tài)變化。圖3C顯示，在5個(gè)循環(huán)中，探針BC在490nm發(fā)射波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度無(wú)明顯變化。因此，BC的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間和pH值波動(dòng)的變化可以忽略不計(jì)，進(jìn)一步說明該探針是應(yīng)用于生物樣品熒光強(qiáng)度監(jiān)測(cè)的良好選擇。

2.1.4 溫度的影響在實(shí)際的樣本檢測(cè)中，環(huán)境溫度可能會(huì)影響探針熒光強(qiáng)度。為了進(jìn)一步研究不同溫度對(duì)熒光強(qiáng)度穩(wěn)定性的影響，測(cè)定了BC在25～45℃范圍內(nèi)的熒光強(qiáng)度。如圖3D所示，熒光強(qiáng)度在pH5.5 和pH10.0 時(shí)趨于穩(wěn)定，表明該探針在上述溫度范圍內(nèi)不受影響，且反應(yīng)可在環(huán)境溫度下進(jìn)行。

2.1.5 選擇性研究熒光探針可能受到實(shí)際生物樣品中存在的各種金屬離子或氨基酸的干擾，而良好的選擇性是熒光探針的一個(gè)極其重要的特性［20］。本研究通過檢測(cè)探針在最大發(fā)射波長(zhǎng)（490nm）處的熒光強(qiáng)度評(píng)估其選擇性。從圖4可以看出，pH5.5 和pH10.0 時(shí)，金屬離子（K+、Na+、Ca2+、Fe3+等）、硫醇（GSH、Cys、Hcy）、氨基酸（Tyr、Lys、Glu等）在生理濃度時(shí)對(duì)BC的熒光強(qiáng)度幾乎無(wú)影響，表明該探針對(duì)金屬離子和氨基酸具有較好的抗干擾能力。

2.2 細(xì)胞活性及熒光成像

為了進(jìn)一步確定探針在生物體內(nèi)的應(yīng)用潛質(zhì)，首先采用CCK－8法檢測(cè)了BC在HeLa細(xì)胞中的體外細(xì)胞毒性。研究表明，隨著探針濃度的增加，細(xì)胞的活性趨于降低，但BC濃度低于60μmol/L時(shí)，細(xì)胞的存活率能達(dá)到80%以上。因此，根據(jù)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇20μmol/L和40μmol/L的BC濃度用于HeLa細(xì)胞熒光成像。從圖5中可以清晰看到藍(lán)色熒光發(fā)射分散在細(xì)胞質(zhì)上，隨著BC濃度和時(shí)間的增加，熒光發(fā)射明顯增強(qiáng)，且40μmol/L BC在孵育細(xì)胞80min時(shí)熒光強(qiáng)度達(dá)到最強(qiáng)，較20μmol/L BC在孵育細(xì)胞80min時(shí)的熒光強(qiáng)度提升了近3倍。結(jié)果表明該探針可成功運(yùn)用于HeLa細(xì)胞標(biāo)記，且培養(yǎng)濃度和時(shí)間會(huì)影響B(tài)C的熒光強(qiáng)度。因此，該香豆素有望成為表征生物體內(nèi)pH值變化的熒光染料。

圖5 BC在不同時(shí)間和濃度下的熒光成像Fig.5 Fluorescence imagings of BC at different times and concentrations

2.3 BC對(duì)pH值敏感的機(jī)制

為確定化合物BC的香豆素羰基和苯并咪唑基是否存在ESIPT過程，使用密度泛函理論考察香豆素羰基和苯并咪唑基間氫鍵的影響。圖6結(jié)果顯示，氫鍵的形成對(duì)電子云密度無(wú)影響。此外，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在香豆素上引入苯并咪唑基團(tuán)可以驅(qū)動(dòng)分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）［21－24］?；诖耍J(rèn)為化合物BC對(duì)pH值敏感以ICT為主。

圖6 BC的HOMO－LUMO帶隙Fig.6 HOMO－LUMO band gap of BC

3 結(jié) 論

本研究合成了一種以香豆素為母核的pH熒光染料，熒光光譜證明該探針在弱酸性到弱堿性范圍內(nèi)有明顯的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)趨勢(shì)，具有良好的光穩(wěn)定性和可逆性、抗干擾能力以及較低的細(xì)胞毒性。更重要的是，該探針可以成功地應(yīng)用于標(biāo)記HeLa細(xì)胞，為生物醫(yī)學(xué)研究和應(yīng)用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，有望用于生物成像領(lǐng)域的研究。