曾海平，吳東方，胡云雙

1.溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 檢驗(yàn)科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035

膿毒癥是由嚴(yán)重感染引起的以多器官功能障礙為主要特征的臨床綜合征，常伴有急性呼吸衰竭，其中呼吸肌無力是重要因素。膈肌作為主要的呼吸肌，膈肌功能障礙可嚴(yán)重?fù)p害呼吸泵，進(jìn)而導(dǎo)致患者長期依賴呼吸機(jī)、ICU住院時(shí)間延長、呼吸衰竭甚至死亡[1]。目前膿毒癥的病理生理機(jī)制尚未完全闡明，在膿毒癥早期觸發(fā)的炎癥反應(yīng)中釋放大量促炎細(xì)胞因子，如TNF-α、IL和PG等，在膿毒癥誘導(dǎo)的膈肌功能障礙中起著重要作用[2]。紫檀芪（pterostilbene,PTS）是一種與白藜蘆醇結(jié)構(gòu)類似的抗毒性物質(zhì)，主要存在于藍(lán)莓、葡萄和花生等植物中。近年來有研究表明，PTS具有多種生物活性，包括抗炎、抗氧化、抗衰老和抗病毒活性等[3]。此外，PTS還能介導(dǎo)細(xì)胞周期、凋亡和增殖[4]。然而，PTS在膿毒癥中的作用，尤其是在膿毒癥導(dǎo)致膈肌功能障礙中的作用鮮見報(bào)道。本研究擬探討PTS在膿毒癥致大鼠膈肌損傷中的作用，并探討其可能作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及材料 6～8周齡健康雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量180～250 g，購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心，動物在無病原體的條件下飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，大鼠可以自由獲取食物和水，并在室溫和50%～65%相對濕度下保持12 h的光/暗循環(huán)。PTS（純度99%）購自上海義森生物科技有限公司；AChE測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；IL-1β、TNF-α、IL-6、MPO測定試劑盒（ELISA）購自美國Pierce公司；AST、LDH、CK測定試劑盒購自美國Abcam公司；凋亡檢測試劑盒（C1088）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；ProteoPrep總蛋白提取試劑盒購自美國Sigma公司；t-Akt、p-Akt、t-PI3K、p-PI3K和β-actin抗體購自美國Epitomics公司。

1.2 膿毒癥模型及分組 大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成3組（每組10只）：假手術(shù)組、膿毒癥組和PTS組。膿毒癥組和PTS組大鼠均行盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)誘導(dǎo)盲腸壞死膿毒癥模型[5]。大鼠禁食12 h后腹腔注射1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）用于手術(shù)前麻醉，常規(guī)消毒后沿腹中線做2 cm切口，在盲腸總長度一半的距離處，用18號注射針頭在腸系膜緣和系膜對側(cè)緣方向各穿孔1次，然后輕輕按壓盲腸，腸內(nèi)容物被輕輕壓入腹腔，恢復(fù)盲腸正常解剖部位，逐層縫合切口，立即皮下注射無菌0.9%氯化鈉溶液（3 mL/100 g）以補(bǔ)償體液流失。假手術(shù)組大鼠進(jìn)腹定位盲腸后，不穿孔盲腸。

手術(shù)前30 min，PTS組大鼠接受PTS腹腔注射（25 mg/kg）1次，假手術(shù)組和膿毒癥組大鼠腹腔注射等量的無菌0.9%氯化鈉溶液，24 h后通過腹腔注射戊巴比妥對所有存活大鼠實(shí)施安樂死，隨后從左側(cè)膈肌中部采集5 mm寬膈肌，立即測量膈肌收縮力，進(jìn)行下一步檢測。

1.3 膈肌收縮性能測定 將膈肌條垂直懸掛在 37 ℃的Krebs組織液中，將2 個(gè)銀電極平行放置在肌條上，并連接到電刺激器（ALC-MPA2000-S，Alcott Biotech）。經(jīng)過15 min的熱平衡期后，確定肌條產(chǎn)生最大收縮力的最佳長度（L0），然后將刺激強(qiáng)度設(shè)置為電壓強(qiáng)度的120%，當(dāng)L0達(dá)到最大收縮反應(yīng)時(shí)調(diào)整電壓強(qiáng)度，以確保閾上刺激。分別使用10、20、40、60、80和120 Hz頻率電刺激膈肌條。疲勞指數(shù)（fatigue index,FI）：給予肌條刺激頻率40 Hz，刺激電壓15 V，刺激時(shí)間330 ms，串間隔670 ms的刺激，共計(jì)300串刺激，計(jì)算第120個(gè)肌顫搐與第1個(gè)肌顫搐的比值，即FI。

1.4 組織病理學(xué)觀察及膈肌損傷評分（diaphragm damage score，DDS）采集的膈肌組織用4%中性甲醛固定，對每個(gè)組織樣本進(jìn)行石蠟包埋，5 μm切片后使用蘇木精/伊紅染色，乙醇梯度脫水封閉后進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。膈肌損傷的嚴(yán)重程度根據(jù)半定量量表進(jìn)行評估和分級，包括水腫、中性粒細(xì)胞浸潤、出血和肌原纖維分布[6]。由兩位對分組情況不知情的病理學(xué)專家進(jìn)行描述，嚴(yán)重程度表示為DDS。

1.5 TUNEL法檢測膈肌細(xì)胞凋亡 根據(jù)凋亡檢測試劑盒的說明書對組織切片進(jìn)行TUNEL染色。用熒光顯微鏡觀察TUNEL陽性細(xì)胞，凋亡細(xì)胞呈黃綠色熒光，正常細(xì)胞無熒光，在200倍下隨機(jī)選擇5個(gè)視野計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞，取平均數(shù)。

1.6 ELISA法檢測大鼠膈肌組織中AChE、IL-1β、TNF-α、IL-6、AST、LDH、CK以及MPO活性 將膈肌組織進(jìn)行勻漿后，按照相應(yīng)ELISA檢測試劑盒的操作說明分別檢測膈肌組織中AChE、IL-1β、TNF-α、IL-6、AST、LDH、CK以及MPO活性。

1.7 Western blot檢測膈肌組織中蛋白表達(dá) 從膈肌組織中分離出總蛋白，通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白質(zhì)樣品轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上。在室溫下用Western封閉劑（Beyotime）封閉2 h，并在4 ℃下與一抗孵育過夜以進(jìn)行免疫印跡，用TBST沖洗3次后，在室溫下用過氧化物酶結(jié)合的二抗室溫培養(yǎng)1 h，采用電化學(xué)發(fā)光溶液進(jìn)行圖像顯影，使用Quantity One 4.6.2（BIO-RAD）軟件分析圖像。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS19.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況 假手術(shù)組大鼠全部存活，膿毒癥組有6只、PTS組有8只存活至術(shù)后24 h。此外，進(jìn)行手術(shù)的存活大鼠均出現(xiàn)不同程度的膿毒癥癥狀，如活動障礙、毛發(fā)豎立、呼吸短促、結(jié)膜下滲出和腹瀉等。

2.2 膈肌收縮力-頻率關(guān)系 膿毒癥組膈肌條在所有刺激頻率（10～120 Hz）下的收縮力均明顯低于假手術(shù)組和PTS組（P＜0.05），PTS治療可部分恢復(fù)膿毒癥時(shí)膈肌收縮力的下降（P＜0.05），見圖1。假手術(shù)組、膿毒癥組和PTS組的FI分別為84.5±6.8、80.3±7.5和79.6±7.8，3組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 膈肌條收縮力-電刺激頻率曲線

2.3 膈肌組織病理學(xué)觀察及DDS半定量分析 3組大鼠膈肌組織病理學(xué)檢測結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠膈肌組織經(jīng)HE染色后肌肉組織呈多邊形粉紅色纖維，肌肉纖維排列整齊緊湊，少有炎性細(xì)胞浸潤。術(shù)后24 h，膿毒癥組大鼠膈肌組織在鏡下出現(xiàn)明顯改變，肌肉組織排列紊亂，伴有大量炎性細(xì)胞浸潤，細(xì)胞間隙增寬。PTS治療可部分改善CLP后導(dǎo)致的病理改變，肌肉纖維排列相對規(guī)律，細(xì)胞間水腫和出血減輕，炎性細(xì)胞浸潤明顯減少。半定量分析各組DDS結(jié)果表明，膿毒癥組DDS評分高于假手術(shù)組，而PTS治療后DDS評分顯著降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組大鼠膈肌組織病理學(xué)表現(xiàn)（×200）及DDS評分

2.4 PTS對膈肌細(xì)胞凋亡的影響 TUNEL染色結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，膿毒癥組TUNEL陽性肌肉細(xì)胞明顯增多（P＜0.05），而與膿毒癥組相比，PTS組TUNEL陽性細(xì)胞顯著減少（P＜0.05），見圖3。

圖3 TUNEL染色法測定各組大鼠膈肌細(xì)胞凋亡

2.5 PTS對膈肌組織中AChE活性的影響 與假手術(shù)組相比，膿毒癥組AChE活性明顯降低（P＜0.05），而與膿毒癥組相比，PTS組AChE活性顯著升高（P＜0.05），見圖4A。

2.6 PTS對膈肌組織中促炎細(xì)胞因子的影響 與假手術(shù)組大鼠相比，膿毒癥組大鼠CLP術(shù)后24 h膈肌組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量顯著升高（P＜ 0.05），而PTS治療后膈肌組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量均明顯降低（P＜0.05），見圖4B、4C、4D。

2.7 PTS對膈肌組織中肌肉損傷生物標(biāo)志物的影響 由于骨骼肌損傷沒有特異的生物標(biāo)志物，本研究通過檢測膈肌組織中AST、LDH、CK以及MPO活性來評估肌肉損傷。如圖4E、4F、4G、4H所示，大鼠膈肌組織中AST、LDH、CK以及MPO活性在術(shù)后24 h均顯著升高（P＜0.05），而PTS治療后上述生物標(biāo)志物水平顯著下降（P＜0.05）。與假手術(shù)組比：aP＜0.05；與PTS組比：bP＜0.05

圖4 ELISA法測定各組大鼠膈肌組織AChE活性、IL-1β、TNF-α、IL-6、AST、LDH、CK及MPO含量

2.8 PTS對膈肌組織中PI3K-Akt信號通路的影響 Western blot檢測結(jié)果顯示，大鼠膈肌組織中p-PI3K和p-Akt的蛋白表達(dá)量在CLP術(shù)后均明顯降低（P＜0.05），而p-PI3K和p-Akt的蛋白表達(dá)量在PTS治療后均顯著增加（P＜0.05），見圖5。

圖5 Western blot檢測各組大鼠膈肌組織p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)

3 討論

膿毒癥作為一種常見且難以治療的危重病，導(dǎo)致沉重的社會和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。本研究通過建立大鼠膿毒癥模型，觀察PTS對膿毒癥大鼠膈肌功能的影響，結(jié)果表明PTS可增強(qiáng)膈肌收縮力和AChE活性、減輕炎癥反應(yīng)以及抑制膈肌細(xì)胞凋亡，從而對膈肌發(fā)揮保護(hù)作用，機(jī)制研究表明PTS可能通過激活PI3K/Akt信號通路從而抑制肌肉損傷和炎癥反應(yīng)，本研究為治療膿毒癥提供一種新的治療選擇。

CLP作為當(dāng)前公認(rèn)的大鼠膿毒癥的金標(biāo)準(zhǔn)模型制作方法[7]，膿毒癥導(dǎo)致膈肌功能障礙是一個(gè)非常復(fù)雜的病理過程，包括炎癥、氧化應(yīng)激、代謝失衡、線粒體功能障礙、肌肉細(xì)胞凋亡等，其中炎癥和氧化應(yīng)激是膿毒癥時(shí)膈肌功能障礙的兩個(gè)主要因 素[8]。本研究通過CLP建立大鼠膿毒癥模型，CLP術(shù)后24 h，大鼠膈肌組織中TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎細(xì)胞因子水平升高，死亡率升高，同時(shí)存活大鼠出現(xiàn)膿毒癥綜合征，表明成功建立大鼠膿毒癥模型，與既往研究相仿[9]。既往研究表明，諸如TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎細(xì)胞因子對膿毒癥的進(jìn)展有促進(jìn)作用，促炎細(xì)胞因子還可導(dǎo)致膈肌功能障礙和AChE活性下調(diào)[10]。當(dāng)前對PTS的抗炎作用已有較為深入的研究[3]，但PTS是否通過抗炎作用從而保護(hù)膿毒癥大鼠膈肌功能尚未見報(bào)道。在本研究中，PTS可降低膈肌組織中促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，同時(shí)在顯微鏡下觀察到PTS可明顯抑制炎性細(xì)胞在肌肉組織中浸潤。此外，神經(jīng)肌肉連接處的AChE活性是膈肌的另一重要特性，患者在全身麻醉后，通常需要肌肉松弛拮抗劑抑制AChE活性發(fā)揮治療作用，從而加速肌肉功能的恢復(fù)[11]。因此，抑制膿毒癥期間炎癥和氧化應(yīng)激理論上有助于維持膈肌收縮功能和AChE活性。在本研究中，PTS治療后，膈肌收縮力明顯提高，同時(shí)膿毒癥期間膈肌的AChE活性也得到改善。

本研究還進(jìn)一步檢測了膈肌組織中AST、LDH和CK活性，以間接觀察骨骼肌損傷，研究結(jié)果表明膿毒癥引起膈肌嚴(yán)重氧化損傷，與既往研究結(jié)果相 仿[12]。有趣的是，PTS治療顯著降低了膿毒癥期間膈肌組織中AST、LDH和CK活性，說明膿毒癥引起的膈肌氧化損傷在PTS作用后得到了一定程度的緩解，上述結(jié)果符合其對心肌和神經(jīng)元氧化應(yīng)激的保護(hù)作用[13-14]。MPO是由中性粒細(xì)胞合成和分泌的一種酶，MPO可以將H2O2轉(zhuǎn)化為HOCl，HOCl是一種比H2O2更為活躍的活性氧，從而在組織炎癥反應(yīng)和中性粒細(xì)胞浸潤中發(fā)揮關(guān)鍵作用[16]。本研究發(fā)現(xiàn)PTS組大鼠膈肌的MPO活性與膿毒癥組相比顯著降低。同時(shí)，膿毒癥大鼠膈肌中可見大量中性粒細(xì)胞浸潤、細(xì)胞核增大、骨骼肌纖維間距增大，PTS治療后，中性粒細(xì)胞浸潤、細(xì)胞核大小、骨骼肌纖維間距和DDS評分均明顯減小，這與MPO活性的變化相一致。以上發(fā)現(xiàn)提示膿毒癥過程中氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的相互作用關(guān)系。

PI3K/Akt通路是一條重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，Akt是PI3K的下游受體，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、遷移和轉(zhuǎn)錄等多種細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用[16]。Akt活性下調(diào)與細(xì)胞炎癥反應(yīng)關(guān)系密切，而Akt激活可降低細(xì)胞氧化應(yīng)激并抑制促炎癥細(xì)胞因子的釋放[17]。既往研究證實(shí)，PTS可以激活PI3K/Akt信號通路，并在缺血再灌注大鼠腦損傷中發(fā)揮保護(hù)作 用[18]。本研究表明，PTS改善了膿毒癥對大鼠膈肌中PI3K和Akt的抑制作用，從而為證實(shí)PTS能激活膿毒癥大鼠膈肌PI3K/Akt通路提供了理論依據(jù)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)PTS可保護(hù)膿毒癥大鼠的膈肌功能和AChE活性，改善膿毒癥大鼠膈肌的炎癥浸潤、氧化損傷和細(xì)胞凋亡。此外，本研究表明PI3K/Akt通路是PTS在膿毒癥期間保護(hù)膈肌免受炎癥和氧化應(yīng)激損傷的重要途徑。