亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        1例豬偽狂犬病病毒的分離與鑒定

        2021-10-16 02:33:24顏友榮方向紅王琳琳
        養(yǎng)殖與飼料 2021年10期
        關鍵詞:實驗

        顏友榮 方向紅 王琳琳

        江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院,江蘇泰州225300

        偽狂犬病是由偽狂犬病病毒(pseudorabies vi?rus,PRV)引起的一種重要傳染病,以發(fā)熱、奇癢(豬除外)及腦脊髓炎為主要癥狀的一種重要傳染病[1]。近年來,我國許多省份的養(yǎng)豬場都出現(xiàn)了偽狂犬病,給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[2]。為了了解偽狂犬病的感染情況,筆者從江蘇省某豬場采集疑似病料,并對其進行病毒分離與鑒定,從而判斷是否為偽狂犬病,以期為豬場控制偽狂犬病提供一定的幫助。

        1 材料與方法

        1.1 材 料

        1)病料與實驗動物。從江蘇某豬場采集疑似感染偽狂犬病的病料,如腦、肺臟、脾臟、肝臟、淋巴結(jié)等,-20°C 保存?zhèn)溆茫粚嶒瀯游餅榧彝?,購自江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院實驗動物飼養(yǎng)中心;3 只健康家兔。

        2)主要試劑。LA Taq DNA 聚合酶,dNTP mix,2×GC Buffer I,DL 5000 DNA Marker 等,購于寶生物工程(大連)有限公司;偽狂犬-SD 株由江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院微生物實驗室保存;其他各種實驗試劑均為分析純試劑。

        1.2 方 法

        1)病料處理。將無菌采集的病料組織研磨,用0.01 mol/L、pH7.4 PBS 按照體積比制成1∶5 組織懸液,加入適量青霉素、鏈霉素處理后,反復凍融3次,3 000 r/min離心15 min,取上清液,置于–20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

        2)病毒提取與PCR 擴增。取經(jīng)處理過的病料上清液與對照偽狂犬-SD株,按照TaKaRa試劑盒說明書操作方法進行病毒提取,提取液-20 ℃貯存?zhèn)溆?。PCR 擴增以提取液作為模板進行擴增。上游引物(P1):5’-CCATGCGGCCCTTTCTGCTGC-3’,下游引物(P2):5’-CGGGGCGGGACATCAACAG?GC-3’,擴增片段大小為1 737 bp,引物由上海英駿生物工程有限公司合成。

        PCR 反應體系(50μL):DNA 模板5μL,5 U/μL LA Taq 酶0.5 μL,2×GC Buffer I 25 μL,100 μmol/L dNTP 8 μL,PRV-P1 1 μL,PRV-P2 1μL,2 mmol/L MgCl26μL,ddH2O 3.5μL。

        PCR 反應條件:95 ℃預變性5 min,95 ℃預變性1 min,64 ℃退火50 s,72 ℃延伸2 min,35個循環(huán),最后4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物,溴化乙錠染色,用1%瓊脂糖凝膠電泳25 min,紫外燈光下觀察擴增結(jié)果。

        3)間接免疫熒光法。為了方便驗證實驗結(jié)果,此實驗設陽性對照與陰性對照,病毒液接種細胞選用的是BHK-21 細胞即乳倉鼠腎細胞,具體實驗操作步驟如下[3]。

        預先制備好含有生長良好的單層BHK-21細胞腔式載玻片,分別加入疑似偽狂犬病毒液和偽狂犬-SD 株病毒液各1 mL,標注記號,37 ℃溫箱作用1 h后,吸掉病毒液,加入細胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)24 h;棄掉維持液,用PBS洗3次,固定載玻片上的細胞培養(yǎng)物,用PBS 洗滌3 次,加入500μL 1∶100 稀釋的豬偽狂犬陽性血清,37 ℃孵育1 h;用PBS洗滌3次后,加入500 μL 1∶2 000 稀釋的山羊抗豚鼠-FITC,37 ℃孵育30 min;最后用PBS 洗滌3次,再用0.2μg/mL DAPI 染色液染色后,置于熒光顯微鏡下觀察。同時設置細胞培養(yǎng)物作陰性對照。

        4)動物接種試驗。本次試驗選擇易感動物家兔,接種試驗前先取3只大小、體重相似的健康家兔飼養(yǎng)2 d,觀察家兔是否有異常。若無異常,給3只家兔后頸部皮下分別注射分離的病毒培養(yǎng)液、對照用的偽狂犬-SD株培養(yǎng)液及生理鹽水各2 mL,觀察家兔接種后的臨床癥狀。實驗結(jié)束后,對家兔飼養(yǎng)場地進行嚴格消毒,對發(fā)病死亡的家兔進行無害化處理。

        2 結(jié) 果

        2.1 PCR擴增結(jié)果

        PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果如圖1 所示,疑似偽狂犬病毒分離株與對照偽狂犬-SD 株都有特異性片段,長度約為1 700 bp,與實驗預測結(jié)果相同。

        圖1 PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

        2.2 間接免疫熒光檢測結(jié)果

        實驗結(jié)束后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果如圖2所示。圖2 中A 為疑似偽狂犬分離株,B 為偽狂犬-SD 株,二者均能觀察到明亮的黃綠色熒光;C為細胞對照,沒有觀察到黃綠色熒光。A 為疑似偽狂犬分離株,能與偽狂犬病毒陽性血清結(jié)合,與山羊抗豚鼠-FITC 發(fā)生特異性結(jié)合,在熒光顯微鏡下能與陽性對照B 觀察到同樣的結(jié)果。結(jié)果表明,分離到的疑似偽狂犬分離株就是豬偽狂犬病毒。

        圖2 病毒分離株與陽性血清間接免疫熒光檢測

        2.3 動物接種試驗結(jié)果

        接種分離的病毒培養(yǎng)液及對照用的偽狂犬-SD株培養(yǎng)液,24 h 后家兔出現(xiàn)興奮不安、食欲下降;40 h 后出現(xiàn)舌舔、嘴啃、抓撓等明顯的瘙癢癥狀,隨后家兔出現(xiàn)呼吸急促,體溫升高,接種部位被毛脫落、出血、皮膚潮紅,肌肉暴露;48 h 左右四肢出現(xiàn)麻痹、角弓反張、抽搐直至死亡,如圖3 所示。注射生理鹽水的家兔不表現(xiàn)臨床癥狀。試驗結(jié)果說明分離毒株對家兔有明顯的致病性,表現(xiàn)出類似的偽狂犬病癥狀。

        圖3 試驗組家兔

        3 討 論

        1)本研究通過從江蘇某豬場一疑似病例分離出一株病毒,經(jīng)PCR 擴增試驗、易感動物接種實驗、間接免疫熒光鑒定及血清中和試驗等證明分離株是偽狂犬毒株,說明該豬場母豬流產(chǎn)、仔豬死亡等很可能是豬偽狂犬病病毒感染造成的[4]。

        2)偽狂犬病在我國大部分接種Bartha-K61 疫苗免疫的豬場中散發(fā)或廣泛流行,而且動物一旦感染,可終身帶毒、難以根除,說明傳統(tǒng)疫苗保護效率低,疫病難以防控,給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失,已引起廣大養(yǎng)殖戶的高度重視[5]。

        猜你喜歡
        實驗
        我做了一項小實驗
        記住“三個字”,寫好小實驗
        我做了一項小實驗
        我做了一項小實驗
        記一次有趣的實驗
        有趣的實驗
        小主人報(2022年4期)2022-08-09 08:52:06
        微型實驗里看“燃燒”
        做個怪怪長實驗
        NO與NO2相互轉(zhuǎn)化實驗的改進
        實踐十號上的19項實驗
        太空探索(2016年5期)2016-07-12 15:17:55
        日本免费一区二区三区在线看| 亚洲国产天堂久久综合网| 9lporm自拍视频区| 亚洲小说图区综合在线| 午夜少妇高潮免费视频| 美女视频在线观看亚洲色图| 中文在线8资源库| 四虎影视国产在线观看精品| 国产传媒剧情久久久av| 国产高清精品一区二区| 成年女人黄小视频| 亚洲欧美日韩精品高清| 国产日产久久福利精品一区| 国产精品日韩av一区二区| 在线看无码的免费网站| 亚洲自偷自偷偷色无码中文| 国内精品九九久久精品小草| 亚洲激情综合中文字幕| 亚洲人成色7777在线观看| 久久青青热| 国产成人夜色在线视频观看| 日韩女同精品av在线观看| 水蜜桃精品一二三| 在线观看无码一区二区台湾| 日韩亚洲在线一区二区| 亚洲线精品一区二区三区| 在教室伦流澡到高潮hgl视频| 九一成人AV无码一区二区三区| 国产一级内射一片视频免费| 成人午夜福利视频后入| 久久福利青草精品免费| 日本看片一区二区三区| 国产免费av手机在线观看片| 成人妇女免费播放久久久| 美女爽好多水快进来视频| 日韩精品一区二区亚洲观看av| 午夜理论片yy6080私人影院 | 亚洲中文字幕第二十三页| 人妻少妇精品视频专区vr| 无码人妻一区二区三区在线视频| 日本a在线播放|