孫 紅，付翠芳，高佳麗，霍森燁，王新月，王文麗

（邢臺市第三醫(yī)院，河北邢臺 054000）

妊娠期糖尿?。╣estationaldiabetes mellitus，GDM）產(chǎn)婦凝血功能紊亂，較正常孕婦存在纖維蛋白溶解活性增強(qiáng)、血小板明顯活化等癥狀，容易導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局，危及母體、胎兒生命安全，因此盡早評估不良妊娠結(jié)局風(fēng)險至關(guān)重要[1-2]。深入研究GDM 患者血清指標(biāo)以及對妊娠結(jié)局的影響在GDM 以及妊娠結(jié)局中的作用，可指導(dǎo)醫(yī)師提前監(jiān)測，評估不良妊娠結(jié)局風(fēng)險，從而盡早開展針對性治療，有助于降低母嬰罹患心血管疾病、代謝綜合征的近遠(yuǎn)期風(fēng)險。近年來，越來越多研究發(fā)現(xiàn)胰島素抵抗(insulin resistance,IR)與GDM 的發(fā)生密切相關(guān)，血清中的胰島素樣生長因子1 受體(insulin 1ike growth factor 1 receptor,IGF-1R）水平的增加是妊娠期胰島素抵抗以及GDM 發(fā)生的機(jī)制之一[3]。micro RNA21[4]能通過調(diào)節(jié)過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferater-activated receptor γ，PPARγ）水平而調(diào)控胰島素抵抗，同時，還能參與脂肪細(xì)胞的分化，調(diào)節(jié)胰島素信號通路，可有效維持良好的母胎運(yùn)輸，保證妊娠期胎盤正常發(fā)育[5-7]。目前，關(guān)于妊娠期糖尿病患者血清IGF-1R,miR-21 和PPARγ，IGF-1R 表達(dá)水平與凝血功能、妊娠結(jié)局的關(guān)系尚不明確，因此，本文將通過實(shí)例進(jìn)一步探討，從而為臨床預(yù)防、預(yù)測不良妊娠結(jié)局提供參考價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取邢臺市第三醫(yī)院婦產(chǎn)科2017年1月～2020年1月期間診治的164 例GDM 患者為GDM 組，以同期健康妊娠產(chǎn)婦100 例為對照組，年齡22～38 歲，孕周24～28 周。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合人民衛(wèi)生出版社出版的《婦產(chǎn)科學(xué)(第8 版)》中關(guān)于GDM 的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，即孕24～28 周進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)，空腹血糖（FPG）≥5.1 mmol/L，或者口服75g 葡萄糖后1h 血糖≥10.0 mmol/L，服糖后2 h 血糖≥8.5 mmol/L。排除標(biāo)準(zhǔn)：有免疫、神經(jīng)系統(tǒng)疾病者；入組前近3 個月內(nèi)使用過糖皮質(zhì)激素者；多胎妊娠患者；嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙者；伴隨其他并發(fā)癥（冠心病、高血壓等）者。兩組孕婦年齡、BMI，孕周等一般資料比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）。

1.2 儀器與試劑 邁瑞B(yǎng)S200 型全自動生化分析儀，C3510 血凝分析儀，邁瑞H50 糖化血紅蛋白分析儀，Micro17R 型離心機(jī)，Multiskan? FC 酶標(biāo)儀，Prism 7000 型PCR 儀，酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；人磷酸甘油酸脫氫酶（GADPH）、總RNA 提取試劑盒，PCR 試劑盒購自默克；Sigma-Aldrich，miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于日本Takara 公司；所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 方法 受試者入組后當(dāng)天下午7 點(diǎn)禁食不禁水，次日清晨空腹采集外周靜脈血2ml×4 管，采用EDTA-K2抗凝，其中第1 管用于檢測血脂、血糖、糖化血紅蛋白（HbAlc）空腹胰島素(fasting insulin,FINS)和穩(wěn)態(tài)模式胰島素抵抗指數(shù)(HOMAIR)=FPG×FINS/22.5。

第2 管用于檢查凝血指標(biāo)，包括凝血酶原時間(prothrombin time,PT)、活化部分凝血活酶時間(activation of partial thrombin time,APTT)、纖維蛋白原(fibrinogen,FIB)和D-二聚體(D- dimer,D-D)。

第3 管靜置1h 后3 000 r/min 離心20min，取上清保存于-80℃待測。測定血清PPARγ 和IGF-1R 水平，繪制ELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清PPARγ 和IGF-1R 濃度。

第4 管用于檢測miR-21 表達(dá)量，參照TRIzol試劑盒說明書使用方法提取外周血中總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到模板單鏈cDNA，隨后使用PCR 試劑盒對cDNA 進(jìn)行PCR，PCR 反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性15 s，95℃變性10s，60℃退火300s，72℃延伸30s，連續(xù)40 個循環(huán)。以GADPH 為內(nèi)參，根據(jù)miR-21 與GADPH的Ct值計(jì)算相對表達(dá)量，以2－△△Ct表示miR-21相對GADPH 表達(dá)量，△△Ct=（Ct目的基因-CtGADPH）-（Ct對照目的基因-Ct對照GADPHU6）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0 軟件分析所有數(shù)據(jù)，其中計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用 Pearson 分析以及多元線性回歸分析影響妊娠結(jié)局的獨(dú)立影響因素。P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血糖指標(biāo)、血凝指標(biāo)和micro RNA21,PPARγ，IGF-1R 比較 見表1。GDM 組血糖指標(biāo)（空腹OGTT,1h OGTT,2h OGTT,HbAlc,HOMAIR）均明顯高于對照組，PT,APTT,micro RNA21和PPARγ 明顯低于對照組，而FIB,D-D 和IGF-1R明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

表1 兩組血糖指標(biāo)、血凝指標(biāo)和Micro RNA21,PPARγ，IGF-1R 比較（±s）

項(xiàng)目GDM 組（n=164）對照組（n=100）tP空腹OGTT(mmol/L) 5.48±0.284.42±0.2431.456<0.001 1h OGTT(mmol/L)9.75±0.375.32±0.31 100.176 <0.001 2h OGTT(mmol/L)8.45±0.424.85±0.3869.999<0.001 HbAlc（%）6.98±0.625.12±0.5324.948<0.001 HOMA-IR3.34±0.382.31±0.2526.546<0.001 PT（s）10.93±1.54 11.74±1.664.024<0.001 APTT（s）26.41±1.84 28.38±1.369.958<0.001 FIB（g/L）4.72±0.563.95±0.5111.204<0.001 D-D（μg/L） 349.43±34.64 308.46±30.42 9.753<0.001 Micro RNA210.88±0.151.76±0.3722.675<0.001 PPARγ（ng/L）0.23±0.041.62±0.2751.140<0.001 IGF-1R（μg/L） 1.43±0.240.75±0.1826.169<0.001

2.2 micro RNA21,PPARγ 和IGF-1R 與凝血功能相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性分析 見表2。Pearson 分析micro RNA21,PPARγ 和IGF-1R 與凝血功能相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性，結(jié)果顯示micro RNA21,PPARγ 與PT,APTT 呈正相關(guān)，與 FIB,D-D 呈負(fù)相關(guān)。IGF-1R 與PT,APTT 呈負(fù)相關(guān)，與 FIB,D-D 呈正相關(guān)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.005）。

表2 Micro RNA21,PPARγ,IGF-1R 與凝血功能指標(biāo)的相關(guān)性分析

2.3 兩組受試者不良妊娠結(jié)局比較 GDM 組不良妊娠結(jié)局主要為前置胎盤（3 例）、產(chǎn)后出血（4 例）、胎兒窘迫（1 例）、畸形（5 例）和早產(chǎn)（12 例）；對照組主要為產(chǎn)后出血（1 例）和早產(chǎn)（4 例），GDM 組不良妊娠結(jié)局發(fā)生率（15.24%）明顯高于對照組（5.00%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.472,P=0.011）。

2.4 不同妊娠結(jié)局產(chǎn)婦的micro RNA21,PPARγ和IGF-1R 水平比較 見表3。不良妊娠結(jié)局產(chǎn)婦的micro RNA21,PPARγ 水平低于妊娠結(jié)局良好產(chǎn)婦，而IGF-1R 水平高于妊娠結(jié)局良好產(chǎn)婦,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

表3 不良妊娠結(jié)局產(chǎn)婦的血清Micro RNA21,PPARγ,IGF-1R 水平比較（±s）

表3 不良妊娠結(jié)局產(chǎn)婦的血清Micro RNA21,PPARγ,IGF-1R 水平比較（±s）

項(xiàng) 目不良妊娠結(jié)局組（n=30）妊娠結(jié)局良好組（n=134）tP Micro RNA210.77±0.141.27±0.3514.575 <0.001 PPARγ（ng/L）0.26±0.040.82±0.2630.271 <0.001 IGF-1R（μg/L） 1.86±0.251.29±0.2113.684 <0.001

2.5 多元線性回歸分析 見表4。以妊娠結(jié)局作為因變量，以micro RNA21,PPARγ,IGF-1R 作為自變量，采用逐步回歸法進(jìn)行多元線性回歸分析，所有自變量均取實(shí)際值。結(jié)果表明：micro RNA21,PPARγ 和IGF-1 均是影響妊娠結(jié)局的獨(dú)立影響因素（P<0.05）。

表4 多元線性回歸分析

3 討論

GDM 是妊娠期常見的內(nèi)分泌代謝紊亂疾病，主要表現(xiàn)為葡萄糖耐量異常，臨床不良妊娠結(jié)局，如早產(chǎn)、胎兒畸形、胎兒生長受限、胎兒窘迫等不良妊娠結(jié)局[9]。目前，普遍認(rèn)為胰島素抵抗是GDM 的主要病理機(jī)制，micro RNA21,PPARγ 和IGF-1R 在胰島素抵抗中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，如噻唑烷二酮類降糖藥物（羅格列酮）通過結(jié)合PPARγ 而增加肌肉、肝臟的糖利用以及胰島素的敏感性，從而調(diào)節(jié)血糖平衡[10]。IGF-1R 是IGFs 中活性最強(qiáng)的受體，其α 亞基與胰島素結(jié)合后可導(dǎo)致胞內(nèi)酪氨酸激酶磷酸化，從而激活PI3K/AKT,Ras/Raf/ERK 等信號通路，是胰島素抵抗、糖尿病等疾病中的重要蛋白[11]。本研究結(jié)果顯示，GDM患者的不良妊娠結(jié)局發(fā)生率明顯高于對照組，進(jìn)一步分析不同妊娠結(jié)局患者的micro RNA21,PPARγ和IGF-1R 表達(dá)水平，結(jié)果提示不良妊娠結(jié)局產(chǎn)婦的micro RNA21,PPARγ水平低于妊娠結(jié)局良好產(chǎn)婦，而IGF-1R 水平高于妊娠結(jié)局良好產(chǎn)婦，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過多元線性回歸分析顯示，micro RNA21,PPARγ 和IGF-1R 是影響妊娠結(jié)局的獨(dú)立影響因素（P<0.05），表明患者血清micro RNA21,PPARγ 和IGF-1R 異常表達(dá)均可增加不良妊娠結(jié)局風(fēng)險。分析認(rèn)為micro RNA21,PPARγ 和IGF-1R可能通過調(diào)節(jié)凝血功能從而增加血栓風(fēng)險，進(jìn)而影響胚胎正常發(fā)育。研究報道認(rèn)為，IGF-1R 與IGF-1,IGF-2 等特異性結(jié)合而促進(jìn)胎盤生長，調(diào)節(jié)胎盤功能，影響胎盤的轉(zhuǎn)運(yùn)以及代謝功能，若過表達(dá)則會促進(jìn)胎兒的過度生長，容易導(dǎo)致巨大兒，若低水平表達(dá)，則影響胎盤的生長發(fā)育[12]。PPARγ 參與胎盤發(fā)育、胎盤脂肪酸代謝等過程，調(diào)節(jié)脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和儲存，促進(jìn)人滋養(yǎng)細(xì)胞脂肪酸的攝取，參與胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的生長、分化以及母胎轉(zhuǎn)運(yùn)的建立，維持胎兒生長發(fā)育和妊娠。同時，劉嗣超等[13]研究發(fā)現(xiàn)GDM 組孕婦胎盤組織中PPARγ，mRNA及蛋白均處于低表達(dá)狀態(tài)，胰島素抵抗系數(shù)明顯升高，表明PPARγ 參與孕期糖代謝以及GDM 的發(fā)生發(fā)展，且低水平容易導(dǎo)致胎兒發(fā)育異常，引起不良妊娠結(jié)局。另外，micro RNA21 一方面通過促進(jìn)PPARγ 基因的表達(dá)而降低不良妊娠結(jié)局風(fēng)險，同時還能通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝而改善患者血凝狀態(tài)，利于胎盤氧氣、營養(yǎng)輸送，避免胎兒處于慢性缺氧狀態(tài)，保證正常生長發(fā)育[7,14]，因此通過監(jiān)測患者的micro RNA21,PPARγ 和IGF-1R 表達(dá)水平，能夠提早預(yù)測，盡早給予對癥治療，降低不良妊娠發(fā)生率，具有重大的臨床意義。

GDM 可損傷抗凝系統(tǒng)、血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而激活血液凝固系統(tǒng)，進(jìn)一步誘導(dǎo)紅細(xì)胞及血小板凝集，加重高凝狀態(tài)，增加血栓風(fēng)險[15]，因此及早評估凝血功能狀態(tài)，能夠降低妊娠風(fēng)險。本次研究結(jié)果顯示micro RNA21,PPARγ 和IGF-1R 在GDM 患者血清中表達(dá)異常，且Pearson 分析顯示micro RNA21,PPARγ 和IGF-1R 與凝血功能相關(guān)指標(biāo)（PT,APTT,FIB,D-D）水平具有相關(guān)性（均P<0.005），原因推測為Micro RNA21 是一種由20 ～25 個核苷酸組成的非編碼RNA，可調(diào)控血管發(fā)育，促進(jìn)血管損傷修復(fù)，同時還能通過抑制三羥基三甲基輔酶A 還原酶而調(diào)控三酰甘油和膽固醇的代謝，從而改善血液高凝狀態(tài)[16]，故而micro RNA21 水平與FIB,D-D 呈負(fù)相關(guān)性。趙曉云等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在非酒精性脂肪肝病的肝組織中micro RNA21 還能調(diào)節(jié)PPAR-α 和PPAR-γ 的基因表達(dá)，從而調(diào)節(jié)脂質(zhì)分解代謝以及糖代謝，改善胰島素抵抗。PPAR-γ 能調(diào)節(jié)胎盤組織Visfatin 基因的表達(dá)，增加脂肪細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞攝取葡萄糖，以及抑制肝糖原的釋放，降低血糖，改善高凝狀態(tài)[18]。動物模型研究顯示，使用PPAR-γ 激動劑可增加胰島素敏感性，減少胰島素抵抗，在血壓、葡萄糖、脂質(zhì)的穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用，從而降低對凝血系統(tǒng)的刺激，減少FIB,D-D 等促凝因子的釋放[18]。所以micro RNA21,PPARγ 和IGF-1R 均可能調(diào)節(jié)凝血功能，從而參與GDM 的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，micro RNA21,PPARγ 和IGF-1R 在妊娠期糖尿病患者血清中表達(dá)異常，與凝血功能呈相關(guān)性，是影響妊娠結(jié)局的危險因素，監(jiān)測其趨勢，可以為臨床醫(yī)師提供預(yù)警信號，降低不良妊娠風(fēng)險。隨著孕期的變化，產(chǎn)婦血清凝血功能指標(biāo)均處于動態(tài)變化中，而本次研究并未連續(xù)監(jiān)測不同孕周產(chǎn)婦的血清micro RNA21,PPARγ 和IGF-1R 水平，因此之后需深入研究各血清指標(biāo)隨著孕周的變化趨勢，以及與凝血指標(biāo)間的動態(tài)相關(guān)性，從而指導(dǎo)醫(yī)師及時評估各孕周階段患者的不良妊娠結(jié)局風(fēng)險。