侯思南，曾 健，顧蕓蕓，商秀娟，葉紅玲（.南京中醫(yī)藥大學(xué)連云港附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇連云港 00；.南京醫(yī)科大學(xué)康達(dá)學(xué)院附屬連云港市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇連云港 00）

Alport 綜合征(Alport syndrome，AS)是以血尿、蛋白尿、進(jìn)行性腎損傷伴或不伴高頻感音性耳聾及視力異常為臨床特征的遺傳性腎炎[1-2]。典型的病理變化為電鏡下腎小球基底膜出現(xiàn)花籃狀改變[3]。AS已被證實(shí)是由COL4A3，COL4A4 和COL4A5 基因突變導(dǎo)致[4]。遺傳方式上，X 連鎖AS（X-linked Alport syndrome,XLAS）是最為常見的AS 類型，約占80%～85%，其次為常染色體隱性遺傳AS 和常染色體顯性遺傳AS[5]。臨床上，患者的診斷主要依據(jù)典型的臨床癥狀和病理變化。然而，患者臨床異質(zhì)性較大，病理特征常不典型，容易造成臨床誤診[6-8]。另外在缺乏有效治療的情況下，腎病逐漸從最初的鏡下血尿發(fā)展為蛋白尿和腎功能不全，最終導(dǎo)致終末期腎病。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，外顯子捕獲測(cè)序技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，已成為單基因遺傳病致病基因研究的主要手段。本研究擬探討外顯子捕獲高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)AS 病因診斷及明確遺傳方式的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 2019年12月來我院就診的一遺傳腎病家系。根據(jù)腎活檢和免疫熒光檢測(cè)結(jié)果，先證者初步診斷為IgA 腎病。連云港市中醫(yī)院倫理委員會(huì)根據(jù)《赫爾辛基原則宣言》審查并批準(zhǔn)了我們的研究方案。經(jīng)患者簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑 基因組DNA 提取試劑（Qiagen,Germany）；全外顯子組捕獲芯片（NimbleGen,Roche）；高通量測(cè)序平臺(tái)Illumina Hiseq 2500；ABI DNA 一代測(cè)序儀。

1.3 研究方法

1.3.1 外顯子捕獲高通量測(cè)序:抽取先證者及家系成員EDTA 抗凝外周血4ml，按DNA 提取試劑盒步驟進(jìn)行DNA 提取。捕獲芯片(NimbleGen,Roche)覆蓋了355 個(gè)基因的所有外顯子以及側(cè)翼10bp。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行目標(biāo)序列捕獲、富集、建庫(kù)和高通量測(cè)序。雙端測(cè)序由天津華大基因股份有限公司Illumina Hiseq2500 平臺(tái)完成。

1.3.2 生物信息學(xué)分析:由Illumina Pipeline version(1.3.4)軟件處理測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)，然后使用BWA（Burrows Wheeler Aligner）軟件包比對(duì)干凈讀數(shù)[9]。由SOAP snp 軟件確定snp，GATK indelGenotyper 確定插入和缺失變異[10]。在分析流程中，使用千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)、dbSNP 數(shù)據(jù)庫(kù)和華大內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(kù)作為對(duì)照人群數(shù)據(jù)庫(kù)、采用SIFT[11]和Polyphen-2[12]算法來預(yù)測(cè)錯(cuò)義突變對(duì)基因功能的影響，變異位點(diǎn)的保守性由Phylop(phyloP46wayPlacental)軟件計(jì)算得來。

1.3.3 Sanger 測(cè)序驗(yàn)證 :針對(duì)檢測(cè)出可能致病的突變位點(diǎn)，應(yīng)用Primer Premier 5 軟件設(shè)計(jì)該位點(diǎn)的特異性引物，PCR 擴(kuò)增先證者及家系成員的相應(yīng)位點(diǎn)，擴(kuò)增產(chǎn)物采用ABl3730x1 DNA 測(cè)序儀進(jìn)行雙端測(cè)序并分析測(cè)序結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 先證者臨床表型及病理特征 先證者（III-1），男，7 歲，臨床表現(xiàn)為血尿、蛋白尿、正常腎功能，無腎外表現(xiàn)。電鏡下基底膜厚薄不一，基質(zhì)有輕度至中度增生，并有電子致密物質(zhì)沉積于基質(zhì)中。免疫熒光顯示大量IgA 和IgM 沉積，IV 型膠原免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示α3 和α5 染色正常，先證者被初步診斷為IgA 腎病。有報(bào)道顯示大劑量的潑尼松能顯著提高IgA 腎病預(yù)后并有效控制蛋白尿[13]?；颊呙刻旖o予口服潑尼松60mg 維持4 周，每4 周減少劑量5～10mg，并與嗎替麥考酚酯聯(lián)用0.5g /次，每天2 次。經(jīng)過16 周的治療，患者仍然有大量的蛋白尿，顯示治療效果不佳。

2.2 NGS 測(cè)序結(jié)果及生物信息學(xué)分析結(jié)果 見圖1，表1。通過高通量測(cè)序，檢測(cè)到先證者（III-1） 攜帶COL4A5 c.3667G>C (p.G1223R) 基因突變。此突變?yōu)楦拾彼嶂脫Q突變。在千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)、dbSNP 數(shù)據(jù)庫(kù)及華大本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)均無記錄，PolyPhen-2 和SIFT 算法預(yù)測(cè)此變異有害。Phylop軟件預(yù)測(cè)此變異高度保守，根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)院（ACMG）的標(biāo)準(zhǔn)[14]，該變異歸為可能致病性突變。

表1 AS 家系成員臨床資料和基因突變結(jié)果

圖1 Sanger 測(cè)序驗(yàn)證COL4A5 c.3667G>C (p.G1223R)突變

2.3 Sanger 測(cè)序家系驗(yàn)證結(jié)果 見圖2。此家系先證者（III-1）攜帶COL4A5 基因突變c.3667G>C(p.G1223R)，先證者母親（II-2）為此突變的雜合子，先證者舅舅（II-3）亦攜帶此突變。

圖2 先證者家系圖

3 討論

AS 是一種進(jìn)行性遺傳性腎病，以血尿、蛋白尿伴或不伴腎外表現(xiàn)（如高頻感音性耳聾及視力下降）為臨床特征[2]。通常情況下患者臨床異質(zhì)性較大，缺乏特異性臨床表現(xiàn)及病理變化[2,8]。因此通過臨床特征和病理變化很難與其他腎臟疾病進(jìn)行鑒別診斷。在我們的研究中，先證者臨床表現(xiàn)為血尿和蛋白尿，通過腎活檢和免疫熒光檢測(cè)初步診斷為IgA 腎病。先證者及其家系其他成員未見典型AS樣病變，不符合FLINTER 等[15]AS 的診斷標(biāo)準(zhǔn)。以往的研究表明大劑量潑尼松龍能有效地減輕IgA患者尿蛋白的水平并改善患者預(yù)后[13]。經(jīng)過16 周的治療，患者仍然有大量的蛋白尿，顯示治療效果不佳。因此，我們猜測(cè)可能有其他的因素影響治療效果。通過外顯子捕獲高通量測(cè)序，我們檢測(cè)到COL4A5 c.3667G>C (p.G1223R)突變，明確了AS的臨床診斷及致病機(jī)理。可見基因診斷在精準(zhǔn)診療中具有重要作用。

外顯子組測(cè)序在米勒綜合癥的研究中首次得到成功的應(yīng)用，隨后通過外顯子組測(cè)序發(fā)現(xiàn)了局灶節(jié)段性腎小球腎炎、多囊腎等孟德爾疾病的新的致病基因突變[16-17]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，外顯子捕獲測(cè)序技術(shù)已成為單基因病遺傳病致病基因研究的主要手段。我們的研究數(shù)據(jù)表明，外顯子捕獲測(cè)序技術(shù)能夠在較短時(shí)間對(duì)AS 進(jìn)行病因診斷及明確遺傳方式。基因檢測(cè)相對(duì)于傳統(tǒng)方法有較大優(yōu)勢(shì)。與腎活檢相比，基因檢測(cè)使用外周血DNA 對(duì)患者進(jìn)行基因分析，其侵入性要小得多。

總之，我們的研究明確了此XLAS 家系的致病機(jī)理并發(fā)現(xiàn)一新突變COL4A5 c.3667G>C(p.G1223R)，拓寬了非典型Alport 綜合征患者COL4A5 基因突變譜。同時(shí)也為研究XLAS 患者與IgA 患者的鑒別診斷提供思路和參考。