邢瑞青，彭道榮，劉 楊

（空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院臨床實驗研究所，西安 710032）

胰腺癌（pancreatic carcinoma，PC）是消化系統(tǒng)惡性程度最高的腫瘤，其早期診斷困難，手術切除率和生存率低，預后極差[1-2]。我國胰腺癌年發(fā)病率約為9.2/10 萬，病死率約為8.1/10 萬[3]。目前胰腺癌的臨床診斷主要依賴于費用昂貴的影像學檢查或有創(chuàng)檢查。選擇血清腫瘤標志物篩查具有創(chuàng)傷小，易于隨訪，患者依從性高等優(yōu)點，同時可提高可疑患者的檢出效率,降低醫(yī)療費用。臨床上目前常用的血清蛋白標志物有糖類抗原199（carbohydrate antigen199，CA199）， 糖類抗原242（carbohydrate antigen242，CA242）和糖類抗原50（carbohydrate antigen50，CA50）等，但這些標志物的敏感度均不超過80%，特異度也不盡如人意[4]，因此需要改進檢測技術或用新的標志物來取代它們。

異常凝血酶原-Ⅱ（protein induced by vitamin K absence or antagonist- Ⅱ，PIVKA- Ⅱ） 在1984年由LIEBMAN 等首次提出[5]，目前主要應用于肝細胞癌的臨床研究。近年來發(fā)現(xiàn)其在胰腺癌及消化道腫瘤中也有升高。涎液化糖鏈抗原(kerbs von den lungen-6， KL-6)是一種唾液酸化的大分子黏蛋白（mucins，MUC），屬MUC1 家族，以分子糖基發(fā)生唾液酸化為特點，最初用于間質性疾病的輔助診斷，近年研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌、肝癌壺腹部癌等消化系統(tǒng)腫瘤患者的血清或組織中KL-6 表達異常，有望成為一種新型消化道腫瘤標志物。本研究通過與傳統(tǒng)血清標志物CA199 比較，回顧性分析KL-6,PIVKA-Ⅱ在胰腺癌患者、胰腺炎患者以及正常人群的表達水平，初步探討CA199，KL-6,PIVKA-Ⅱ單項及聯(lián)合檢測對胰腺癌的診斷效能。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇2020年1月～5月來空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院就診胰腺癌患者49 例，男性32 例，女性17 例，平均年齡55.54±10.29 歲。胰腺炎患者44 例，其中男性36 例，女性8 例，平均年齡43.11±10.56 歲。健康對照組均來自本院健康體檢人群，隨機抽取42 例，男性29 例，女性13 例，平均年齡44.00±10.89 歲。胰腺癌組、胰腺炎組與健康對照組年齡、性別經(jīng)統(tǒng)計學分析差異無統(tǒng)計學意義，資料具可比性(P＞0.05)。所有研究對象入選前均簽署知情同意書。胰腺癌納入標準：①均為初診；②入組前未接受過相關放療、化療、免疫治療；③病理檢查確診；④預計生存期超過3 個月；⑤臨床資料完整。排除標準：①肝癌轉移性胰腺癌患者；②伴有肝硬化的胰腺癌患者；③存在凝血功能障礙的胰腺癌患者均不納入腫瘤組。胰腺炎的納入標準：①均為初診；②入組前未進行過任何治療；③病理檢查或CT、核磁等影像學檢查確診。排除標準：①伴有肝硬化；②凝血功能障礙；③胰腺囊腫患者均不被納入胰腺炎組。

1.2 儀器與試劑 CA199 采用瑞士羅氏E601 型電化學發(fā)光分析儀進行檢測，羅氏原裝試劑，應用伯樂腫瘤標志物復合質控，校準品為羅氏原裝。KL-6和PIVKA-Ⅱ采用日本Lumipulse G1200 全自動化學發(fā)光酶免分析儀檢測，試劑由珠海麗珠股份有限公司提供。CA199，KL-6 和PIVKA-Ⅱ質控品，校準品均為原裝配套試劑。

1.3 方法

1.3.1 標本收集方法：受檢者均于入院后第2 天清晨空腹靜脈采血3～4ml，3 000r/min 離心10min，分離血清于-70℃凍存待測。對照組采集清晨空腹靜脈血3～4ml，同樣按上述方法處理。所有標本均無乳糜及溶血。

1.3.2 指標陽性判斷標準：KL-6 ＞205.00U/ml，PIVKA- Ⅱ＞40.00 mAU/ml，CA199 ＞27.00U/ml為陽性，小于上述值為陰性；聯(lián)合檢測中有一項陽性即為陽性標準。

1.3.3 計算CA199，KL-6 和PIVKA-Ⅱ單項診斷及三項聯(lián)合診斷的靈敏度、特異度、準確度、陽性預測值及陰性預測值:靈敏度=真陽性/（真陽性+假陰性）×100%；特異度=真陰性/（真陰性+假陽性）×100%；準確度=（真陽性+真陰性）/總例數(shù)×100%；陽性預測值=真陽性/真陽性+假陽性×100%；陰性預測值=真陰性/真陰性+假陰性×100%。

1.3.4 檢測方法：CA199 采用電化學發(fā)光法檢測；KL-6 和PIVKA-Ⅱ采用化學發(fā)光酶免法檢測。所有檢驗操作嚴格按照實驗室室內質量控制文件進行。在試驗標本檢測前、檢測中、檢測后分別進行質控檢測。室內質控和室間質評均合格。

1.4 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料，因樣本濃度均呈偏態(tài)分布，故以M（P25,P75）表示，組間比較采用非參數(shù)Kruskal-Wallis 檢驗，兩兩比較采用MannWhitneyU檢驗。計數(shù)資料用百分率（%）表示，采用卡方檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。繪制受試者工作特征（ROC）曲線，計算曲線下面積（AUC）。

2 結果

2.1 胰腺癌組、胰腺炎組及健康對照組血清CA199，PIVKA-Ⅱ和KL-6 水平比較 見表1、表2。胰腺癌組血清CA199，PIVKA-Ⅱ和KL-6 水平均高于胰腺炎組和健康對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）；胰腺炎組與健康對照組間血清CA199，PIVKA-Ⅱ和KL-6 水平差異均無統(tǒng)計學意義（均P>0.05）。

表1 胰腺癌組、胰腺炎組與健康對照組血清CA199，PIVKA-Ⅱ,KL-6 水平比較〔M（P25,P75）〕

表2 胰腺癌組、胰腺炎組與健康對照組血清CA199，PIVKA-Ⅱ,KL-6 水平比較統(tǒng)計學結果

2.2 CA199，PIVK Ⅱ，KL-6 及各指標聯(lián)合檢測對胰腺癌的診斷效能 見表3。以CA199，PIVKA-Ⅱ，KL-6 為檢驗變量，以是否為胰腺癌為狀態(tài)變量，繪制ROC 曲線并計算AUC，敏感度(Sen)，特異度（Spe），陽性預測值（PPV），陰性預測值（NPV）及準確度（ACC）。ROC 曲線結果顯示，CA199，PIVKA-Ⅱ，KL-6 單一及聯(lián)合檢測均對胰腺癌具有一定的診斷價值（均P<0.05）。CA199，PIVKA-Ⅱ，KL-6 三項聯(lián)合檢測對胰腺癌診斷的敏感度、特異度、陰性預測值及準確度的差異具有統(tǒng)計學意義（χ2分別為42.11，37.22，17.94,21.03，均P<0.05）。

表3 CA199，PIVK Ⅱ,KL-6 及各指標聯(lián)合檢測對胰腺癌的診斷效能（%）

3 討論

CA199 主要指唾液酸化的LewisA 血型抗原[6]，是目前胰腺癌診斷中最重要、使用最頻繁的標志物。其廣泛存在于Lewis 血型抗原呈陽性的胰腺導管上皮、膽囊上皮、膽管上皮以及胃腸道上皮等細胞的細胞膜上。當胰腺導管上皮細胞發(fā)生惡性病變時，CA199 表達明顯升高；加之胰管以及胰腺小導管被腫瘤阻塞，從而促使CA199 侵入癌灶周圍的基質中，進一步流入血液導致血清中CA199 水平顯著升高[7-8]。林文科等[9]研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌患者血清CA199 表達水平較胰腺良性腫瘤者高。本研究顯示，相較與胰腺炎組和健康對照組，胰腺癌患者血清CA199 水平顯著升高，說明胰腺癌患者血清CA199 存在明顯高表達。然而，CA199 在敏感度和特異度方面，不同的研究結果存在一定的差異。一項最近匯集了11 項研究包括2 316 例研究對象的Meta 分析發(fā)現(xiàn)[10]，CA199 診斷胰腺癌的敏感度和特異度均為80.00%。林文科等[9]的研究顯示，CA199 在胰腺癌診斷中的敏感度和特異度分別為81.20%和79.30%。另外，如果按照目前臨床上應用的臨界值37U/ml（廠商說明書提供），CA199 的靈敏度為70.20%，特異度僅為63.00%，并且超過1/3 的胰腺炎患者血清CA199 表達水平是升高的。本研究中，CA199 診斷胰腺癌的敏感度和特異度均不高，為67.30%和70.30%，與廠家提供的結果一致。CA199 對胰腺癌診斷敏感度和特異度方面的差異，可能與不同研究所納入的研究對象存在差異相關。同時，CA199 不僅在胰腺癌中升高，其他惡性腫瘤如直腸癌、膽囊癌、膽管癌、胃癌和肝癌及良性病變如梗阻性黃疸、肝硬化、膽囊炎和其他胃腸道疾病中也可升高。另外，有研究報道[11]，在缺乏巖藻糖基轉移酶和不能有效合成Lewis 血型抗原的患者中，5%～10%的患者不表達CA199；此外，CA 19-9 的準確性還會因疾病分期而存在差異。中華醫(yī)學會腫瘤學分會胰腺癌早診早治專家共識中指出[12]，單項CA199 的主要臨床應用是作為監(jiān)測腫瘤進展和治療反應的標志物。

除CA199 外，本研究顯示，胰腺癌患者血清PIVKA-Ⅱ和KL-6 處于高表達水平，均顯著高于胰腺炎患者和健康人群。提示PIVKA-Ⅱ和KL-6 亦可作為臨床診斷胰腺癌的血清學指標。

異常凝血酶原是指維生素K 缺乏或拮抗劑Ⅱ誘導的蛋白質（PIVKA-Ⅱ）,又稱為脫-γ-羧基凝血酶原（DCP）,它是肝臟合成的無凝血活性的異常凝血酶原。近年來，許多研究報道PIVKA-II 是胃腸道惡性腫瘤的生物標志物，尤其是原發(fā)性肝癌的重要生物標志物，其血清值與腫瘤大小和微血管轉移相關，并可預測腫瘤復發(fā)[13]。胰腺和肝臟起源于胚胎的原始前腸，普遍認為這兩個器官具有靜態(tài)轉化為彼此組織的能力。因此，PIVKA-II 作為原發(fā)性肝癌的特征性標志物，也可以在胰腺癌中可靠地表達。此外，PIVKA-II 不僅在存在腫瘤細胞的情況下由肝臟產生，而且在缺乏維生素K 的情況下也由肝臟產生。各種體外和體內研究表明，維生素K 直接（由于其抑制腫瘤生長和引起腫瘤細胞凋亡的能力）和間接通過蛋白質（包括PIVKA-II）的翻譯后激活發(fā)揮抗癌作用，因此被認為是多種惡性腫瘤的標志物[14]。由此推測胰腺癌中PIVKA-II 高濃度的機制，一方面，與肝臟和胰腺的共同前腸起源、它們的胚胎接近以及它們相互轉化能力相關；另一方面，PIVKA-II 可能反映了維生素K 狀態(tài)與胰腺癌的相關性。

MUC 是一種高分子量的糖蛋白，其作用包括對上皮組織的保護和更新分化、細胞黏附的調節(jié)及對細胞信號通路的影響。胰腺導管癌及癌細胞株中通常表達MUC1，而在大多數(shù)胰腺炎及正常胰腺組織中MUC1 則低表達。有研究發(fā)現(xiàn)，胰液中MUC1 和MUC5A 二者的mRNA 水平均隨病情進展而升高，MUC 有望成為非常有用的胰腺癌診斷標志物[15-16]。其中MUC1 與正常細胞存在明顯差異，即其寡糖結構唾液酸化增強，其改變與腫瘤的發(fā)生、轉移相關[17-18]。KL-6 是糖基發(fā)生唾液酸化的MUC1 黏蛋白，其在腫瘤組織或血清中的表達上調可反映腫瘤的轉移潛能。由于KL-6 位于細胞表面，易被抗體識別，通過抗體檢測血清或組織中的KL-6 水平，可進行腫瘤診斷的臨床評估和預后判斷。XU 等報道[19]，KL-6/MUC1 在胰腺癌組織中均呈高表達，但在周圍正常胰腺組織中無表達,KL-6/MUC1 的表達譜在抑制劑處理后顯著降低。

通過對CA199，PIVKA- Ⅱ和KL-6 三個指標對胰腺癌診斷效能的分析發(fā)現(xiàn)，單項CA199，PIVKA-Ⅱ和KL-6 檢測診斷胰腺癌的ROC 曲線下面積分別為0.776，0.682 和0.690,對胰腺癌診斷的敏感度分別為67.30%，63.40% 和64.20%,特異度為70.30%，73.40% 和71.10%。CA199，PIVKA-Ⅱ和KL-6 對胰腺癌的診斷效能與既往報道存在一定的差異。TARTAGLIONE 等[14]報道，PIVKA-Ⅱ的ROC 曲線下面積為0.860，可作為診斷胰腺癌的潛在標志物。董靜肖等[20]發(fā)現(xiàn)，PIVKA-II 和CA199 鑒別診斷胰腺癌與胰腺炎的ROC 曲線下面積分別為0.721 和0.735，PIVKAII 和CA199 最佳臨界值分別為32.49mAU/ml 和119.95 U/ml,此時靈敏度分別為71.40%和62.50%,特異度分別為73.90%和95.70%。趙曉嬌等[21]報道，KL-6 的ROC 曲線下面積為0.987，以>232U/ml 為界，診斷胰腺癌的敏感度高達96.00%，特異度為94.00%。CA199，PIVKA-Ⅱ及KL-6 其中任意兩項聯(lián)合檢測時，敏感度顯著提高，但特異性又略有下降；而當三項聯(lián)合檢測時，對胰腺癌的診斷效能最大，其診斷胰腺癌的敏感度和特異度分別提高至85.70%和76.50%,準確度也達到74.90%。提示三項聯(lián)合檢測可以彌補單項和兩項檢測對胰腺癌診斷的敏感度或特異度較低的不足，防治對胰腺癌的漏診，提高對胰腺癌與胰腺炎的鑒別診斷，提高檢出率。

綜上所述，CA199，PIVKA-Ⅱ和KL-6 在胰腺癌臨床診斷中均具有一定的應用價值，CA199，PIVKA-Ⅱ和KL-6 三項聯(lián)合檢測可提高胰腺癌診斷敏感度、特異度及準確度。但納入標本量較少，未對CA199，PIVKA-Ⅱ和KL-6 在胰腺癌不同分期、轉移及預后方面的相關性進行進一步的探討，是本研究的不足之處。