歐陽航，陳德波，駱時木，楊培東，吳一波，張志珊

（福建醫(yī)科大學附屬泉州第一醫(yī)院 a.檢驗科；b.乳腺外科，福建泉州 362000）

每年在世界范圍內(nèi)大約有170 萬例乳腺癌新發(fā)病例，發(fā)病率處于較高水平[1]。而在我國，女性乳腺癌的發(fā)病率同樣處于高水平，發(fā)病例數(shù)及死亡例數(shù)占全球的11.2%和9.2%[2]。當前依靠影像學評價治療療效有滯后的缺點，如果能有高效的監(jiān)測指標，將避免部分患者因為無效治療或過度治療而導致治療失敗。因此，我們需尋找一種高效的評價乳腺癌患者治療療效的生物指標。

有研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌患者的早期便可在外周血中發(fā)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells CTC）[3]。這部分CTC 可能具有不同的生理特點及致病機制，因此尋找具有特異性分子標志的高侵襲性CTC 亞群對研究疾病的預后及治療將有重要作用。CTC 從原發(fā)灶腫瘤組織中脫落進入外周血循環(huán)系統(tǒng)過程中會經(jīng)歷上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT），研究發(fā)現(xiàn)該過程將極大提高腫瘤侵襲能力[4]。參與EMT 過程的間質(zhì)標志物波型蛋白Vimentin 屬于纖絲蛋白家族中一員，其在腫瘤細胞中表達將增加腫瘤的生長速度和侵襲力。另有研究發(fā)現(xiàn)，蛋白激酶B（AKT1）作為PI3K/Akt 信號途徑中的核心成分，與腫瘤細胞增殖狀態(tài)相關(guān)。其在乳腺癌癌旁正常組織中無表達，在癌組織中高表達，提示AKT1 高表達可能在乳腺癌細胞癌變的過程中起一定作用[6]，目前尚未有關(guān)于CTC 中AKT1 的表達與晚期乳腺癌患者治療療效存在關(guān)聯(lián)的報告，因此有待進一步研究。本實驗將采用陰性富集技術(shù)進行乳腺癌患者CTC 富集，并聯(lián)合qRT-PCR 技術(shù)檢測EMT 間質(zhì)標志物Vimentin mRNA、細胞增殖標志物AKT1 的mRNA表達情況，以期建立無創(chuàng)的外周血生物標志物監(jiān)控腫瘤患者轉(zhuǎn)移及預后的方法，為乳腺癌患者的預后判斷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 本實驗收集從2018年6月～2020年1月期間，福建醫(yī)科大學附屬泉州第一醫(yī)院乳腺外科收治的經(jīng)病理學初次確診為晚期乳腺癌的女性患者43 例，平均年齡49.6±9.3 歲，其中Ⅳ期轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者27 例，Ⅲ期局部晚期乳腺癌患者16 例。另外納入15 例健康志愿者，平均年齡38.8±8.9 歲。分別抽取患者進行治療前及2 個周期治療結(jié)束后的靜脈血7.5ml。疾病組納入標準：①經(jīng)我院確診為晚期乳腺癌的初治患者。主要包括初診即伴有遠處轉(zhuǎn)移或治療后出現(xiàn)復發(fā)轉(zhuǎn)移的乳腺癌、及不可手術(shù)的局部晚期乳腺癌（locally advanced breast cancer，LABC），病理分期上講通常指除T3N1M0 以外的IIIa，IIIb，IIIc 及IV 期乳腺癌。②患者依從性良好，ECOG 評分為0，1 或2。③根據(jù)實體瘤療效評價標準（RECIST）指南標準至少有一個可測量病灶。TNM 分期標準采用美國癌癥聯(lián)合委員會AJCC(第八版)標準。本研究已獲得泉州市第一醫(yī)院倫理委員會的批準書及受試者的知情同意。

1.2 儀器與試劑 循環(huán)腫瘤細胞差相富集試劑盒（美國Cytelligen 公司）；RNeasy Micro Kit（德國Qiagen）；RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒SYBR 熒光染料（日本TaKaRa）；PCR 擴增儀（德國Eppendorf公司）；實時熒光定量PCR 儀（瑞士羅氏公司）；血清CEA，CA125 及CA15-3 檢測使用I2000SR 雅培全自動化學發(fā)光免疫分析儀及相應配套檢測試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 治療方法：患者治療方案包括化療或者化療聯(lián)合分子靶向治療、內(nèi)分泌治療或者內(nèi)分泌治療聯(lián)合分子靶向治療，所有治療方案均為2011 版中國乳腺癌臨床實踐指南所推薦的治療方案，且包含化療方案中化療線數(shù)不超過第三線。

1.3.2 CTC 的富集：為防止上皮細胞污染，棄掉前2ml 血液后，收集患者外周血7.5ml 于枸櫞酸鈉抗凝管，混勻，4h 內(nèi)處理。按照循環(huán)腫瘤細胞差相富集試劑盒說明書操作步驟，待富集到循環(huán)腫瘤細胞，棄上清至100μl 后做進一步處理。

1.3.3 qRT-PCR 反應：按照RNeasy Micro Kit 操作說明提取上述100μl 細胞液的RNA 后，RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA 合成，SYBR 熒光染料試劑盒進行qRT-PCR。實時定量PCR 引物由Primer Premier6 設計得出，合成由日本TaKaRa 完成。內(nèi)參基因GAPDH正向：5’-CAAATTCC ATGGCACCGTCA-3’，反向：5’- GACTCCACGACGTACTCAGC-3’；Vimentin 正向：5’- AGTCCACTGAGTACCGGAGAC -3’，反向：5’- CATTTCACGCATCTGGCGTTC -3’；AKT1 正向：5’-CTGCACAAACGAGGGGAGTA-3’，反向：5’-TCACGTTGGTCCACATCCTG-3’。所得結(jié)果分析采用2-ΔΔCt方法?！鳌鰿t=(待測樣品目的基因Ct平均值-待測樣本內(nèi)參基因Ct平均值)-(健康對照樣品目的基因Ct平均值-健康對照樣本內(nèi)參基因Ct平均值)。

1.3.4 乳腺癌患者療效評定標準：影像學RECIST評定標準：影像學的RECIST 標準是以患者治療2～3 個周期后，通過超聲或者CT 等影像方法測量實體腫瘤的最大經(jīng)線，比較治療前后差異。治療的效果分為四類：疾病進展(progressive disease，PD)：基線病灶長徑總和增加≥20%或者出現(xiàn)新

的病灶；疾病穩(wěn)定(stable disease，SD)：基線病灶長徑總和有縮小但未達到PR 或者有增加但未達到PD；部分緩解(partial response，PR)：基線病灶長徑總和縮小≥30%；完全緩解(complete response，CR)：所有目標病灶消失。以PR+CR 認定為治療有效，PD+SD 為治療無效。

1.4 統(tǒng)計學分析 實驗所得數(shù)據(jù)使用SPSS20.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用GraphPad Prism 7.0軟件進行數(shù)據(jù)的作圖。計數(shù)資料采用率（%）表示，計量資料呈偏態(tài)分布時，用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示，并用Wilcoxon 符號秩和檢驗比較。呈正態(tài)分布時采用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用Student’st檢驗。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 治療前Vimentin mRNA 和AKT1 mRNA 的表達水平 乳腺癌組Vimentin mRNA 和AKT1 mRNA表達量（2.32±2.17，1.91±0.93）均大于健康對照組（1.22±0.76，1.23±0.83），差異具有統(tǒng)計學意義（t=2.841，2.480，均P＜0.05）。

2.2 治療前Vimentin 及AKT1 mRNA 表達量與臨床特征的相關(guān)性 見表1。AKT1 mRNA 表達量與晚期乳腺癌患者的臨床分期、ER 狀態(tài)、PR 狀態(tài)存在相關(guān)性（P＜0.05），Vimentin mRNA 表達量與患者的PR 狀態(tài)存在相關(guān)性（P＜0.05）。

表1 治療前Vimentin 和AKT1 mRNA 表達量與患者臨床特征的相關(guān)性（±s）

表1 治療前Vimentin 和AKT1 mRNA 表達量與患者臨床特征的相關(guān)性（±s）

臨床病理特征 nVimentin 表達量t 值P 值AKT1 表達量t 值P 值年齡（歲） ＜50242.18±2.31 0.4830.632 1.74±0.97 1.3380.188≥50192.50±2.022.13±0.88絕經(jīng)狀態(tài) 絕經(jīng)前282.09±2.18 0.9570.344 1.72±0.90 1.8940.065絕經(jīng)后152.75±2.152.27±0.91 Ki67 ＜15%52.25±2.31 0.0770.939 1.58±0.79 0.8320.410≥15%382.32±2.181.96±0.96臨床分期情況 III 期162.59±2.45 0.6280.534 2.31±1.05 2.2700.029 IV 期272.16±2.021.67±0.79 ER 狀態(tài) 陽性231.84±2.18 1.5890.120 1.64±0.97 2.1280.039陰性202.87±2.072.23±0.80 PR 狀態(tài) 陽性231.54±1.65 2.6280.013 1.60±0.87 2.4560.018陰性203.21±2.382.27±0.91 HER-2 狀態(tài) 陽性192.86±2.66 1.4700.149 2.03±0.93 0.7170.478陰性241.89±1.621.82±0.95

2.3 治療前后Vimentin mRNA 和AKT1 mRNA 表達量變化與治療效果的相關(guān)性 在接受隨訪的38 例患者進一步復查且根據(jù)影像學RECIST1.1 標準對其評估治療療效。治療前乳腺癌患者的Vimentin mRNA相對表達量為2.32±2.17，治療后為1.30±0.75，治療前后差異具有統(tǒng)計學意義（t=2.879，P=0.006）；治療前AKT1 mRNA 相對表達量為1.91±0.93，治療后為1.52±0.57，治療前后的AKT1 mRNA 表達量差異具有統(tǒng)計學意義（t=2.282，P=0.026）。此外，治療后Vimentin mRNA 相對表達量降低的患者其治療有效率70.37%（19/27），高于治療后呈現(xiàn)升高者的27.27%（3/11）的治療有效率，差異具有統(tǒng)計學意義（Pa=0.028，a：Fisher’s exact test）。

3 討論

乳腺癌作為女性最常見的一種惡性腫瘤，僅2015年全球因乳腺癌死亡的人數(shù)約為50 萬，占因癌癥而死亡人數(shù)的14%[7]。CTC 作為“液態(tài)活檢”的良好指標，不僅對患者預后有提示意義，而且可以輔助乳腺癌早期診斷，CTC 變化的監(jiān)測在臨床治療方案的選擇等方面同樣具有重要的指導意義[8]。有研究指出，CTC 上的分子表型可以用于證實腫瘤細胞在尚不明原因的轉(zhuǎn)移性患者中的性質(zhì)和生物學起源[9]。如ARDAVANIS 等[10]的研究證實針對患者組織學檢測人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）狀態(tài)陰性但其外周血中的CTCs 表達HER-2 陽性的患者，也能從曲妥珠單抗治療中獲益。因此我們需要選取最有潛力的CTC 表型標志物作為監(jiān)測指標。而在本研究選取的CTC 兩種表型標志物中，Vimentin作為EMT 過程中的重要間質(zhì)型標志物，而AKT1基因則與腫瘤增殖狀態(tài)相關(guān)，最終會增強腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的能力，在近年來一直受到關(guān)注。Vimentin 是保持細胞完整度的眾多中間絲中的一種蛋白質(zhì)，可參與細胞黏附、遷移和運動。YU等[11]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者中的CTC 可通過上皮-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化進入外周血循環(huán)中，因此部分CTC具有間質(zhì)細胞表型的特征。另外王合兵等[12]人結(jié)論表明CK19 和Vimentin 在早期乳腺癌（I 期+II期）中表達相比健康組升高，這與本研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)的晚期乳腺癌組患者外周血CTC 中Vimentin mRNA 表達量高于健康對照組相似。有學者指出，Vimentin 過表達易導致癌細胞的轉(zhuǎn)移并影響患者的預后[13]。本研究通過檢測晚期乳腺癌患者治療前后Vimentin mRNA 表達量的變化佐證了該觀點。我們發(fā)現(xiàn)患者在治療后Vimentin 表達量較治療前有一定的降低，且在治療后Vimentin 表達量降低的患者有更高的治療有效率（P＜0.05），提示我們可通過觀察患者治療前后Vimentin 表達量的變化來監(jiān)測治療療效。本研究中另一個CTC 相關(guān)表型標志物AKT 是PI3K/Akt 信號途徑中的核心成分，與調(diào)節(jié)細胞存活等多種重要的生物學功能具有相關(guān)性，與腫瘤細胞增殖能力有關(guān)。目前已有多種針對AKT的小分子抑制劑藥物研發(fā)，然而也有研究發(fā)現(xiàn)抑制AKT1 的功能后，反而促進了乳腺癌的轉(zhuǎn)移[14]。值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)相比Ⅲ期的局部晚期乳腺癌患者，IV 期的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者AKT1 mRNA 表達量更低。部分學者認為AKT1 在乳腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著不同的作用[15-16]。通過激活AKT1 可促進腫瘤細胞的增殖，但會抑制腫瘤細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。相反當AKT1 功能受抑制而表達下降后，雖然癌細胞的生長受到抑制，但是其轉(zhuǎn)移能力則顯著加強。這或許解釋了本研究入組的IV 期轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者其AKT1 mRNA 表達量更低的原因。此外通過檢測患者治療前后AKT1 mRNA 表達量，發(fā)現(xiàn)治療后表達量較治療前有一定的降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但并未發(fā)現(xiàn)其表達量的降低與治療療效之間存在關(guān)系。AKT1 能否作為一個有效地監(jiān)測療效的標志物還有待進一步的研究。

本研究通過實驗發(fā)現(xiàn)了CTC 表型標志物Vimentin，AKT1 對于晚期乳腺癌的療效監(jiān)測有一定的應用價值，但尚存在一些不足。受限于研究時間，本研究中入組的樣本量較少，今后還將擴大樣本量做進一步研究。另外治療后CTC 表型標注Vimentin，AKT1 表達量的降低是否能改善患者的預后，在未做長期的隨訪前還暫時未知，今后我們也將繼續(xù)對這些患者進行跟蹤研究。