朱 嬌，孫國才，劉素榮，王英英

(1.兵器工業(yè)五二一醫(yī)院a.腫瘤血液病科;b.老年病科，西安 710065;2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤二科，陜西咸陽 712000)

食管癌(esophagus cancer,EC)是我國常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病較隱匿，患者就診時大多已處于中晚期，致死率高[1-2]。臨床上對EC 患者主要采用手術(shù)治療并輔以放療、化療和生物治療，大量研究顯示中晚期EC 患者的生存率較早期明顯降低，因此早期的EC 診療是提高患者預(yù)后的關(guān)鍵點(diǎn)[3]。近年來有報道指出神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuronspecific enolase,NSE)對EC 的診斷具有一定價值和意義[4]，但敏感度不高。目前已有多種與EC 密切相關(guān)的長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)被鑒定出來，其廣泛分布于血清、腦脊液和血漿等體液中[5]。lncRNA ITGA9-AS1 在乳腺癌中低表達(dá)且與患者病理特征惡化有關(guān)[6]，關(guān)于lncRNA ITGA9-AS1 在EC 中的表達(dá)及意義尚不明確。本研究通過測定NSE 和血清lncRNA ITGA9-AS1 水平，旨在分析其在EC 中的診斷價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇2018年5月～～2019年7月兵器工業(yè)五二一醫(yī)院收治的112 例EC 可疑病變患者為研究對象，其中男性59 例，女性53 例；年齡30～71 歲，平均年齡51.04±8.97 歲。經(jīng)病理學(xué)檢查確診67 例EC 患者為EC 組，45 例食管良性病變?yōu)槭彻芰夹圆∽兘M(食管炎12 例、食管潰瘍27 例和Barrett 食管6 例)。本研究經(jīng)由我院倫理委員會審批。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①研究對象均經(jīng)胃鏡檢查有黏膜粗糙和食管糜爛等表現(xiàn)，出現(xiàn)吞咽不適、反酸等不適者；②臨床資料完整；③自愿參與本研究且簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并重要臟器功能衰竭者；②并發(fā)其他惡性腫瘤和嚴(yán)重感染者。

1.2 儀器與試劑 雅培I2000 型電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，Trizol 試劑購自Invitrogen 公司，SYBR Green Realtime PCR Master Mix 擴(kuò)增試劑盒購自日本ToYoBo 公司，TakaRa Prime-Script RT reagent kit購自大連寶生物工程有限公司，血清RNA 提取試劑盒購自北京天根公司，熒光定量PCR 儀(美國Bio-rad 公司)，lncRNA ITGA9-AS1 及內(nèi)參引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 方法 采集兩組晨起空腹肘靜脈血3 ml，12 000 r/min離心10 min 分離血清，-20℃保存。采用電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀和配套試劑盒檢測NSE 水平。

取EC 組織和食管良性病變組織，采用血清RNA 提取試劑盒提取組織中的總RNA，采用Taka-Ra Prime-Script RT reagent kit 將血清總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用實(shí)時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)檢測血清lncRNA ITGA9-AS1和內(nèi)參基因GAPDH 的水平。lncRNA ITGA9-AS1引物序列為：F:5’-GTTCTGAAAATCACAGTCATC CCTA-3’，R:5’-TGTGCTTCCGTCACCTCTAAATC-3’。GAPDH 引物序列為：F:5’-ATTCCATGGCACCGT CAAGGCTGA-3’，R:5’-TTCTCCATGGTGGTG AAGACGCCA-3’。95℃預(yù)變性2 min，95℃ 15s，60℃30s 共40 個循環(huán)，用2-ΔΔCt值計(jì)算lncRNA ITGA9-AS1 的相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，滿足正態(tài)性分布及方差齊性的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)分析，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清NSE 和lncRNA ITGA9-AS1 水平的比較 EC 組患者血清NSE（22.71±3.03μg/L vs 2.98±0.22μg/L）和lncRNA ITGA9-AS1（0.88±0.21 vs 0.64±0.14）的表達(dá)水平高于食管良性病變組，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.33，6.41，均P=0.00）。

2.2 EC 患者NSE 和lncRNA ITGA9-AS1 水平與病理分期、腫瘤浸潤深度的關(guān)系 見表1。III 期EC 患者血清NSE 和lncRNA ITGA9-AS1 水平顯著高于I期和II 期，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，另外腫瘤浸潤深度T4 血清NSE 和lncRNA ITGA9-AS1水平顯著高于T1，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

表1 EC 患者NSE 和lncRNA ITGA9-AS1水平與病理分期、腫瘤浸潤深度的關(guān)系

2.3 血清NSE，lncRNA ITGA9-AS1 水平與EC 患者病理分期、腫瘤浸潤深度的相關(guān)性 Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，血清NSE，lncRNA ITGA9-AS1 水平與EC 患者病理分期、腫瘤浸潤深度呈顯著正相關(guān)(r=0.142，P=0.005；r=0.171，P=0.013)。

2.4 血清NSE，lncRNA ITGA9-AS1 聯(lián)合檢測對EC 的診斷價值 血清NSE，lncRNA ITGA9-AS1 診斷敏感度均較低（23.9%，53.0%），但均具有較高的特異度（93.7%，90.2%）。聯(lián)合檢測在EC 中有較高的敏感度和特異度，分別為82.1%和83.2%。

3 討論

EC 位居世界癌癥死因的第6 位，我國EC 患者的死亡和發(fā)病病例約占全球的50%，尤其是醫(yī)療衛(wèi)生相對欠發(fā)達(dá)的中西部農(nóng)村高發(fā)地區(qū)，EC 給當(dāng)?shù)鼗颊邘砹司薮蟮慕?jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神壓力[7]。EC 發(fā)病隱匿導(dǎo)致就診時患者大多無法治愈，預(yù)后較差。流行病學(xué)指出發(fā)展中國家EC 患者的5年生存率小于5%，NSE 是神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞特有烯醇化酶的同工酶，在小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)中過量表達(dá)[8]，其還可用于小兒神經(jīng)母細(xì)胞瘤病情和治療效果的評估[9]。屈雪等[10]指出NSE在EC 患者中的表達(dá)高于食管良性病變組，但是單獨(dú)檢測其特異度較低。目前已有多種與EC 密切相關(guān)的lncRNA 被鑒定出來，其廣泛分布于血清、腦脊液和血漿等體液中[11-12]。lncRNA ITGA9-AS1 在乳腺癌中低表達(dá)且與患者病理特征惡化有關(guān)，關(guān)于lncRNA ITGA9-AS1 在EC 中的表達(dá)及意義尚不明確。本研究通過測定血清NSE 和lncRNA ITGA9-AS1 水平，旨在分析其在EC 中的診斷價值。

本研究結(jié)果顯示：相較于食管良性病變組，EC組患者血清NSE 和lncRNA ITGA9-AS1 過量表達(dá)，并且隨著EC的進(jìn)展，分期愈晚，腫瘤浸潤深度愈深，血清NSE 和lncRNA ITGA9-AS1 水平愈高，說明NSE 和lncRNA ITGA9-AS1 可用于EC 的早期診斷。但敏感度、特異度分析提示，單一標(biāo)志物檢測敏感度欠佳，無法用于EC 的診斷和病情評估，應(yīng)用價值有限。當(dāng)聯(lián)合NSE 和lncRNA ITGA9-AS1 時敏感度和特異度均較高，分別為82.1%和83.2%，說明聯(lián)合檢測可有效彌補(bǔ)單項(xiàng)指標(biāo)檢測敏感度不強(qiáng)的缺點(diǎn)。

綜上所述，血清NSE 和lncRNA ITGA9-AS1 聯(lián)合檢測可提高EC早期診斷的敏感度，值得深入研究。