王楷翔，曹 明，陳 暉，趙 娟

（1.保定市人民醫(yī)院a.分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室；b.肝病科，河北保定 071000；2.保定市第二中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北涿州 072750）

丙型肝炎病毒（hpatitis C virus,HCV）可導(dǎo)致慢性丙型肝炎（chronic hepatitis C,CHC）、肝硬化，部分患者發(fā)展為肝癌，是全球范圍內(nèi)重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1-2]。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一類高度保守的非編碼RNA，其在丙型肝炎中存在異常表達(dá)，可能在丙型肝炎的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用[3-4]。近期的研究指出，miR-199 及miR-483 表達(dá)水平與HCV 所致的相關(guān)肝炎有關(guān)，在肝臟疾病的發(fā)病機(jī)制和進(jìn)展中起著重要作用，是診斷和監(jiān)測(cè)肝臟疾病進(jìn)展的潛在無(wú)創(chuàng)生物標(biāo)志物[5-6]。為此，本研究通過(guò)檢測(cè)血清miR-199 及miR-483 水平在HCV 感染肝病患者中的表達(dá)情況，分析miR-199 及miR-483 對(duì)肝癌的診斷價(jià)值，旨在為該病的診療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取保定市人民醫(yī)院2018年1月～2020年12月收治的121 例HCV 感染患者，其中男性70 例，女性51 例，年齡28 ～68（49.25±9.70）歲。121 例HCV 感染患者中慢性丙型肝炎50 例，肝硬化43 例，肝癌28 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：CHC 的診斷參考《丙型肝炎防治指南》[7]；排除標(biāo)準(zhǔn)：存在其他類型肝病及感染性疾病。另設(shè)計(jì)對(duì)照組50 例為體檢正常者，其中男性27 例，女性23 例，年齡30 ～65（48.60±9.35）歲。各組年齡、性別比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

1.2 儀器與試劑 SLAN96P 型熒光定量PCR 儀（上海宏石公司），PCR 試劑盒、RNeasy 試劑盒、miRNA Easy 試劑盒和Trizol 試劑盒均購(gòu)自上海生工生物工程公司，貝克曼Au680 全自動(dòng)生化分析儀。

1.3 方法

1.3.1 丙肝病毒載量（hepatitis C virus-RNA，HCV-RNA）檢測(cè)：所有研究對(duì)象在治療前采集靜脈血5ml，離心分離血清，HCV-RNA 載量使用熒光定量PCR 儀檢測(cè)。

1.3.2 miR-199 及miR-483 檢測(cè)：使用熒光定量PCR 儀檢測(cè)miR-199 及miR-483，反應(yīng)體系為20 μl：10μl TaqMan 通用混合物溶液（2×），1μl引物及探針Mix（20×），1.33 μl 反向轉(zhuǎn)錄脫氧核糖核酸，7.67μl 雙蒸水。采用2-△△Ct法計(jì)算miR-199 及miR-483 水平。

1.3.3 相關(guān)檢測(cè)：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平采用貝克曼Au680 全自動(dòng)生化分析儀及配套試劑檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。應(yīng)用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析miR-199 及miR-483 診斷肝癌的價(jià)值。相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組ALT，AST 及HCV-RNA 水平比較 見(jiàn)表1。肝癌組、肝硬化組和CHC 組ALT 及AST 水平均明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.316,10.972,9.625,13.417,11.805,10.611,均P<0.001）。各組間HCV-RNA比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.715,0.924,0.583,均P>0.05）。

表1 各組ALT，AST 及HCV-RNA 水平比較

2.2 各組血清miR-199 及miR-483 表達(dá)水平比較 見(jiàn)表2。與對(duì)照組比較，肝癌組、肝硬化組和CHC組血清miR-199 及miR-483 表達(dá)水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=14.704，12.151，11.904，16.825，13.512，13.106， 均P<0.001）； 且血清miR-199 及miR-483 表達(dá)水平在肝癌組均明顯高于CHC 組和肝硬化組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.553，11.604，14.817，13.216，均P<0.001）。

表2 各組血清miR-199 及miR-483 表達(dá)水平比較（±s）

表2 各組血清miR-199 及miR-483 表達(dá)水平比較（±s）

項(xiàng)目對(duì)照組（n=50）CHC 組（n=50）肝硬化組（n=43）肝癌組（n=28）FP miR-1990.80±0.141.70±0.651.83±0.723.40±1.2515.736<0.001 miR-4830.71±0.081.93±0.822.04±0.913.86±1.6218.227<0.001

2.3 miR-199 及miR-483 診斷肝癌的價(jià)值 見(jiàn)表3和圖1。miR-199 及miR-483 診斷肝癌的最佳截?cái)嘀禐?.28 和2.53，二者聯(lián)合診斷肝癌的曲線下面積（0.922，95%CI ：0.858～0.977）最大，明顯高于單項(xiàng)miR-199（0.811，95%CI：0.753～0.870）及miR-483（0.850，95%CI：0.788～0.912），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.270，5.812，均P<0.05），其敏感度和特異度為93.7%和86.4%。

圖1 miR-199 及miR-483 診斷肝癌的ROC 曲線

表3 miR-199 及miR-483 診斷肝癌的價(jià)值

2.4 miR-19 與miR-483 的相關(guān)性分析 見(jiàn)圖2。Pearson 相關(guān)分析顯示，CHC 組血清miR-199 表達(dá)水平與miR-483 呈正相關(guān)（r=0.725，P<0.001），肝癌組血清miR-199 表達(dá)水平與miR-483 呈正相關(guān)（r=0.803，P<0.001）。

圖2 血清miR-199 表達(dá)水平與miR-483 的相關(guān)性

3 討論

miRNA 作為基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，在丙型肝炎的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用[8]。國(guó)內(nèi)外研究表明，miRNA 具有調(diào)節(jié)肝臟的生理和病理功能，其表達(dá)改變與肝臟代謝失調(diào)、肝損傷、肝纖維化和腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，使得miRNA 成為診斷和治療肝臟疾病的重要策略，未來(lái)可能是肝癌診斷、治療和預(yù)后判斷的無(wú)創(chuàng)性生物標(biāo)志物[9-10]。ELHEFNY 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，miR-199 異常表達(dá)與肝癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和凋亡有關(guān)，可能在肝臟疾病的進(jìn)展中發(fā)揮潛在作用，是診斷和監(jiān)測(cè)肝臟疾病進(jìn)展一個(gè)有用的生物標(biāo)志物。TANG 等[12]研究認(rèn)為，miR-483與肝癌的發(fā)生有關(guān)，在肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲中發(fā)揮促進(jìn)作用，其高表達(dá)是肝癌患者生存期縮短的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，可作為肝癌的診斷和預(yù)后評(píng)估的潛在標(biāo)志物。

本研究顯示，與對(duì)照組比較，肝癌組、肝硬化組和CHC 組血清miR-199 及miR-483 表達(dá)水平均明顯升高，且肝癌組血清miR-199 及miR-483 表達(dá)水平升高最明顯。提示miR-199 及miR-483 高表達(dá)促進(jìn)了病情進(jìn)展，其在丙型肝炎的發(fā)展過(guò)程中具有一定的促進(jìn)作用。有研究指出，miRNA 在HCV 感染過(guò)程中參與了病毒復(fù)制，這些miRNA 可以直接靶向HCV 基因組參與調(diào)控丙型肝炎的發(fā)病，與肝細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[13]。LU 等[14]研究顯示，miR-483 在肝癌組織中顯著上調(diào)，并能顯著促進(jìn)肝癌細(xì)胞在體外的遷移和侵襲，是肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的重要調(diào)控因子和復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可作為評(píng)估肝癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的生物標(biāo)志物。肝癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率都很高,尋找新的、可靠的、無(wú)創(chuàng)的生物標(biāo)志物對(duì)提高肝癌的早期診斷具有重要意義。本研究ROC 曲線顯示，miR-199 及miR-483二者聯(lián)合診斷肝癌的曲線下面積最大，其敏感度為93.7%，特異度為86.4%，相關(guān)分析結(jié)果也顯示，肝癌組miR-199 與miR-483 呈顯著正相關(guān)。這說(shuō)明miR-199 及miR-483 二者聯(lián)合檢測(cè)有助于提高肝癌診斷的價(jià)值，有望作為肝癌診斷的生物學(xué)指標(biāo)。JIAO 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，miR-199 是反映肝損傷的一種新的生物標(biāo)志物，與肝功能密切相關(guān)，對(duì)評(píng)估肝癌患者預(yù)后和反映治療效果具有很好的價(jià)值。另有研究表明，miR-483 表達(dá)水平在肝癌的不同生物學(xué)過(guò)程中起著重要作用，其在肝癌患者中的表達(dá)水平高于肝硬化患者，可作為診斷HCV 感染后肝癌患者的潛在生物標(biāo)志物[16]。

綜上所述，血清miR-199 及miR-483 水平在HCV 感染患者中明顯升高，而且在肝癌患者中升高最明顯，miR-199 及miR-483 二者聯(lián)合檢測(cè)有助于提高肝癌診斷的價(jià)值，可能是肝癌治療的潛在靶向。