王 海，肖 華，陳興壯

（1.三亞市中醫(yī)院檢驗科，海南三亞 572019；2.三亞中心醫(yī)院檢驗科，海南三亞 572000）

膿毒癥是一種嚴重威脅人類生命的急危重癥[1]。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）作為一類新型的基因調(diào)控分子，參與膿毒癥的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后[2]。近期的研究發(fā)現(xiàn)，miR-223-3p 參與炎癥基因調(diào)控和宿主-病原相互作用，是膿毒癥發(fā)病的關(guān)鍵，與膿毒癥器官損傷的發(fā)展有關(guān)，可能為了解膿毒癥的發(fā)病機制提供新的方向[3]。降鈣素原（procalcitonin，PCT）是一種有效反映炎癥反應(yīng)程度的實驗室指標(biāo)，常用于評價膿毒癥患者的嚴重程度、預(yù)后及治療效果，在指導(dǎo)臨床醫(yī)生使用抗生素中具有較好的應(yīng)用價值[4]。白細胞介素-6（interleukin-6,IL-6）及C 反應(yīng)蛋白（C-reactive protein,CRP）作為評估炎癥反應(yīng)程度的常用指標(biāo)，在細菌感染、組織損傷或炎癥反應(yīng)時其水平顯著升高，與膿毒癥患者感染嚴重程度和器官功能障礙密切相關(guān)[5]。本研究通過檢測膿毒癥患者血漿miR-223-3p，PCT，IL-6 及CRP 水平，分析四項聯(lián)合檢測對膿毒癥診斷及預(yù)后預(yù)測的價值，以期為膿毒癥的診療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2018年1月～2020年10月在三亞市中醫(yī)院和三亞中心醫(yī)院收治的146 例膿毒癥患者，其中男性87 例，女性59 例，年齡36 ～85（60.83±10.37）歲。根據(jù)146 例膿毒癥患者28 天的生存情況，將其分為101 例存活組和45 例死亡組。納入標(biāo)準：①參考2012 國際嚴重膿毒癥及膿毒性休克診療指南[6]；②臨床隨訪資料完整。排除標(biāo)準：①并發(fā)血液系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病及惡性腫瘤者；②放棄治療，不能配合研究者。同期選取60 例體檢正常者作為對照組，其中男性37 例，女性23 例，年齡40 ～82（62.50±9.40）歲。各組年齡、性別比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。本研究開展之前與患者或家屬簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑 TL988-II 實時熒光定量PCR 檢測儀、PCR 試劑盒、RNeasy 試劑盒、miRNA Easy 試劑盒和Trizol 試劑盒均購自廣州銳博生物有限公司，CL-2200i 邁瑞全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，7600 型日立全自動生化分析儀。

1.3 方法

1.3.1 miR-223-3p 檢測:采集靜脈血3 ml 于EDTA抗凝管中，離心分離血漿，在ABI 7500 型熒光定量PCR 儀上檢測miR-223-3p 水平。反應(yīng)體系為20μl：1μl 引物及探針Mix（20×），10μl TaqMan通用混合物溶液（2×），1.33 μl 反向轉(zhuǎn)錄脫氧核糖核酸，7．67μl雙蒸餾水。以 U6作為miR-223-3p內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算miR-223-3p 表達水平。

1.3.2 PCT，IL-6，CRP 檢測：使用貝克曼DXI800全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測PCT 及IL-6；使用日立7600 系列全自動生化分析儀，采用免疫透射比濁法檢測CRP。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS20.0 統(tǒng)計軟件分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。應(yīng)用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析miR-223-3p 聯(lián)合PCT，IL-6 及CRP 對膿毒癥診斷及預(yù)后預(yù)測的價值。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膿毒癥組和對照組血漿miR-223-3p，PCT，IL-6 及CRP 水平比較 見表1。膿毒癥組血漿miR-223-3p，PCT，IL-6 及CRP 水平均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.001）。

表1 膿毒癥組和對照組血漿miR-223-3p，PCT，IL-6 及CRP 水平比較（±s）

表1 膿毒癥組和對照組血漿miR-223-3p，PCT，IL-6 及CRP 水平比較（±s）

項 目對照組（n=60）膿毒癥組（n=146）tP miR-223-3p 0.37±0.082.15±0.9213.805<0.001 PCT（ng/ml）0.02±0.0113.50±6.4814.620<0.001 IL-6（pg/ml）5.37±1.4574.12±15.7010.512<0.001 CRP（mg/L）3.82±1.4637.26±10.158.783<0.001

2.2 死亡組和存活組血漿miR-223-3p，PCT，IL-6及CRP 水平比較 見表2。死亡組血漿miR-223-3p，PCT，IL-6 及CRP 水平均明顯高于存活組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.001）。

表2 死亡組和存活組血漿miR-223-3p，PCT，IL-6 及CRP 水平比較（±s）

表2 死亡組和存活組血漿miR-223-3p，PCT，IL-6 及CRP 水平比較（±s）

項目存活組（n=101）死亡組（n=45）tP miR-223-3p 1.31±0.503.04±1.1613.390 <0.001 PCT（ng/ml）6.72±3.1521.28±10.28 16.317 <0.001 IL-6（pg/ml）56.17±10.20 102.83±21.75 8.936 <0.001 CRP（mg/L）25.75±8.24 56.40±15.30 7.415 <0.001

2.3 miR-223-3p 聯(lián)合PCT，IL-6 及CRP 診斷膿毒癥的價值 見表3 和圖1。miR-223-3p 聯(lián)合PCT，IL-6 及CRP 診斷膿毒癥的曲線下面積（0.905，95%CI ：0.847～0.968）明顯高于單項miR-223-3p（0.815，95%CI：0.753～0.877），PCT（0.827，95%CI：0.766～0.885），IL-6（0.785，95%CI ：0.724～0.845）及CRP（0.760，95%CI ：0.708～0.817），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05），其敏感度為92.0%，特異度為83.4%。

圖1 miR-223-3p 聯(lián)合PCT，IL-6 及CRP 診斷膿毒癥的ROC 曲線

表3 miR-223-3p 聯(lián)合PCT，IL-6 及CRP 診斷膿毒癥的價值

2.4 miR-223-3p 聯(lián)合PCT，IL-6 及CRP 預(yù)測膿毒癥患者死亡的價值 見表4 和圖2。miR-223-3p 聯(lián)合PCT，IL-6 及CRP 預(yù)測膿毒癥患者死亡的曲線下面積（0.933，95%CI：0.875～0.990）明顯高于單項miR-223-3p（0.850，95%CI ：0.788～0.911），PCT（0.836，95%CI：0.778～0.895），IL-6（0.794，95%CI ：0.734～0.856）及CRP（0.782，95%CI：0.720～0.843），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05），其敏感度為95.3%，特異度為87.5%。

表4 miR-223-3p 聯(lián)合PCT，IL-6 及CRP 預(yù)測膿毒癥患者死亡的價值

圖2 miR-223-3p 聯(lián)合PCT，IL-6 及CRP 預(yù)測膿毒癥患者死亡的ROC 曲線

3 討論

miRNA 作為一類非編碼RNA 分子，參與了膿毒癥后期的細胞凋亡、免疫抑制和器官功能障礙，可能在膿毒癥診斷和預(yù)后方面起重要的作用[7]。有研究表明，miRNA 在膿毒癥相關(guān)性炎癥反應(yīng)以及器官損傷過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，其表達水平變化與膿毒癥病程發(fā)展有關(guān)，監(jiān)測分析miRNA 水平可以輔助診斷膿毒癥和判斷疾病預(yù)后[8]。BENZ等[9]研究發(fā)現(xiàn)，miR-223-3p 作為miRNA 的一類新型基因調(diào)控分子，不僅參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，而且與膿毒癥的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。PCT 是降鈣素的前肽物質(zhì)，是預(yù)測膿毒癥患者死亡率和感染性休克的良好指標(biāo)[10]。IL-6作為一種促炎性反應(yīng)因子，可通過介導(dǎo)多種免疫細胞參與膿毒癥早期的炎癥反應(yīng)過程，有助于膿毒癥的早期診斷[11]。CRP 是一種急性時相反應(yīng)蛋白，是反映細菌感染較為敏感的指標(biāo)，對評估膿毒癥患者的病情發(fā)展有一定的意義[12]。

本研究結(jié)果顯示，膿毒癥組血漿miR-223-3p，PCT，IL-6 及CRP 水平均明顯高于對照組，死亡組血漿miR-223-3p，PCT，IL-6 及CRP 水平均明顯高于存活組，說明miR-223-3p，PCT，IL-6 及CRP水平在膿毒癥患者中明顯升高，死亡患者引起的炎癥反應(yīng)無法得到有效地控制，血漿miR-223-3p，PCT，IL-6 及CRP 水平顯著升高；而存活患者的感染得到有效地控制，循環(huán)、呼吸等臟器功能逐漸穩(wěn)定，其水平下降。分析其原因可能是死亡患者炎癥反應(yīng)較嚴重，引起大量炎癥因子釋放，造成免疫功能嚴重紊亂，使得miR-223-3p，PCT，IL-6 及CRP水平于治療后仍繼續(xù)升高。提示血漿miR-223-3p表達水平呈明顯升高的膿毒癥患者，病情較為嚴重，臨床上需及時采取有效的治療措施，以降低患者死亡率。ZHAO 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者miRNA表達水平明顯升高，而且與疾病嚴重程度、器官功能損害及病死率明顯相關(guān)，可以作為評估膿毒癥患者病情嚴重程度和預(yù)后的一個有用的生物學(xué)指標(biāo)。另有研究表明，作為膿毒癥診斷的常用指標(biāo)，與IL-6 及CRP 聯(lián)合檢測能夠顯著提高膿毒癥的診斷和預(yù)后評估水平，對膿毒癥病情嚴重程度及預(yù)后判斷具有重要價值[5]。

本研究應(yīng)用ROC 曲線分析顯示，miR-223-3p對膿毒癥診斷及預(yù)后預(yù)測的曲線下面積與PCT 相當(dāng)，其敏感度和特異度均高于IL-6 或CRP，miR-223-3p 聯(lián)合PCT，IL-6 及CRP 對膿毒癥診斷及預(yù)測死亡的AUC 最大，其敏感度和特異度較高；而單獨檢測IL-6 或CRP 對膿毒癥診斷及預(yù)后預(yù)測的特異度較低，其應(yīng)用價值有限。提示miR-223-3p對膿毒癥診斷及預(yù)后預(yù)測具有較好的價值，聯(lián)合PCT，IL-6 及CRP 檢測可彌補單項檢測的不足，能有助于提高膿毒癥診斷和預(yù)后預(yù)測的敏感度和特異度。ZHANG 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，膿毒癥患者miR-223-3p 表達水平明顯升高，其對膿毒癥診斷的敏感度和特異度分別為82.9%和100%，有望作為膿毒癥診斷的分子標(biāo)志物，也為膿毒癥基因水平治療提供新的思路。本研究中膿毒癥患者血漿miR-223-3p 表達水平與PCT，IL-6 及CRP 均呈正相關(guān)，進一步提示了miR-223-3p 聯(lián)合PCT，IL-6及CRP 可更好地預(yù)測膿毒癥患者的預(yù)后及診斷。桑珍珍等[15]研究表明，miRNA 表達水平在膿毒癥患者中明顯升高，對膿毒癥患者的預(yù)后評估具有一定的臨床價值，聯(lián)合PCT 檢測對評估膿毒癥預(yù)后具有較高的敏感度和特異度。

綜上所述，膿毒癥患者血漿miR-223-3p 表達水平明顯升高，聯(lián)合PCT，IL-6 及CRP 檢測對膿毒癥的診斷及預(yù)后預(yù)測具有良好的價值，可能為膿毒癥的基因靶向治療提供了新的研究方向。