胡艷正，牛彥杰，石鵬飛

（咸陽(yáng)市第一人民醫(yī)院胸外科，陜西咸陽(yáng) 712000）

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung canter，NSCLC）是臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤，約占肺癌類(lèi)型的85%，而肺腺癌是NSCLC 的一種，約占NSCLC 的20%～30%[1]。肺腺癌早期癥狀不明顯，臨床檢出率低，晚期轉(zhuǎn)移患者較多，預(yù)后不佳。因此對(duì)其進(jìn)行積極防治已成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟待解決的重要問(wèn)題。既往研究表明[2-3]，長(zhǎng)鏈非編碼RNA（LncRNAs）能夠調(diào)控基因表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)行為，影響癌癥的發(fā)生發(fā)展。且越來(lái)越多研究證明[4-6]，LncRNAs 在腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中扮演重要角色。故基于分子生物學(xué)角度探究肺腺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，找尋特異性治療靶點(diǎn)，對(duì)臨床攻克具有積極意義。LncRNA LINC00222 是位于6 號(hào)染色體，具有5 個(gè)外顯子的非編碼RNA。既往相關(guān)研究指出[7]，肝母細(xì)胞瘤中LINC00222 低表達(dá)，參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程，可作為評(píng)估細(xì)胞生物學(xué)行為及預(yù)后的預(yù)測(cè)標(biāo)志。然目前有關(guān)LINC00222 在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)功能及分子機(jī)制尚不明確且相關(guān)研究報(bào)道較少。因此，本研究通過(guò)構(gòu)建LINC00222過(guò)表達(dá)載體，探究了其對(duì)肺腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及遷移的影響及分子作用機(jī)制，以期探尋新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2019年10月～2020年10月期間在我院行手術(shù)治療的34 例肺腺癌患者的癌組織及其對(duì)應(yīng)癌旁正常組織，所有組織由術(shù)中獲取經(jīng)病理確診后制成組織標(biāo)本于低溫液氮中保存?zhèn)溆?。人肺腺癌?xì)胞系A(chǔ)549，LTEP-a-2 及人正常肺胚細(xì)胞系MRC-5 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，于含10 ml/dl胎牛血清1640 培養(yǎng)液，37℃，5 ml/dl CO2培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)，每48 h 傳代一次。

1.2 試劑及儀器 1640 培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；pCDNA3.1 載體、empty vector 空載體及GSK-3β 3’UTR 野生型（WT）或突變型（MUT）雙熒光素酶報(bào)告基因載體購(gòu)自中國(guó)金斯瑞公司；Lipo2000，Trizol 試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒購(gòu)自日本Takara 公司；CCK-8 反應(yīng)液、Hoechst33342 10 染液購(gòu)自日本 Dojindo 公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó) Bio-Tek 公司；Matrigel 購(gòu)自美國(guó) BD 公司；倒置熒光顯微鏡購(gòu)自美國(guó)Leica 公司；免疫印跡鼠抗兔p-GSK-3β，β-catenin，GSK-3β單克隆抗體及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗購(gòu)自美國(guó) CST 公司； ECL 發(fā)光液購(gòu)自中國(guó)碧云天公司；RIP 試劑盒購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司。

1.3 方法

1.3.1 LINC00222 生物信息學(xué)分析：通過(guò)檢索生物信息學(xué)網(wǎng)站及Gene Bank 數(shù)據(jù)庫(kù)，利用Primer5.引物設(shè)計(jì)軟件以GAPDH 為內(nèi)參檢索設(shè)計(jì)LINC00222 引物序列，LINC00222 上游 ：5’-GGCTCTGATCAGGCTAAGAG CA-3’，下游：5’-TGTTCGTCTGTAACAGGTGTCATGG-3’；GAPDH 上游：5’-TGGACGACTAACTGGTTAG G-3’，下游：5’-GGTATGCACTGTAGTCATCAG-3’，均由GenePharma 公司合成，于-20℃保存。

1.3.2 LINC00222 過(guò)表達(dá)載體及質(zhì)粒構(gòu)建：將LINC00222 序列全長(zhǎng)連接至pCDNA3.1 載體構(gòu)建pCDNA- LINC00222 質(zhì)粒，同時(shí)構(gòu)建empty vector空載體作為對(duì)照。融化的Jm109 感受態(tài)細(xì)胞加入構(gòu)建質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化挑取白色克隆，于LB 培養(yǎng)液震蕩過(guò)夜培養(yǎng)；將菌液移入EP 管離心棄上清，分次加入Buffer S1/S2/S3 反應(yīng)獲得白色沉淀，離心，棄甩出液；分次加入Buffer W1 /W2/W3 液，離心，棄甩出液，獲得質(zhì)粒DNA 并測(cè)定其濃度及純度。

1.3.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)：轉(zhuǎn)染前一天以2×105個(gè)/孔接種于6 孔板，每孔加入無(wú)抗培養(yǎng)液；雙無(wú)培養(yǎng)液稀釋質(zhì)粒DNA， Lipo2000 溶于雙無(wú)培養(yǎng)液，室溫混勻靜置制成轉(zhuǎn)染液加入每孔進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每4～6 h 更換一次培養(yǎng)液，37℃，5ml/dl CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～48 h 行基因表達(dá)檢測(cè)。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)：采用Trizol 試劑盒提取組織、細(xì)胞總RNA 并檢測(cè)其濃度及純度；按照M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒及其反應(yīng)體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，并以此為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增及基因檢測(cè)。引物由 Invitrogen 公司合成，LINC00222 引物序列上游：5’-GCGTGTGTACTGCCAAGGAGCA-3’，下游：5’TGTTCGTGTCTAAGAGCTGTCAACG-3’；內(nèi)參GAPDH 序列上游：5’-TGCACGACGAACTG CTTACG-3’，下游：5’-GCGATGCACTGTGCTCAT CAG-3’。反應(yīng)條件95℃10 min，95℃15 s，60℃60 s，72 ℃10 min，70 ℃30 s，循環(huán)40 次。使用美國(guó)Applied Biosystems 7900 儀器及2-ΔΔCt法進(jìn)行基因表達(dá)檢測(cè)分析。

1.3.5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：含10 ml/dl 胎牛血清1 640培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞接種于6 孔板，轉(zhuǎn)染6 h 后更換正常培養(yǎng)液；24 h 收集制成細(xì)胞懸液接種于96 孔板，100 μl/孔，37℃，5ml/dl CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；每孔加入CCK-8 反應(yīng)液，采用酶標(biāo)儀分別于0，24，48，72，96 h 測(cè)定細(xì)胞450 nm 處吸光度值并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3.6 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞培養(yǎng)、鋪板、轉(zhuǎn)染，制成細(xì)胞懸液；將105個(gè)細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液，加入Hoechst33342 10 染液，混勻孵育，離心棄上清；加入PBS 液懸浮細(xì)胞，避光加入PI 染液，混勻；取細(xì)胞懸液滴于載玻片，封片，共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況（細(xì)胞凋亡時(shí)細(xì)胞核呈濃染紅色）。

1.3.7 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：采用Marker 筆于6 孔板背面均勻畫(huà)線橫穿過(guò)孔；細(xì)胞培養(yǎng)、鋪板、轉(zhuǎn)染24 h后用槍頭垂直入背面橫線劃痕；PBS 液清洗，加入1640 培養(yǎng)液，拍照并標(biāo)記位置，37℃，5 ml/dl CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h 取出6 孔板，再次同位拍照記錄。

1.3.8 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：稀釋Matrigel，包被于Transwell 小室上室溫風(fēng)干，每孔加入含 10g/L BSA的無(wú)血清培養(yǎng)液孵育；常規(guī)消化、離心取沉淀，PBS 液清洗，10 g/dl BSA 的無(wú)血清培養(yǎng)液重懸，密度105個(gè)/ml；取細(xì)胞懸液加入Transwell 小室，24孔板下室加入含 10 ml/dl 胎牛血清1640 培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；取出小室，PBS 液清洗，95ml/dl酒精固定，DAPI 染色；隨機(jī)選取5 個(gè)視野于倒置熒光顯微鏡下計(jì)數(shù) ，取平均值。

1.3.9 免疫印跡實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞轉(zhuǎn)染、培養(yǎng)后用冷PBS 液清洗收集于EP 管，離心、棄上清， 加入RIPA 液裂解（蛋白磷酸化水平檢測(cè)時(shí)按100:1 比例在裂解液中加入Na3VO4），提取總蛋白。同方法獲取沉淀依次加入細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A 和B，渦旋、水浴、離心，取沉淀加入含 PMSF 細(xì)胞核蛋白抽提劑，提取細(xì)胞核蛋白。配置SDS-聚丙烯酰胺凝膠體系行上樣與電泳分離、轉(zhuǎn)印及封閉；TBST 液洗膜，加入p-GSK-3β 一抗，β-catenin抗體及 GSK-3β 抗體，孵育過(guò)夜；洗膜加入二抗辣根過(guò)氧化物酶，室溫孵育，PVDF 膜滴加 ECL發(fā)光液，檢測(cè)條帶。

1.3.10 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)：利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)LINC00222 與GSK-3β 的結(jié)合位點(diǎn)并經(jīng)體外克隆擴(kuò)增，設(shè)計(jì)具有預(yù)測(cè)靶位點(diǎn)的GSK-3β 3’UTR 野生型（WT）或突變型（MUT）雙熒光素酶報(bào)告基因載體，突變的3’UTR 區(qū)作為對(duì)照組。轉(zhuǎn)染前24 h 將A549，LTEP-a-2 細(xì)胞接種至24 孔板培養(yǎng)，使用Lipofectamine 2000 將構(gòu)建的熒光素酶報(bào)告基因載體和含有海腎熒光素酶的對(duì)照載體共轉(zhuǎn)染，在轉(zhuǎn)染48 h 后使用雙熒光素酶報(bào)道基因測(cè)定系統(tǒng)測(cè)定熒光素酶活性，測(cè)定LINC00222 對(duì)GSK-3β 熒光素酶活性的調(diào)控情況，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.11 RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染、培養(yǎng)，加入甲醛固定，PBS 液清洗，甘氨酸停止液終止反應(yīng)；加入含 PMSF 的 PBS 刮除液收集細(xì)胞至EP 管，離心、棄上清，滴入Complete lysis buffer裂解液重懸，冰上裂解，離心，棄上清，加入超聲液重懸（冰上操作），離心取上清加入DNA 酶處理樣品。EP 管洗磁珠，加入反應(yīng)體系，旋轉(zhuǎn)過(guò)夜；利用RIP 試劑盒行樣本收集及檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)錄入分析，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次取平均值數(shù)據(jù)，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組比較采用方差分析，重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量方差分析。P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌組織及癌旁正常組織中LINC00222 表達(dá) qRT-PCR 檢測(cè)34 例肺腺癌組織中LINC00222 mRNA 相對(duì)表達(dá)，結(jié)果顯示：肺腺癌組織中LINC 00222 相對(duì)表達(dá)量（0.324±0.186）顯著低于癌旁正常組織（1.056±0.547），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.388，P<0.001)。Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肺腺癌組織LI 中NC00222 蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示：肺腺癌組織中LINC00222 蛋白表達(dá)（0.427±0.149）同樣較癌旁正常組織明顯降低（0.997±0.162），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=15.100，P<0.001）。

2.2 肺腺癌細(xì)胞系中LINC00222 低表達(dá) qRTPCR 檢測(cè)顯示：人正常肺胚細(xì)胞系MRC-5 及肺腺癌A549，LTEP-a-2 細(xì)胞系中LINC00222 表達(dá)量分別是1.147±0.251，0.283±0.176，0.159±0.153，較正常肺胚細(xì)胞系相比，肺腺癌細(xì)胞系中LINC00222 顯著低表達(dá)（F=21.926，P=0.002）。

2.3 LINC00222 轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證 分別轉(zhuǎn)染pCDNALINC00222 及empty vector 載體至A549，LTEP-a-2細(xì)胞系，qRT-PCR 檢測(cè)顯示：與轉(zhuǎn)染empty vector載體（1.001±0.004） 相比，轉(zhuǎn)染pCDNA-LINC 00222載體后A549（8.351±1.554），LTEP-a-2（12.347±2.143）細(xì)胞中LINC00222 表達(dá)顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=42.538，P<0.001）。

2.4 LINC00222 抑制肺腺癌細(xì)胞增殖 見(jiàn)圖1。CCK-8 法檢測(cè)顯示：與轉(zhuǎn)染empty vector 載體相比，轉(zhuǎn)染pCDNA-LINC00222 載體后A549，LTEP-a-2細(xì)胞增殖能力顯著降低（P<0.05）。

圖1 CCK-8 檢測(cè)轉(zhuǎn)染pCDNA-LINC00222 后A549，LTEP-a-2 細(xì)胞增殖（*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）

2.5 LINC00222 促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞凋亡 見(jiàn)圖2。Hoechst 33342/PI 染色法檢測(cè)顯示：與轉(zhuǎn)染empty vector 載體相比，轉(zhuǎn)染pCDNA-LINC00222 載體后A549，LTEP-a-2 細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著增加（P<0.01）。

圖2 Hoechst 33342/PI 染色法檢測(cè)轉(zhuǎn)染pCDNA-LINC00222 后A549，LTEP-a-2 細(xì)胞凋亡情況（**P<0.01）

2.6 LINC00222 抑制肺腺癌細(xì)胞遷移及侵襲 見(jiàn)圖3。劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移、侵襲能力，結(jié)果顯示：與轉(zhuǎn)染empty vector 載體相比，轉(zhuǎn)染pCDNA-LINC00222 載體后A549，LTEP-a-2細(xì)胞遷移、侵襲能力受到明顯抑制。

圖3 劃痕實(shí)驗(yàn)（A）、Transwell 實(shí)驗(yàn)（B）檢測(cè)轉(zhuǎn)染pCDNA-LINC00222 后A549，LTEP-a-2 細(xì)胞遷移、侵襲情況

2.7 過(guò)表達(dá)LINC00222 增強(qiáng)GSK-3β 激酶活性，抑制β-catenin 核轉(zhuǎn)位 為驗(yàn)證肺腺癌中LINC00222對(duì)GSK-3β 激酶活性的影響，研究分別轉(zhuǎn)染pCDNA-LINC00222 及empty vector 載體至A549，LTEP-a-2 細(xì)胞。qRT-PCR 法檢測(cè)顯示：轉(zhuǎn)染后A549，LTEP-a-2 細(xì)胞中兩組GSK-3βmRNA 表達(dá)無(wú)顯著差異（P>0.05），見(jiàn)圖4。Western blot 法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后GSK-3β 在Ser9 磷酸化水平表達(dá)差異顯示：轉(zhuǎn)然后A549，LTEP-a-2 細(xì)胞GSK-3β 磷酸化水平顯著降低，GSK-3β總蛋白無(wú)明顯差異，見(jiàn)圖5，提示過(guò)表達(dá)LINC00222 增強(qiáng)GSK-3β 激酶活性。

圖4 qRT-PCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)染pCDNALINC00222 后A549，LTEP-a-2 細(xì)胞中GSK-3β mRNA 水平表達(dá)

圖5 Western blot 法檢測(cè)轉(zhuǎn)染pCDNALINC00222 后A549，LTEP-a-2 細(xì)胞中P-GSK-3β 和GSK-3β 蛋白表達(dá)

下游基因β-catenin 是否轉(zhuǎn)入細(xì)胞核繼續(xù)發(fā)揮作用由GSK-3β 催化活性直接調(diào)控影響。研究對(duì)肺腺癌中LINC00222 影響β-catenin 核轉(zhuǎn)位的作用機(jī)制進(jìn)行了驗(yàn)證。Western blot 法檢測(cè)顯示，轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)LINC00222 后，細(xì)胞核內(nèi)β-catenin 蛋白表達(dá)降低（P<0.05）；當(dāng)加入TWS119 抑制GSK-3β活性后，β-catenin 蛋白水平明顯恢復(fù)，見(jiàn)圖6，提示LINC00222 通過(guò)調(diào)控GSK-3β 催化活性進(jìn)而抑制β-catenin 核轉(zhuǎn)位。

圖6 Western blot 法檢測(cè)轉(zhuǎn)染pCDNA-LINC00222 或pCDNA-LINC00222+TWS119 后A549，LTEP-a-2 細(xì)胞核內(nèi)β-catenin 蛋白表達(dá)（*P<0.05，**P<0.01）.

2.8 熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證LINC00222 與GSK-3β 靶向關(guān)系 見(jiàn)圖7。為探究LINC00222 在肺腺癌中是否直接調(diào)控GSK-3β 表達(dá)，研究構(gòu)建了GSK-3β 的熒光霉素報(bào)告基因載體，利用生物信息學(xué)檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)GSK-3β 是LINC00222 的靶標(biāo)，通過(guò)雙熒光素酶標(biāo)記實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了LINC00222與GSK-3β 存在相互結(jié)合位點(diǎn)，提示兩者具備可能的調(diào)控關(guān)系。后將GSK-3β-3’UTR 質(zhì)粒及empty vector 和pCDNA-LINC00222 載體共轉(zhuǎn)染A549，LTEP-a-2 細(xì)胞，采用熒光霉素報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞中GSK-3β 表達(dá)活性，結(jié)果顯示：與empty vector 組相比，A549，LTEP-a-2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染pCDNALINC00222 后含有野生型GSK-3β-3’UTR 報(bào)告質(zhì)粒熒光素酶活性顯著降低（P<0.05），而含有突變型GSK-3β-3’UTR 的報(bào)告質(zhì)粒熒光素酶活性降低不明顯（P>0.05）。表明在基因水平上GSK-3β 受LINC00222 直接調(diào)控，GSK-3β 蛋白是LncRNA LINC00222 的靶標(biāo)。

圖7 熒光霉素報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證LINC00222 與GSK-3β 的調(diào)控關(guān)系（*P<0.05）

2.9 LINC00222 與GSK-3β 結(jié)合再次驗(yàn)證 見(jiàn)圖8。研究利用RPISeq 在線預(yù)測(cè)軟件對(duì)LINC00222與GSK-3β 蛋白的結(jié)合進(jìn)行了預(yù)測(cè)，通過(guò)轉(zhuǎn)染pCDNA-LINC00222 載體，采用RIP 法檢測(cè)顯示：LINC00222 與GSK-3β 蛋白相互結(jié)合。qRT-PCR法檢測(cè)顯示，GSK-3β 蛋白共沉淀中LINC00222表達(dá)顯著高于IgG 蛋白共沉淀（P<0.01）。進(jìn)一步證實(shí)LINC00222 通過(guò)與GSK-3β 蛋白相互結(jié)合調(diào)控GSK-3β 催化活性進(jìn)而抑制β-catenin 核轉(zhuǎn)位。

圖8 LINC00222 與GSK-3β 結(jié)合驗(yàn)證

3 討論

近年越來(lái)越多研究發(fā)現(xiàn)，癌癥的發(fā)生發(fā)展是多基因、多因素共同作用的結(jié)果，表明 LncRNAs 在疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色，參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的全部過(guò)程，與腫瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)。SHI 等[8-10]研究指出，LncRNAs 在胰腺癌、NSCLC 及前列腺癌中與患者預(yù)后密切相關(guān)，是影響患者預(yù)后的潛在因素。大量研究證實(shí)[11-12]，LncRNAs 在多種細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮著分化和發(fā)展、基因印跡及抗病毒反應(yīng)等多種功能，可通過(guò)與染色質(zhì)修飾復(fù)合物作用，參與并影響細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄活性；部分LncRNAs 可作為轉(zhuǎn)錄后修飾因子，對(duì)蛋白質(zhì)翻譯、mRNA 衰變及維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定等進(jìn)行調(diào)控。此外，ZHANG 等[13-14]研究證實(shí)，乳腺癌、肝癌、卵巢癌及NSCLC 中多種LncRNA 均差異性表達(dá)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡等生物學(xué)行為發(fā)揮促癌或抑癌作用，揭示了異常表達(dá)的LncRNA 是癌的一個(gè)標(biāo)志，可作為腫瘤潛在生物標(biāo)志物。LncRNA 與黏附蛋白相關(guān)基因及細(xì)胞黏附基因等的表達(dá)密切相關(guān)[15]，從側(cè)面反映了LncRNA 參與癌癥發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制。因此，探尋新的與肺腺癌相關(guān)的LncRNA，找尋安全有效的新的基因靶點(diǎn)，對(duì)肺腺癌臨床診治及提高患者預(yù)后具有重要意義。

LncRNAs 按其基因組位置可分為基因間、基因內(nèi)、雙向、正義及反義LncRNAs，而基因間LncRNAs 由兩個(gè)編碼基因間轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，參與各級(jí)鄰近基因的調(diào)節(jié)，也可作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器同RNA 間的相互作用來(lái)改變mRNA 的穩(wěn)定性[16-17]。而指導(dǎo)LncRNA，分子支架和誘捕LncRNA 是目前已被證實(shí)的LncRNA 作用模式。UCSC 基因組瀏覽器顯示，LINC00324 及LINC00222 均為基因間LncRNA。研究證實(shí)，LINC00324 在NSCLC 中低表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖、侵襲及遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抑癌作用[18]；系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中LINC00324 表達(dá)上調(diào)，是評(píng)估療效的輔助指標(biāo)[19]；LINC00324 參與胃癌、白血病的發(fā)生發(fā)展[20]。目前有關(guān)LncRNA LINC00222 在腫瘤中的作用研究較為缺乏，推測(cè)其在肺腺癌中應(yīng)與LINC00324 發(fā)揮同樣作用。為驗(yàn)證其猜想，本研究經(jīng)檢測(cè)顯示肺腺癌組織及細(xì)胞系中LINC00222 顯著低表達(dá)，通過(guò)構(gòu)建LINC00222過(guò)表達(dá)載體，實(shí)驗(yàn)探究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)LINC00222 能夠抑制肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示LINC00222 發(fā)揮抑癌基因作用。

腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中Wnt 信號(hào)通路發(fā)揮重要作用，GSK-3 亞型GSK-3β 作用于眾多結(jié)構(gòu)蛋白、信號(hào)蛋白及轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控細(xì)胞的分化、凋亡，發(fā)揮抑癌作用[21]。正常生理?xiàng)l件下，Wnt/β-catenin 信號(hào)通路未被激活，GSK-3β 通過(guò)與Axin/GSK-3β/APC/β-catenin 形成蛋白復(fù)合物，磷酸化β-catenin使其降解。當(dāng)腫瘤處于病理狀態(tài)時(shí)，Wnt 通路激活造成蛋白復(fù)合物解聚，抑制、介導(dǎo)β-catenin 磷酸化，激活下游基因表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生[22]。GSK-3β 催化活性是Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的關(guān)鍵[23]。研究表明[24-25]，GSK-3β 參與調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)，細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡和轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)器官生長(zhǎng)、死亡，起到抑癌作用；當(dāng)抑制GSK-3β 活性后，β-catenin 轉(zhuǎn)位入核，誘導(dǎo)下游基因表達(dá)，Wnt 通路激活，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)；Wnt 信號(hào)通路中GSK-3β 至關(guān)重要，其可磷酸化底物從而激活或失活Wnt 通路。且研究顯示，GSK-3β 介導(dǎo)Wnt/β-catenin 致癌通路活性進(jìn)而參與結(jié)腸癌的發(fā)展進(jìn)程[26]。CEBPA 介導(dǎo)的lncRNA PLIN2 上調(diào)通過(guò)GSK3 和Wnt/β-catenin 信號(hào)通路促進(jìn)慢性粒細(xì)胞白血病的發(fā)展[27]。MicroRNA-940靶向INPP4A 或GSK-3β，激活Wnt/β-Catenin 通路，調(diào)節(jié)膀胱癌細(xì)胞的惡性行為[28]。故本研究探究了肺腺癌中LINC00222 是否通過(guò)調(diào)控GSK-3β/β-catenin 信號(hào)通路進(jìn)而發(fā)揮作用，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)LINC00222 能夠降低GSK-3β Ser9 位點(diǎn)磷酸化水平，增加GSK-3β 激酶催化活性，抑制β-catenin核轉(zhuǎn)位，當(dāng)降低GSK-3β 催化活性時(shí)該抑制作用明顯減弱，提示LINC00222 可能通過(guò)調(diào)節(jié)GSK-3β 激酶活性影響下游β-catenin 核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而影響肺腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。另研究通過(guò)生物學(xué)信息軟件預(yù)測(cè)LINC00222 與GSK-3β 結(jié)合位點(diǎn)經(jīng)體外克隆擴(kuò)增，設(shè)計(jì)構(gòu)建了具有預(yù)測(cè)靶位點(diǎn)的GSK-3β 3’UTR 野生型或突變型報(bào)告基因載體，經(jīng)雙熒光素酶基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，GSK-3β 受LINC00222直接調(diào)控，GSK-3β是LINC00222 的靶標(biāo)；RIP 實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了LINC00222 與GSK-3β 蛋白存在相互結(jié)合，且發(fā)現(xiàn)GSK-3β 蛋白共沉淀中LINC00222表達(dá)顯著升高，推測(cè)可能是由于兩者的結(jié)合阻止GSK-3β磷酸化，增強(qiáng)GSK-3β活性，抑制β-catenin核轉(zhuǎn)位發(fā)揮作用進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞過(guò)程。然而肺腺癌發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其更深入的作用機(jī)制還需后續(xù)大量研究進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，肺腺癌中LINC00222 低表達(dá)，其可能通過(guò)調(diào)控GSK-3β 催化活性，抑制β-catenin核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而調(diào)控肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲，為肺腺癌的治療提供了新的研究方向。