周 娟，竺 青，孫桂芝，張紅衛(wèi)，郭成山，賀韋東，陳 敏

（1.山東省血液中心機(jī)采科，濟(jì)南 250014；2.深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院，廣東深圳 518101）

我國是乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染高發(fā)區(qū)，HBV 感染不僅可導(dǎo)致急性慢性病毒性肝炎，同時(shí)與肝硬化和肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，嚴(yán)重影響人類健康[1]。隱匿性HBV感染（occult hepatitis B virus infection，OBI） 即血清或肝組織中乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）檢測(cè)陰性而實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative，RT-qPCR）技術(shù)檢測(cè)HBV 陽性[2-3]。OBI 是HBV 感染的一種特殊類型，可通過輸血、器官移植、血液透析等方式傳播，是導(dǎo)致HBV 感染發(fā)生典型乙型肝炎的主要原因之一[4]。目前研究認(rèn)為OBI 可能與HBV S 基因等基因突變有關(guān)[5]，白細(xì)胞介素-28b（interleukin-28b，IL-28b）是一種重要細(xì)胞因子，在HBV 感染進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，其基因多態(tài)性與乙型肝炎病程密切相關(guān)[6-7]，但關(guān)于其rs8099917 位點(diǎn)、rs12979860 位點(diǎn)多態(tài)性與OBI 的關(guān)系尚鮮有研究。因此本研究以單采獻(xiàn)血者為研究對(duì)象，探究OBI 與IL-28b 基因rs8099917位點(diǎn)、rs12979860 位點(diǎn)多態(tài)性的關(guān)系，以期為臨床OBI 發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2016年1月～2019年12月山東省血液中心成功捐獻(xiàn)血小板的獻(xiàn)血者1 158 例為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～55 歲；②均經(jīng)酶免疫檢測(cè)和核酸檢測(cè)HBsAg、丙肝病毒檢測(cè)（hepatitis c virus，HCV）和人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）陰性合格者；③無血緣關(guān)系的本地常住居民；④至少成功捐獻(xiàn)1 次血小板者。本研究經(jīng)過山東省血液中心道德倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過。

1.2 主要儀器及試劑 血清乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）、表面抗體（hepatitis B surface antibody，HBsAb）、e 抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）、e 抗體（hepatitis B e antibody，HBeAb）和核心抗體（hepatitis B core antibody，HBcAb），試劑盒貨號(hào):YZB/國3575-2014，國食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2014 第3401094 號(hào)，購自深圳邁瑞生物醫(yī)療；DNA 提取試劑盒（貨號(hào)：DP348）購自北京雅安達(dá)生物技術(shù)有限公司；PureLink PCR 純化試劑盒（貨號(hào)：K310001）購自美國Thermo Fisher 公司；cobas HBV 定量核酸檢測(cè)試劑盒購自羅氏公司；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；Architect 分析儀購自美國雅培公司；7500 RT-qPCR 儀購自Thermofisher 公司等。

1.3 方法

1.3.1 資料收集: 收集每個(gè)獻(xiàn)血者獻(xiàn)血時(shí)性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、獻(xiàn)血狀態(tài)等臨床資料及血液標(biāo)本。

1.3.2 血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè):使用Architect 分析儀采用自動(dòng)化化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法對(duì)獻(xiàn)血者進(jìn)行HBsAg、抗HCV 抗體和抗HIV 抗體檢測(cè)。使用化學(xué)發(fā)光免疫分析法對(duì)檢測(cè)結(jié)果為陰性的受試者進(jìn)行anti-HBs 和anti-HBc 的進(jìn)一步檢測(cè)。anti-HBs ≥10.0 mIU/ml 和anti-HBc ≥1.0 s/CO 滴度時(shí)為陽性。

1.3.3 DNA 提取及IL-28b 基因多態(tài)性檢測(cè) :采用全基因組DNA 提取試劑盒提取所有獻(xiàn)血者血液DNA，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。IL-28b 基因rs 8099917 位點(diǎn)上游引物序列（5’→3’）：TTCA CCATCCTCCTCTCATCCCTCAT，下游引物序列（5’ →3’）：TCCTAAATTGACGGGCCATCT；rs12979860 位點(diǎn)上游引物序列（5’→3’）：CTTAT CGCATACGGCTAGGCGTTTC，下游引物序列（5’→3’）：GGACCGCTACGTAAGTCACC。反應(yīng)條件：95℃ 預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，64℃退火1 min，72℃延伸30 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。PCR 產(chǎn)物置于4℃保存。采用DNA 純化回收試劑盒純化回收后送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行基因測(cè)序。

1.3.4 HBV-DNA 病毒載量檢測(cè):采用cobas HBV定量核酸檢測(cè)試劑盒檢測(cè)獻(xiàn)血者血液HBV-DNA 載量，具體操作參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 25.0 版軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2或Fisher 確切概率法檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)。采用Pearsonχ2檢驗(yàn)IL-28b 基因rs8099917 位點(diǎn)、rs12979860位點(diǎn)哈代-溫伯格（Hardy-Weinberg）平衡。采用Logistic 回歸分析影響OBI 發(fā)生的因素。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR 擴(kuò)增結(jié)果分析 見圖1。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，產(chǎn)物條帶單一，產(chǎn)量高且無明顯引物二聚體。

圖1 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 OBI 與非OBI 獻(xiàn)血者IL-28b 基因多態(tài)性Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn) 1 158 例單采獻(xiàn)血者中anti-HBs 或（和）anti-HBc 陽性者301 例（25.99%），其 中18～30 歲133 例（11.48%），31～49 歲100例（8.64%），50～55 歲68 例（5.87%）。進(jìn)一步進(jìn)行HBV-DNA 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)301 例獻(xiàn)血者中HBVDNA 陽性即OBI 者46 例（15.28%），非OBI 者255 例（84.72%）。OBI 與非OBI 獻(xiàn)血者IL-28b基因rs8099917 位點(diǎn)、rs12979860 位點(diǎn)基因型分布均符合哈代-溫伯格（Hardy-Weinberg）平衡定律（χ2=4.589，0.812 和3.535，4.889，P=0.101，0.666和0.171，0.087），具有群體代表性。

2.3 OBI 與非OBI 獻(xiàn)血者IL-28b 基因rs8099917位點(diǎn)、rs12979860 位點(diǎn)多態(tài)性 見表1。與非OBI比較，OBI 獻(xiàn)血者IL-28b 基因rs8099917 位點(diǎn)G 等位基因頻率、TG+GG 基因型頻率顯著降低，T 等位基因頻率、TT 基因型頻率顯著增加（P＜0.01）；rs12979860 位點(diǎn)T 等位基因頻率、CT+TT 基因型頻率顯著降低，C 等位基因頻率、CC 基因型頻率顯著增加，以上比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 IL-28b 基因rs8099917 位點(diǎn)、rs12979860 位點(diǎn)等位基因、基因型分布[%（n）]

2.4 OBI 獻(xiàn)血者IL-28b 基因rs8099917 位點(diǎn)、rs12979860 位點(diǎn)多態(tài)性與HBV-DNA 載量的關(guān)系 見表2。OBI 獻(xiàn)血者IL-28b 基因rs8099917 位點(diǎn)、rs12979860 位點(diǎn)多態(tài)性與HBV-DNA 載量有關(guān)（P＜0.01），其中rs8099917 位點(diǎn)，與TT 基因型比較，TG+GG 基因型患者HBV-DNA 載量顯著降低（P＜0.01）；rs12979860 位點(diǎn)，與CC 基因型比較，CT+TT 基因患者HBV-DNA 載量顯著降低，以上比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表2 OBI 獻(xiàn)血者IL-28b 基因rs8099917 位點(diǎn)、rs12979860 位點(diǎn)多態(tài)性與HBV-DNA 載量關(guān)系（±s）

表2 OBI 獻(xiàn)血者IL-28b 基因rs8099917 位點(diǎn)、rs12979860 位點(diǎn)多態(tài)性與HBV-DNA 載量關(guān)系（±s）

基因型nHBV-DNA（IU/ml）tP rs8099917 TT3713.76±1.42 5.2570.000 TG+GG911.03±1.29 rs12979860 CC3528.94±2.41 17.3980.000 CT+TT1115.37±1.63

2.5 IL-28b 基因rs8099917 位點(diǎn)、rs12979860 位點(diǎn)多態(tài)性與OBI 發(fā)生的關(guān)系 見表3。采用Logistic 回歸分析IL-28b 基因rs8099917 位點(diǎn)、rs12979860 位點(diǎn)多態(tài)性與OBI 發(fā)生的關(guān)系，結(jié)果顯示，rs8099917位點(diǎn)，與TT 基因型比較，TG+GG 基因型可顯著降低OBI 發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)（P＜0.05）；rs12979860 位點(diǎn)，與CC 基因型比較，CT+TT 基因型可顯著降低OBI發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)（P＜0.05）。

表3 IL-28b 基因rs8099917 位點(diǎn)、rs12979860 位點(diǎn)多態(tài)性與OBI 發(fā)生Logistic 回歸分析

3 討論

近年來盡管隨著核酸檢測(cè)（nucleic acid testing，NAT）技術(shù)的發(fā)展普及，HBsAg（-）/HBV-DNA（+）血樣檢出率顯著提高，可在一定程度上降低HBV輸血傳播風(fēng)險(xiǎn)，但NAT 檢測(cè)存在窗口期，對(duì)于感染HBV 40 天內(nèi)患者其檢出率極低[8-9]，另HBV S基因存在免疫逃逸突變等特點(diǎn)[10-11]，臨床應(yīng)用存在一定局限。有研究報(bào)道，高流行區(qū)70%～90%人口先前暴露于HBV 流行區(qū)供血者中，OBI 發(fā)生率可達(dá)7%～19%，而低流行區(qū)也有近0%～9%OBI患者[12-13]。本研究結(jié)果顯示，1 158 例單采獻(xiàn)血者中anti-HBs 或（和）anti-HBc 陽性者301 例，占25.99%，進(jìn)一步進(jìn)行HBV-DNA 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)301 例獻(xiàn)血者中HBV-DNA 陽性即OBI 者46 例，高達(dá)15.28%，非OBI 者255 例，占84.72%。本研究結(jié)果與上述有關(guān)研究結(jié)果存在一定的沖突，導(dǎo)致此種現(xiàn)象的原因可能是由于納入樣本量不同以及研究地區(qū)不同導(dǎo)致結(jié)果存在一定的差異，同時(shí)也提示我們對(duì)單采獻(xiàn)血者僅采用常規(guī)檢測(cè)方法可能存在OBI 漏診或誤診的風(fēng)險(xiǎn)，因此急需尋找靈敏度高的檢測(cè)手段加以輔助，另探究OBI 發(fā)生機(jī)制可能對(duì)減少OBI發(fā)生及增加其檢出率具有重要意義。

研究發(fā)現(xiàn)，宿主年齡、性別及基因多態(tài)性可能影響其抵抗HBV 感染的效果[14]，IL-28b 基因編碼的λ3 干擾素具有抗病毒及免疫調(diào)節(jié)等生物作用，IL-28b 基因變異，其中位于其啟動(dòng)子上游8 kb的rs8099917 位點(diǎn)及基因上游3 kb 的rs12979860位點(diǎn)與丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）、HBV 對(duì)感染后自發(fā)清除及對(duì)干擾素治療應(yīng)答效果密切相關(guān)[15-16]。LI 等[17]研究報(bào)道，IL-28b 基因變異與HBV 病毒載量和肝臟炎癥有關(guān)，IL-28b 基因rs12979860 位點(diǎn)、rs12980275 位點(diǎn)及rs8099917 變異可能通過降低病毒載量和肝臟炎癥來阻止HBV進(jìn)展。談國蕾等[18]研究報(bào)道，江蘇地區(qū)漢族人群IL-28b 基因多態(tài)性與HBV 感染后不同疾病表型相關(guān)，IL-28b 基因rs12979860 位點(diǎn)C 等位基因和rs8099917 位點(diǎn)T 等位基因可能是促進(jìn)HBV 感染后病情進(jìn)展的影響因素?；诖?，本研究推測(cè)IL-28b基因rs12979860 位點(diǎn)及rs8099917 位點(diǎn)多態(tài)性可能與OBI 發(fā)生存在一定相關(guān)性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與非OBI 比較，OBI 獻(xiàn)血者IL-28b 基因rs8099917位點(diǎn)G 等位基因頻率、TT+GG 基因型頻率顯著降低，T 等位基因頻率、TT 基因型頻率顯著增加；rs12979860 位點(diǎn)T 等位基因頻率、CT+TT 基因型頻率顯著降低，C 等位基因頻率、CC 基因型頻率顯著增加，且均與OBI 獻(xiàn)血者HBV-DNA 載量有關(guān)，與談國蕾等[18]研究基本相符，提示本研究推測(cè)正確，IL-28b 基因rs12979860 位點(diǎn)及rs8099917 位點(diǎn)多態(tài)性與OBI 發(fā)生發(fā)展及HBV 感染有關(guān)。

為進(jìn)一步探究IL-28b 基因rs8099917 位點(diǎn)、rs12979860 位點(diǎn)多態(tài)性與OBI 發(fā)生的關(guān)系，本研究采用Logistic 回歸分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rs8099917 位點(diǎn)，與TT 基因型比較，TG+GG 基因型可顯著降低OBI發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)；rs12979860 位點(diǎn)，與CC 基因型比較，CT+TT 基因型可顯著降低OBI 發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，提示檢測(cè)IL-28b 基因rs8099917 位點(diǎn)、rs12979860 位點(diǎn)多態(tài)性可能對(duì)OBI 發(fā)生評(píng)估及對(duì)其檢出率增加有一定輔助作用，可能對(duì)臨床應(yīng)用有一定參考價(jià)值。

綜上所述，單采獻(xiàn)血者中OBI 可能與IL-28b基因rs8099917 位點(diǎn)、rs12979860 位點(diǎn)多態(tài)性有關(guān)，本研究可能對(duì)OBI 治療及檢出提供了一個(gè)有價(jià)值的基因工具。但關(guān)于IL-28b 基因rs8099917 位點(diǎn)、rs12979860 位點(diǎn)多態(tài)性與OBI 發(fā)生發(fā)展的關(guān)系可能會(huì)受到不同地區(qū)種族遺傳結(jié)構(gòu)及樣本量選擇的影響，具體機(jī)制也尚不明確，可能導(dǎo)致結(jié)果存在一定偏倚，提示后期應(yīng)擴(kuò)大樣本量，采取多中心全方面的研究，同時(shí)也提示在臨床輸血中應(yīng)嚴(yán)格掌握用血適應(yīng)癥，提倡對(duì)患者實(shí)施自體輸血，以減少感染發(fā)生。