劉 可，李愛(ài)學(xué)，李朋朋

(1.河北工程大學(xué) 園林與生態(tài)工程學(xué)院，河北 邯鄲 056038；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院 北京農(nóng)業(yè)智能裝備技術(shù)研究中心，北京 100097)

0 引 言

碳水化合物的測(cè)定和定量在很多領(lǐng)域具有重要意義，無(wú)酶電化學(xué)傳感器[1～3]因不依賴于酶、成本低、受環(huán)境因素影響小、穩(wěn)定性好、制備方法簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，而越來(lái)越受到研究人員的青睞。但現(xiàn)有傳感器的檢測(cè)上限較低，不能滿足實(shí)際樣品原位、現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需求，因此還需要進(jìn)一步研發(fā)新型的碳水化合物傳感器。

碳基納米結(jié)構(gòu)如石墨烯(GR)、碳納米管(MWCNT)、炭黑等，因其非凡的理化性能而受到了廣泛的關(guān)注。MWCNT的良好分散可以避免GR片的聚集[4,5]，GR納米片作為表面活性劑也可以直接分散MWCNT，從而形成比表面積大、電導(dǎo)率優(yōu)良的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[6～8]。此外，金(Au)催化劑因其優(yōu)異的光電特性和催化活性被廣泛應(yīng)用于傳感器研究中，如葡萄糖氧化、維生素含量的檢測(cè)等[9,10]。這種催化作用也可用于催化其他碳水化合物，如果糖、半乳糖、木糖和甘露糖，因?yàn)檫@些糖具有非常相似的結(jié)構(gòu)。叉指電極(interdigital electrodes,IDEs)是指狀或梳狀的面內(nèi)有周期性圖案的電極，其表層為指狀鍍金薄膜，具有靈敏度高、響應(yīng)速度快、小型一體化等優(yōu)點(diǎn)。

本文介紹了一種無(wú)酶檢測(cè)碳水化合物的方法，即以陶瓷基底的叉指電極作為基礎(chǔ)電極，利用GR-MWCNT復(fù)合材料構(gòu)建3D網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)來(lái)固定化AuNPs，形成復(fù)合材料，修飾叉指電極，催化氧化碳水化合物。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

羧基化石墨烯和羧基化碳納米管購(gòu)自先豐納米材料科技有限公司(中國(guó)，南京)。D-無(wú)水葡萄糖(glucose),D-果糖(fructose),D-半乳糖(galactose)，氫氧化鈉，亞鐵氰化鉀，氯化鉀，檸檬酸三鈉,檸檬酸(citric acid),無(wú)水蘋果酸(malic acid)，氯化鎂，無(wú)水乙醇購(gòu)自國(guó)藥控股化學(xué)試劑有限公司(中國(guó)，上海)。氯金酸，Nafion 溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)5 %)，D-木糖(xylose)，甘露糖(mannose)，D-亮氨酸(leucine)，DL-色氨酸(tryptophan)購(gòu)自西格瑪試劑有限公司(美國(guó)，密蘇里州圣路易斯)。L-賴氨酸(lysine)和磷酸鹽緩沖溶液(PBS 0.01 mol/L pH 7.4)購(gòu)自索萊寶科技有限公司(中國(guó)，北京)。其余試劑均為分析純，整個(gè)實(shí)驗(yàn)均使用超純水制備溶液。

1.2 儀 器

所有的電化學(xué)測(cè)量都是在 CHI760E 電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司，中國(guó))上進(jìn)行的。配備X 射線能譜分析(EDS)的場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(FESEM)系統(tǒng)(ZEISS，SEM 500，德國(guó))用于研究不同修飾步驟的叉指電極形貌。叉指電極購(gòu)自廣州鈺芯科技有限公司，線寬為100 μm，由工作電極和對(duì)電極組成，另加銀(Ag)/氯化銀(AgCl)電極作為參比電極，構(gòu)成三電極系統(tǒng)，所有電化學(xué)測(cè)量均在室溫條件(24 ℃)下進(jìn)行。

1.3 GR-MWCNT-Au復(fù)合材料的制備

首先制備0.5 mg/mL GR和1.5 mg/mL MWCNT的混合液。取20 mL GR-MWCNT混合液，在其中加入23.6 mmol/L HAuCl4溶液15 mL，磁力攪拌60 min。隨后在混合液中加入68 mmol/L的檸檬酸三鈉溶液20 mL，磁力攪拌30 min。后放入溫度為80 ℃ 水浴鍋中加熱30 min。將所得溶液以17 000 r/min的速度離心10 min。吸取上層清液后，放入溫度為60 ℃干燥箱中干燥12 h。收集干燥后的復(fù)合材料，以55 mg材料滴加2.5 mL乙醇和55 μL Nafion 溶液為比例進(jìn)行混合，即為制備好的修飾材料。另外通過(guò)制備各種比值的GR-MWCNT 混合液(0︰4,1︰3,2︰2,3︰1,4︰0)和各種濃度的氯金酸溶液(13.6,18.6,23.6,28.6,33.6 mmol/L)對(duì)修飾材料濃度進(jìn)行優(yōu)化。采用滴涂法對(duì)電極表面進(jìn)行修飾，滴加8 μL GR-MWCNT-Au溶液，在室溫(24 ℃)下修飾30 min。具體構(gòu)建過(guò)程如圖1所示，每一步驟完成后，用PBS緩沖液對(duì)電極進(jìn)行沖洗。

圖1 GR-MWCNT-Au和碳水化合物傳感器的制備示意

1.4 測(cè)量程序

用循環(huán)伏安法(cyclic voltammetry,CV)研究修飾后的電極對(duì)各種糖的催化作用，掃描范圍為-0.6～1.0 V，掃速為0.05 V/s。糖的濃度檢測(cè)采用計(jì)時(shí)電流法，工作電壓為0.3 V，掃描時(shí)間為300 s。所有電化學(xué)測(cè)試都是在0.1 mol/L NaOH溶液中進(jìn)行的。

2 結(jié)果與討論

2.1 傳感器的形貌和結(jié)構(gòu)表征

圖2是電鏡的表征結(jié)果。由圖2(a)看出，裸IDEs表面光滑，無(wú)任何雜質(zhì)。圖2(b)為修飾GR-MWCNT-Au后的IDEs電極，圖2(c)為圖2(b)的放大圖，從圖2(c)中可以明顯的看到片層狀褶皺的GR結(jié)構(gòu)，在GR納米片之間穿插著管狀的MWCNT，金納米粒子分布在GR-MWCNT的表面，尺寸約為30～50 nm。D-H圖顯示了修飾GR-MWCNT-Au后電極的EDS Mapping圖譜，得到了C,F,Au,N,O元素的信號(hào)。C元素的存在歸因于GR和MWCNT中的C元素。由于Nafion含有大量F元素，導(dǎo)致F元素的出現(xiàn)。N,O元素來(lái)源于石墨烯，復(fù)合材料中的Au和叉指電極表面金薄膜是Au元素出現(xiàn)的原因。Mapping圖譜也證明了各種材料已經(jīng)成功修飾在了電極表面。

圖2 裸IDEs(a)、GR-MWCNT-Au/IDEs(b)、GR-MWCNT-Au/IDEs高倍(c)的SEM圖譜，(d)-(h)為GR-MWCNT-Au/IDEs的Mapping圖譜

2.2 傳感器制備過(guò)程的電化學(xué)表征

首先用CV方法對(duì)傳感器的制備過(guò)程進(jìn)行了表征，CV掃描是在1 mmol/L [Fe(CN)6]4-溶液(含0.1 mol KCL)中進(jìn)行的。CV掃描的電流響應(yīng)情況如圖3(a)所示，與裸電極相比，當(dāng)GR-MWCNT-Au材料修飾到電極上后，氧化還原峰電流有所減小，但峰峰電位差也減小。這是因?yàn)镚R、MWCNT及Au粒子的高導(dǎo)電性和催化性能，提高了電子轉(zhuǎn)移速率、增強(qiáng)了可逆性。CV的表征結(jié)果證實(shí)了該傳感器的成功制備。電化學(xué)阻抗譜(EIS)在100.0 kHz～0.01 Hz范圍內(nèi)掃描的奈奎斯特曲線如圖3(b)所示，裸電極存在一個(gè)較小的半弧。當(dāng)修飾上GR-MWCNT-Au納米復(fù)合材料后，幾乎看不到半弧的存在。圖3(b)的內(nèi)插圖中給出了一個(gè)簡(jiǎn)單的等效電路模型。裸電極擬合的阻抗值Rct為38.1 kΩ，修飾復(fù)合材料之后的阻抗值減小到30.9 kΩ，這是由于GR,MWCNT及Au納米粒子提高了電極的導(dǎo)電性，加速了電子的傳遞。EIS的結(jié)果和CV一致，再次證明了傳感器的制備是成功有效的。

圖3 裸IDEs和GR-MWCNT-Au/IDEs在1mmol/L[Fe(CH)6]4-溶液中的循環(huán)伏安曲線

2.3 GR-MWCNT-Au納米材料的電化學(xué)性能

為了檢驗(yàn)GR-MWCNT-Au納米材料的電化學(xué)性能，考察了裸IDEs、GR/IDEs、MWCNT/IDEs和GR-MWCNT-Au/IDEs在-0.6～1.0 V范圍內(nèi)的電化學(xué)行為。圖4(a)的內(nèi)插圖為裸電極的在空白溶液(a)及20 mmol/L果糖溶液中(b)的循環(huán)伏安曲線，裸電極在空白溶液中顯示了典型的金的氧化還原行為，在果糖溶液中，可以在0.28 V和0.53 V處觀察到兩個(gè)氧化峰，GR/IDEs(c)和MWCNT/IDEs(d)的導(dǎo)電性增強(qiáng)，背景電流增大，但果糖的氧化峰沒(méi)有明顯增大。

圖4(a)內(nèi)插圖為裸IDEs在0 mmol/L(a)和20 mmol/L(b)果糖溶液的循環(huán)伏安曲線，裸IDEs(b)、GR/IDEs(c)、MWCNT/IDEs(d)和GR-MWCNT-Au/IDEs(e)在20 mmol/L果糖溶液中的循環(huán)伏安曲線，圖4(b)GR-MWCNT-Au/IDEs在0 mmol/L(a)和20 mmol/L(b)果糖溶液中的循環(huán)伏安曲線，圖4(c)GR-MWCNT-Au/IDEs在和20 mmol/L葡萄糖(a)、甘露糖(b)、半乳糖(c)和木糖(d)中的循環(huán)伏安曲線GR-MWCNT-Au/IDEs(e)獲得了最高的電流響應(yīng)，氧化峰也更加明顯，這表明GR、MWCNT和AuNPs作為果糖發(fā)生反應(yīng)的催化劑，結(jié)合后的協(xié)同效應(yīng)能夠能夠使它們的催化效果進(jìn)一步放大。所以后續(xù)的實(shí)驗(yàn)選擇使用 GR-MWCNT-Au材料來(lái)進(jìn)行。圖4(b)中曲線(a)為在不添加果糖的情況下，GR-MWCNT-Au/IDEs沒(méi)有氧化還原峰出現(xiàn)。在加入20 mmol/L的果糖(b)后，在0.3 V左右的電位處觀察到一個(gè)明顯的氧化峰，所以，將氧化峰對(duì)應(yīng)的電壓0.3 V作為后續(xù)i-t法的工作電壓。這種催化作用也發(fā)生在其他碳水化合物，如圖4(c)所示，在20 mmol/L的葡萄糖(a)、甘露糖(b)、半乳糖(c)和木糖(d)中，它們的氧化還原反應(yīng)類似于果糖，這主要是由于這些碳水化合物和果糖的結(jié)構(gòu)相似，因此GR-MWCNT-Au對(duì)它們有產(chǎn)生類似的催化作用[16]。GR-MWCNT-Au修飾電極可以催化氧化這幾種碳水化合物形成對(duì)應(yīng)的酯，酯水解后生成酸。

圖4 電化學(xué)性能曲線

2.4 傳感器制備條件的優(yōu)化

首先考察了GR和MWCNT的含量對(duì)響應(yīng)電流I的影響。在本研究中，固定碳納米材料的總量為2 mg/mL，考察了不同配比GR-MWCNT復(fù)合材料(4︰0,3︰1,2︰2,1︰3,0︰4)對(duì)于響應(yīng)電流的影響。利用20 mmol/L的果糖檢測(cè)其i-t響應(yīng)，結(jié)果如圖5(a)所示，GR-MWCNT復(fù)合材料的響應(yīng)電流要比單一的GR或MWCNT大。而在GR-MWCNT復(fù)合材料的各個(gè)配比中，當(dāng)GR︰MWCNT為1︰3時(shí)獲得了最大的電流響應(yīng)，表明此時(shí)GR與MWCNT具有最佳的協(xié)同作用。所以,在本研究中GR和MWCNT的最佳含量分別為0.5 mg/mL和1.5 mg/mL。

金納米粒子是修飾物重要組成部分之一，所以優(yōu)化氯金酸的濃度(13.6,18.6,23.6,28.6,33.6 mmol/L)也是十分有必要的。優(yōu)化結(jié)果如圖5(b)所示，可以看出HAuCl4含量從13.6～23.6 mmol/L時(shí)，電流逐漸增大。HAuCl4含量為23.6 mmol/L時(shí)獲得了最大的電流響應(yīng)。而當(dāng)HAuCl4含量繼續(xù)提高時(shí)，響應(yīng)電流不再增大，所以,HAuCl4含量選擇23.6 mmol/L進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

滴加的復(fù)合材料的總量也影響修飾后電極的性能，這就需要對(duì)復(fù)合材料的總量(40,45,50,55,60 mg)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果如圖5(c)所示，材料的總量為55 mg時(shí)，響應(yīng)電流尤為顯著。因此確定復(fù)合材料的總量為55 mg。

最后考察不同電壓(0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 V)對(duì)響應(yīng)電流I的影響。如圖5(d)所示，當(dāng)電壓從0.1 V增加到0.3 V時(shí)，響應(yīng)電流逐漸增大。而電壓從0.3 V開(kāi)始繼續(xù)增大時(shí)，電流出現(xiàn)了下降。所以0.3 V是碳水化合物發(fā)生反應(yīng)的最佳電壓。

圖5 GR-MWCNT含量比例、HAuCl4濃度、復(fù)合材料滴加的質(zhì)量選用的工作電壓對(duì)電流響應(yīng)的影響

2.5 無(wú)酶碳水化合物傳感器的性能測(cè)試

在最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件下，采用制備的無(wú)酶碳水化合物傳感器測(cè)定一系列濃度的糖溶液。果糖在5～120 mmol/L的范圍內(nèi)果糖濃度和響應(yīng)電流成線性關(guān)系。如圖6,果糖的線性方程為I(mA)=4.446 23+0.112 23C(mmol/L)，相關(guān)系數(shù)R2=0.975，檢測(cè)限為0.24 mmol/L(S/N=3)。葡萄糖在10～100 mmol/L的范圍內(nèi)果糖濃度和響應(yīng)電流成線性關(guān)系。葡萄糖的線性方程為I(mA)=3.676 39+0.256 51C(mmol/L)，相關(guān)系數(shù)R2=0.975，檢測(cè)限為3.12 mmol/L(S/N=3)。對(duì)于半乳糖、甘露糖和木糖，傳感器也表現(xiàn)了類似的電流響應(yīng)。傳感器對(duì)這幾種碳水化合物的檢測(cè)性能如表1所示。與文獻(xiàn)中報(bào)道的其他類型的無(wú)酶?jìng)鞲衅飨啾龋怨莻鞲衅鳛槔?表2)，本文的傳感器檢測(cè)范圍更適合對(duì)農(nóng)產(chǎn)品及食品進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)原位檢測(cè)，具有較強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

圖6 GR-MWCNT-Au/IDEs 傳感器對(duì)不同濃度果糖和葡萄糖進(jìn)行檢測(cè)的計(jì)時(shí)電流曲線和校準(zhǔn)曲線

表1 碳水化合物傳感器不同糖的特征

表2 不同無(wú)酶果糖傳感器的性能比較

為了檢驗(yàn)傳感器對(duì)碳水化合物的選擇性能，使用制備的傳感器分別對(duì)20 mmol/L的果糖、蘋果酸、檸檬酸、色氨酸、亮氨酸、賴氨酸和氯化鎂進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖7所示。傳感器對(duì)果糖的電流響應(yīng)顯著高于其他干擾物質(zhì)，不受蘋果酸、檸檬酸、色氨酸、亮氨酸、賴氨酸、Mg2+和Cl-的干擾，證明了傳感器具有良好的選擇性。

圖7 GR-MWCNT-Au/IDEs傳感器選擇性能測(cè)試

在同等實(shí)驗(yàn)條件下，采用同一根修飾后的叉指電極，連續(xù)測(cè)定6次同一濃度的果糖溶液(20 mmol/L)，并記錄其果糖溶液的電流響應(yīng)值，結(jié)果如圖8(a)，可見(jiàn)其電流響應(yīng)值較為一致(RSD為4.25 %)。在同等實(shí)驗(yàn)條件下，用6根修飾后電極對(duì)同一濃度的果糖(20 mmol/L)進(jìn)行10次測(cè)量(圖8(b))，響應(yīng)電流的RSD為4.43 %。這些都顯示出傳感器具有優(yōu)異的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

圖8 同一電極連續(xù)測(cè)6次同一濃度果糖和6根電極測(cè)同一濃度果糖的計(jì)時(shí)電流曲線(同一濃度果糖為20 mmol/L)

2.6 實(shí)際樣品測(cè)試

采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，通過(guò)檢測(cè)橙汁中的碳水化合物，相關(guān)結(jié)果如表3所示，得到橙汁樣品的加標(biāo)回收率在99.45 %～104.39 %之間，且同一濃度的響應(yīng)電流值較為一致(n=3)。這表明傳感器的檢測(cè)結(jié)果是準(zhǔn)確可靠的，可用于實(shí)際樣品中碳水化合物的測(cè)定。

表3 橙汁加標(biāo)回收率結(jié)果(n=3)

3 結(jié) 論

本文研究采用叉指電極，利用石墨烯、碳納米管和金納米粒子的協(xié)同作用催化碳水化合物的氧化反應(yīng)，制備了幾種碳水化合物的無(wú)酶?jìng)鞲衅?。傳感器的檢測(cè)范圍更適合對(duì)農(nóng)產(chǎn)品及食品進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)原位檢測(cè)應(yīng)用，并且具有良好的重現(xiàn)性及穩(wěn)定性。使用其對(duì)橙汁中的碳水化合物含量進(jìn)行了檢測(cè)，獲得了較好的回收率，表明該傳感器具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。這項(xiàng)工作證明了同時(shí)檢測(cè)多種碳水化合物是可行的。