王慶齡，裘鈞陶，詹越城，葉磊海，仰海清，何 斌，盛麗娜

（1.浙江公正檢驗中心有限公司，浙江杭州310009；2.贊宇科技集團股份有限公司，浙江杭州310009）

隨著經(jīng)濟的快速發(fā)展和生活水平的提高，人們對護膚也越來越重視?；瘖y品能夠有效改善人們的生活質(zhì)量，而人們也越來越認(rèn)識和關(guān)注化妝品的功效和安全性問題。消費者希望化妝品在有足夠功效性的同時也能兼顧產(chǎn)品的安全性。化妝品公司為了迎合消費者對功效的追求，會人為添加禁用或者限用成分，尤其是有功效成分的藥物，比如在祛斑美白的化妝品中添加汞試劑制品、在抗衰老化妝品中添加禁用的激素類藥品、在染發(fā)劑中加入化學(xué)試劑醋酸鉛等[1-3]。

抗感染藥物屬于處方藥，因具有殺菌抑菌的功效，因此會被違法添加到化妝品中，人體在使用時如果涂抹于面部、口唇等比較柔嫩且膜血管豐富的部位，會通過微血管和黏膜被人體快速吸收，從而破壞皮膚表面的正常菌群，最終導(dǎo)致皮膚發(fā)生皮疹發(fā)炎、過敏等不良反應(yīng)。長期使用后更加會導(dǎo)致耐藥性，后續(xù)治療更加困難?？垢腥绢愃幬镆话惆股亍⒒前奉?、喹諾酮類和四環(huán)素類等，但現(xiàn)行的相關(guān)檢測標(biāo)準(zhǔn)僅能檢測其中的幾項，不能同時進行分析。目前，化妝品中抗感染類藥物檢測方法主要有氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等。由于抗感染類藥物種類繁多，而文獻報道中的檢測方法多為檢查某一類抗感染藥物，錢葉飛等人[4]運用HPLC-DAD法測定化妝品中非法添加的21種磺胺類抗生素；陳靜等人[5]通過超高效液相色譜法同時測定化妝品中的19種喹諾酮類抗生素；趙曉亞等人[6]運用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對化妝品中9種四環(huán)素類藥物同時測定。對非法添加抗感染類藥物的檢測難點在于非法添加的藥物種類具有不確定性，需要盡可能全面覆蓋種類進行篩查，如何有效去除雜質(zhì)而提高目標(biāo)物的效應(yīng)也成為研究的重點。對樣品前處理效果影響最大的就是凈化手段，化妝品含有大量的脂類和表面活性劑等雜質(zhì)，因此如何有效去除雜質(zhì)而不影響目標(biāo)物的定性定量是評價所建立方法的重要因素。固相萃取技術(shù)是最常用的手段，一般包括極性萃取、離子交換萃取、共價萃取、高級聚合物萃取和專用固定相萃取等[7-8]。因此，旨在建立分散固相萃取法結(jié)合超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定多種化妝品基質(zhì)中可能添加的多種類型的抗感染藥物。

1 試驗部分

1.1 儀器與耗材

Agilent 1260 Series型超高效液相色譜儀（USA）；Agilent 6470型三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（USA）；N-EVAPA 111型氮吹儀，美國Organomation associates公司產(chǎn)品；TGL-16G型高速離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；Milli-Q型純水儀，美國Millpore公司產(chǎn)品；GX-274ASPEC型多通道固相萃取系統(tǒng)，美國Gilson公司產(chǎn)品。

甲醇、丙酮、乙腈、正己烷、乙酸乙酯、甲苯（色譜純），美國Tedia公司提供；甲酸（優(yōu)級純），上海安譜科科學(xué)儀器有限公司提供；氯化鈉、無水硫酸鎂（分析純）、十八彎基鍵合硅膠吸附劑（C18）、弗洛里硅藻土、N-丙基乙二胺吸附劑（PSA），杭州化學(xué)試劑有限公司提供；甲硝唑、磺胺吡啶、磺胺甲嘧啶、磺胺甲二唑、磺胺甲氧嗪、磺胺氯噠嗪、磺胺甲噁唑、依諾沙星等36種抗感染類物質(zhì)（含量≥95%）（具體物質(zhì)見表2，表4），Dr.Ehrenstorfer公司提供。除非另有要求，所有試劑均為分析純，所用水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：分別精確稱取除氯霉素外其他待測組分標(biāo)準(zhǔn)品各10.00 mg（精確至0.01 mg）置于100 mL棕色容量瓶中，氯霉素稱取10 mg（精確至0.01 mg）置于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解（溶解性差的物質(zhì)可加入少量甲酸或水促溶）后，定容至刻度，混勻，即得質(zhì)量濃度為100.0 μg/mL（氯霉素質(zhì)量濃度為1 000.0 μg/mL）的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，置于-20℃冰箱中保存。

1.2 試驗條件

1.2.1 樣品提取

準(zhǔn)確稱取化妝品樣品0.2 g（精確到0.000 1 g）于15 mL的塑料離心管中，加入150 mg凈化粉末（含有NaCl，C18和MgSO4）和含0.5%甲酸的乙腈溶液10.00 mL，渦旋30 s，渦旋混合搖勻，超聲提取30 min后，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心5 min，取上清液置于新離心管中，重復(fù)提取1次，合并上清液。

1.2.2 樣品濃縮凈化

取上述離心后上清液，40℃水浴下氮吹至干，再加入2.00 mL的50%甲醇水復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm的有機微孔濾膜過濾后上機待測分析。

1.2.3 超高效液相色譜-質(zhì)譜、質(zhì)譜條件

（1）色譜條件。色譜柱：Agilent SB-C18型柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm，USA），柱溫35℃，進樣體積2 μL，流速0.3 mL/min；流動相A：0.1%甲酸水，流動相B：乙腈。

梯度洗脫程序見表1。

（2）質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧離子源（ESI），掃描方式：正/負離子，檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）方式采集，檢測器：Agilent 6470型三重四極桿質(zhì)譜儀配有ESI離子源。

36種抗感染類藥物殘留的質(zhì)譜檢測參數(shù)見表2。

表2 36種抗感染類藥物殘留的質(zhì)譜檢測參數(shù)

續(xù)表2

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的優(yōu)化

為了提高化妝品中目標(biāo)物的提取率，根據(jù)抗感染類藥物的分子性質(zhì)，并總結(jié)文獻資料中使用過的提取劑，分別以乙腈、0.5%酸化乙腈、乙酸乙酯和甲醇作為樣品提取溶劑。

不同提取液測定結(jié)果見表3。

表3 不同提取液測定結(jié)果/mg·kg-1

由表3可知，當(dāng)用乙腈提取目標(biāo)物時，其極性較大并且分子較小，因此提取能力較強，能夠?qū)⑷鯓O性物質(zhì)也提取出來，試驗研究的抗感染類藥物物質(zhì)也能大部分被提取出來，所以可采用。0.5%酸化乙腈提取能力比乙腈較強，酸化過的乙腈能夠更加親和個別弱酸性的物質(zhì)，研究涉及的抗感染類藥物一般為酸性或弱酸性，提取率比乙腈更高。而乙酸乙酯非極性較大，可以溶解大多數(shù)抗感染類藥物，同時能提取化妝品中的大部分油脂類，雜質(zhì)成分太多影響準(zhǔn)確定量。甲醇提取效果跟乙腈相比，因為其能夠與水相溶，對一些水溶性的雜質(zhì)和表面活性劑也會被提取。綜合考慮到對目標(biāo)物的溶解性和較高提取效率，選用酸化的乙腈溶液作為提取液。

2.2 分散固相萃取技術(shù)（dSPE）凈化

由于化妝品種類繁多，大部分含有大量化工原料或者天然有機物質(zhì)，成分復(fù)雜，因此如何有效去除這些雜質(zhì)而不影響目標(biāo)物的定性定量是研究的主要目的。在化妝品中多種藥物篩查前處理中常用凈化手段主要有固相萃?。⊿PE）和分散固相萃?。╠-SPE）。王夢穎等人[9]使用Oasis PriME HLB固相萃取柱測定乳液類化妝品中的9種抗過敏違禁藥物殘留時，部分目標(biāo)物回收率不超過70%，方法適應(yīng)性不佳。王燕芹等人[10]使用Plexa PCX固相萃取柱結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定化妝品中9種抗過敏藥物殘留，其樣品比較單一，所測藥物種類單一，使其很難成為一個通用的多種藥物檢測方法。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和進步，對檢測通量的要求越來越大，d-SPE作為簡單便捷的凈化方式被廣泛應(yīng)用于各種檢測研究中[11-14]，傳統(tǒng)的d-SPE吸附材料有N-丙基乙二胺（PSA）、石墨化碳（GCB）、多壁碳納米管（MWCNTS）和十八烷基鍵合硅膠（C18）等，C18和PSA能有效去除基質(zhì)中的有機酸、糖類和脂肪，GCB和MWCNTS能吸附大部分色素。鑒于化妝品中雜質(zhì)類型，考查幾種特異性小柱，包括NH2柱、C18柱、非多孔性炭黑小柱、硅膠柱、佛羅里硅藻土小柱、PSA粉末和分散固相萃取粉末，優(yōu)化最佳凈化方案。

2.2.1 凈化方式的選擇

根據(jù)固相萃取柱所含有不同填料性質(zhì)及參考部分文獻，分別比較目前常用的不同填料的Sep-Park-C18，Sep-Park-Silica，Sep-Park-Florsi，Envi-Carb/GCNH2固相萃取柱，AOAC級別的PSA粉末和自制的凈化粉末，通過試驗，對空白樣品加標(biāo)（5.00 μg/kg）進行凈化。

不同凈化方式對回收率的影響見圖1。

圖1 不同凈化方式對回收率的影響

由圖1可知，自制分散固相萃取凈化粉末的回收率最高。由于SPE小柱填料的選擇性，同時能夠檢測的藥物種類太少，而繁瑣的操作步驟使得SPE小柱法前處理耗時較長，柱子篩板容易堵，很難作為一個通用的高通量多殘留篩查檢測的樣品前處理方法。分散固相萃取經(jīng)常作為最簡單便捷的凈化方式被廣泛應(yīng)用于各類目標(biāo)物的檢測中，傳統(tǒng)的d-SPE能夠去除各種基質(zhì)中的有機酸、糖類、脂類、固醇和色素等雜質(zhì)?？赡?6種抗感染類藥物種類比較復(fù)雜，其他5種柱子只能對某一種或者幾種物質(zhì)有保留，容易造成其余目標(biāo)物的損失甚至直接丟失，而自制粉末凈化屬于一種固液分配凈化，只是吸附部分雜質(zhì)，如脂質(zhì)，對目標(biāo)物的吸附能力不強，反而能保留大部分物質(zhì)，因此回收率比較高。

2.2.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜中普遍存在基質(zhì)效應(yīng)，化妝品樣品基質(zhì)復(fù)雜，含有脂類和表面活性劑，因此基質(zhì)效應(yīng)也很嚴(yán)重。在最終優(yōu)化后的試驗條件下，空白樣品經(jīng)過處理吹干后，加入一定量標(biāo)準(zhǔn)溶液，制成基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。與相應(yīng)質(zhì)量濃度的純標(biāo)準(zhǔn)溶液比較后發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)效應(yīng)明顯，因此準(zhǔn)備定量時采用基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.3 線性關(guān)系和檢出限的考查

在所確定的試驗條件、色譜和質(zhì)譜條件下，對36種抗感染類藥物進行測定，用空白基質(zhì)配置一系列質(zhì)量濃度范圍為4.00~100.00 ng/mL，以目標(biāo)物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），對應(yīng)的響應(yīng)值為縱坐標(biāo)（Y），進行線性回歸。

36種抗感染藥物的線性方程與線性范圍與檢出限見表4。

表4 36種抗感染藥物的線性方程與線性范圍與檢出限

2.3 方法回收率和精密度驗證

續(xù)表4

按液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法操作，實驗室對陰性樣品分別進行3次平行加標(biāo)回收試驗。

36種抗感染藥物的加標(biāo)回收見表5。

由表5可知，樣品平均回收率為70.0%~120.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均在10%以內(nèi)，說明該方法具有較高的精密度和準(zhǔn)確度。

3 結(jié)論

采用超高效液相色譜-四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用方法建立了化妝品中36種抗感染類藥物殘留含量的檢測方法，36種藥物均在除氯霉素外（氯霉素線性范圍10.00~1 000.00 ng/mL，檢出限為0.50 μg/g，加標(biāo)量在1.00~10.00 μg/g內(nèi)的乳液樣品回收率均在85%~110%）線性范圍4.00~100.00 ng/mL內(nèi)檢出限為0.20 μg/g，加標(biāo)量在0.50~2.50 μg/g內(nèi)的乳液樣品回收率均在85%~110%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%。因此，該方法能高效快速地用于化妝品中36種抗感染類藥物殘留含量的測定。