劉 穎，袁 翔，黃惠庭，王文婷，唐苗苗，邢蕾，李海明

（宿州學院生物與食品工程學院，安徽宿州234000）

0 引言

綠豆在我國廣泛種植，其營養(yǎng)成分豐富，籽粒中淀粉含量可達50%，蛋白質含量為19.7%~32.1%[1]。淀粉是一種儲存多糖，其在植物生長時期以淀粉粒形式儲存于細胞中，在種子、塊莖和塊根等器官中含量十分充足。植物淀粉在食品生產中發(fā)揮著很大作用，其對動物體也有極其重要的生理功能，如供應能量、形成機體組織、節(jié)約蛋白等。綠豆淀粉所提供的能量值很低，這在消費者追求健康均衡生活的新時代顯得尤為重要。另外，綠豆淀粉也具備改善腸道菌群環(huán)境、減少大量有害物質吸收的功能。綠豆淀粉被普遍應用于食品加工中，也與其獨特的透明度、溶解度、膨潤力和凍融穩(wěn)定性等性質有關，這些特性對食品成品的最終質量有極其重要的影響。

如今，國內外學者雖然對綠豆淀粉提取和性質廣泛關注，但對其研究通常報道得不夠具體。我國的淀粉工業(yè)發(fā)展存在淀粉產率偏低、品種單一等問題[2]。綠豆中淀粉含量一般在50%以上，但其提取效率有限，不利于充分利用綠豆的優(yōu)良品質，一定程度上對綠豆原料造成很大浪費。試驗利用水磨法提取綠豆淀粉后采用酶法除去蛋白以純化淀粉，通過單因素試驗及正交試驗獲得最佳純化工藝，既能保證綠豆淀粉提取率及純度，又能使生產能耗降低、純化時間縮短，研究純化后綠豆淀粉的理化性質，以期為提高其綜合利用價值提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要原料與試劑

1.1.1 主要原料

綠豆，市售。

1.1.2 主要試劑

氫氧化鈉、氯化鈉、無水乙醇，西隴化工股份有限公司提供；鹽酸、乙醚，上海蘇懿化學試劑有限公司提供；牛血清白蛋白，國藥集團化學試劑有限公司提供；堿性蛋白酶，北京索萊寶科技有限公司提供。

1.2 主要儀器

全自動豆?jié){機，九陽股份有限公司產品；SHZD（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限公司產品；電子天平，上海越平科學儀器有限公司產品；H1805型臺式高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司產品；UV-5100H型紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司產品；SU1510型掃描電子顯微鏡，株式會社日立高新技術那柯事業(yè)所產品；PHS-3C型pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司產品。

1.3 綠豆淀粉純化工藝

1.3.1 水磨法提取綠豆淀粉工藝

參照Liu W，王立東等人[3-4]對綠豆淀粉的提取方法，并加以改動：按料液比1∶4（g∶mL）將50 g綠豆浸泡于水中，于40℃下浸泡時間14 h，加900 mL蒸餾水進行第1次磨漿，豆?jié){用紗布過濾后收集殘渣進行第2次磨漿，再次過濾、離心，取底部淀粉用蒸餾水洗滌，得淀粉半成品。用無水乙醇對所得淀粉半成品進行3次抽濾洗滌，再用無水乙醇和乙醚按1∶1比例混合抽濾1次，最后用乙醚抽濾1次，將除脂肪后的淀粉半成品置于45℃下烘干過夜。粉碎即為綠豆粗淀粉。

1.3.2 淀粉中蛋白質含量測定

（1）標準曲線的繪制。

添加試劑見表1。

表1 添加試劑

采用紫外分光光度法測定綠豆淀粉中蛋白質的含量。按表1依次加入質量濃度為1.00 mg/mL牛血清白蛋白質標準溶液和0.9%氯化鈉溶液，于波長280 nm處分別測出吸光度，繪制標準曲線[5]。

（2）待測樣品的測定。取待測淀粉溶解于0.9%氯化鈉溶液中，定容至100 mL，按上述方法測定在波長280 nm處的吸光度，對照標準曲線求出淀粉中蛋白含量。

1.3.3 酶法除蛋白純化綠豆淀粉工藝

（1）工藝流程。提取的粗淀粉采用堿性蛋白酶進行除蛋白質純化操作，參考陳振家，胡愛軍等人[6-7]對豆類淀粉酶法提取純化工藝的研究方法并稍加改動。分別稱取同一條件下制得的粗淀粉2.5 g于4支試管中，以1∶8（g∶mL）的料液比加入蒸餾水，并將其pH值調至所需的堿性環(huán)境，加入一定量的堿性蛋白酶，在一定溫度的水浴鍋中酶解一定時間后，以轉速3 400 r/min離心10 min，除上清液，取下層沉淀，用蒸餾水洗滌、離心，取沉淀，反復3次，置于45℃電熱鼓風干燥箱中烘干過夜，得到純化綠豆淀粉。

（2）單因素試驗。設計單因素試驗，研究當酶解溫度55℃，酶用量600 U/g，酶解液pH值9時，不同酶解時間（2，3，4，5，6 h）對綠豆淀粉中蛋白質殘余量的影響；當酶解時間4 h，酶用量600 U/g，酶解液pH值9時，不同酶解溫度（35，45，55，65，75℃）對綠豆淀粉中蛋白殘余量的影響；當酶解時間4 h，酶解溫度55℃，酶解液pH值9時，不同酶用量（400，500，600，700，800 U/g）對綠豆淀粉中蛋白質殘余量的影響；當酶解時間4 h，酶解溫度55℃，酶用量600 U/g時，不同酶解液pH值（7，8，9，10，11）對綠豆淀粉中蛋白質殘余量的影響[7]。

（3）正交試驗。按表2設計四因素三水平L9（34）的正交試驗，確定純化工藝最佳參數。

酶法除蛋白質純化淀粉正交試驗因素與水平設計見表2。

表2 酶法除蛋白質純化淀粉正交試驗因素與水平設計

1.3.4 綠豆淀粉理化性質的研究

（1）淀粉顆粒形貌觀察。掃描電子顯微鏡觀察淀粉顆粒形貌，參照裴亞瓊等人[8]的方法進行測定。

（2）淀粉糊透明度測定。參考侯蕾等人[9]的方法并加以改動進行測定。

（3）淀粉糊溶解度和膨潤力測定。參考郭神旺等人[10]對主要雜豆淀粉理化性質的分析方法并加以改動進行測定。

（4）淀粉糊凍融穩(wěn)定性測定。參考王鵬等人[11]對豆類淀粉的研究方法進行測定。

2 結果與分析

2.1 酶法除蛋白純化綠豆淀粉試驗結果

2.1.1 單因素試驗結果

（1）酶解時間對淀粉中蛋白殘余量的影響。

不同酶解時間對淀粉中蛋白殘余量的影響見圖1。

圖1 不同酶解時間對淀粉中蛋白質殘余量的影響

由圖1可知，隨著酶解時間的增加，蛋白殘余量逐漸遞減，酶解時間超過4 h后，蛋白殘余量變化不大，基本趨于穩(wěn)定。這可能是因為開始時溶液中酶的濃度較高，所以在2~4 h綠豆淀粉中的蛋白質殘余量不斷減少，隨著反應的進行，溶液中酶濃度逐漸變小，酶的活性也逐漸降低，導致淀粉與蛋白質分離速度減慢甚至不再分離，且淀粉中蛋白近乎除盡，因此蛋白質殘余量基本不變[12]。因此，選擇4 h為最適酶解時間。

（2）酶解溫度對淀粉中蛋白質殘余量的影響。

不同酶解溫度對淀粉中蛋白質殘余量的影響見圖2。

圖2 不同酶解溫度對淀粉中蛋白質殘余量的影響

由圖2可知，當酶解溫度上升到55℃時，淀粉中蛋白質殘余量最少，為5.4 mg/g；當溫度超過55℃后，蛋白質殘余量呈上升趨勢，這可能是因為溫度過高會導致蛋白質的結構改變，從而降低其溶解度，不利于蛋白質的溶出而隨淀粉下沉[6]；并且高溫也會引起堿性蛋白酶變性失活，水解速度降低[13]。因此，選擇55℃為最適酶解溫度。

（3）酶用量對淀粉中蛋白質殘余量的影響。

不同酶用量對淀粉中蛋白質殘余量的影響見圖3。

由圖3可知，隨著酶用量的不斷增加，蛋白質殘余量不斷減少，但當酶用量達到600 U/g之后，蛋白質殘余量較小幅度上升。這可能是由于剛開始酶用量低于底物濃度，酶促反應速度隨著酶用量的增加而加快，當酶用量繼續(xù)增加直到過量時，使蛋白質過度水解從而暴露更多疏水性基團，形成不溶性聚集體，降低了蛋白質的溶解度，從而導致淀粉中蛋白質殘余量上升[6]。因此，選擇600 U/g為最合適的酶用量。

圖3 不同酶用量對淀粉中蛋白質殘余量的影響

（4）酶解液pH值對淀粉中蛋白質殘余量的影響。

不同酶解液pH值對淀粉中蛋白質殘余量的影響見圖4。

圖4 不同酶解液pH值對淀粉中蛋白質殘余量的影響

由圖4可知，當酶解液pH值逐漸增大時，淀粉蛋白質殘余量逐漸減少，這是因為隨著酶解液pH值的增大，堿性蛋白酶的活性也逐漸提高[6]。當酶解液pH值為9時，蛋白質殘余量最少，為5.3 mg/g；但當酶解液pH值繼續(xù)增大時，淀粉蛋白質殘余量逐漸增加，這是因為高pH值的堿性環(huán)境可能會導致部分淀粉糊化，增大溶液的黏度[14]，使蛋白質不易從淀粉中溶出，同時過高的pH值環(huán)境也會降低堿性蛋白酶的酶活。因此，選擇最適酶解液pH值為9。

2.1.2 正交優(yōu)化試驗結果

酶法除蛋白質純化綠豆淀粉正交試驗結果分析見表3。

表3 酶法除蛋白質純化綠豆淀粉正交試驗結果分析

由表3可知，綠豆淀粉蛋白質殘余量的極差R值在0.16~0.60，每個因素對蛋白質殘余量的影響作用順序為酶解時間>酶解溫度>酶用量>酶解液pH值，綠豆淀粉純化的最佳工藝條件組合為A3B3C1D1，即酶解時間4.5 h，酶解溫度60℃，酶用量550 U/g，酶解液pH值9。

2.1.3 綠豆淀粉純化的驗證性試驗

參照正交優(yōu)化試驗得到的最佳因素組合進行驗證，重復3次并取平均值得到綠豆淀粉蛋白質殘余量為3.9 mg/g。

2.2 綠豆淀粉理化性質研究結果

2.2.1 淀粉顆粒掃描電鏡觀察

分別對除蛋白質純化后的淀粉顆粒及未純化的淀粉顆粒進行電鏡掃描。

純化及未純化綠豆淀粉顆粒形態(tài)圖見圖5。

圖5 純化及未純化綠豆淀粉顆粒形態(tài)圖

由圖5可知，體積較小的綠豆淀粉顆粒一般為圓形，而體積稍大的綠豆淀粉顆粒為橢圓形。圖a、圖b為用堿性蛋白酶純化除蛋白質后的綠豆淀粉顆粒，表面雖有凹痕但較為光滑；圖c、圖d為未用堿性蛋白酶純化的淀粉顆粒，顆粒表面有少許附著物，不光滑，其可能是還未除去的淀粉殘余蛋白質。

2.2.2 淀粉糊透明度

綠豆淀粉糊透明度隨時間的變化見圖6。

圖6 綠豆淀粉糊透明度隨時間的變化

淀粉的透明度反映了淀粉與水的結合能力，一般用透光率來表示透明度的強度，淀粉中的直支比是影響淀粉糊透明度的重要因素[15]。由圖6可知，綠豆淀粉糊的透光率隨著放置時間的增加而逐步下降，即透明度逐漸降低。在粉絲生產中，透明度與其口感、外觀的光澤度有直接關系。

2.2.3 淀粉糊溶解度和膨潤力

綠豆淀粉糊溶解度隨溫度的變化見圖7，綠豆淀粉糊膨潤力隨溫度的變化見圖8。

圖7 綠豆淀粉糊溶解度隨溫度的變化

圖8 綠豆淀粉糊膨潤力隨溫度的變化

淀粉分子與水分子之間的相互作用可依據不同溫度下的溶脹吸水和直鏈淀粉的析出表現出來[16]。由圖7可知，淀粉糊的溶解度與溫度呈正相關，當溫度為100℃時，其溶解度達到最大，為31.11%；由圖8可知，綠豆淀粉糊的膨潤力隨著溫度的升高而逐步增大，最大為23.22%。

2.2.4 淀粉糊凍融穩(wěn)定性

凍融穩(wěn)定性隨淀粉糊質量分數的變化見圖9。

圖9 凍融穩(wěn)定性隨淀粉糊質量分數的變化

凍融穩(wěn)定性為淀粉糊耐受冷凍、融解等劇烈物理變化的能力，一般用析水率來表示凍融穩(wěn)定性，析水率越大，凍融穩(wěn)定性就越差。從圖9可知，當淀粉糊質量分數為2%時，其析水率達到54.37%，極不穩(wěn)定，隨著綠豆淀粉糊的質量分數不斷增加，析水率逐步下降且趨于平緩，凍融穩(wěn)定性越來越好。

3 結論

采用水磨法提取綠豆淀粉，并使用酶法除蛋白以純化淀粉，通過單因素試驗及正交試驗獲得最佳純化工藝條件為酶解時間4.5 h，酶解溫度60℃，酶用量550 U/g，酶解液pH值9，在此工藝條件下，所制得的綠豆淀粉中蛋白質殘余量最少，為3.9 mg/g，淀粉純化效果最佳。綠豆淀粉顆粒表面較為光滑，呈圓形或橢圓形。綠豆淀粉糊的透明度與時間呈負相關，溶解度和膨潤力與溫度呈正相關，凍融穩(wěn)定性隨淀粉糊質量分數的增加而越來越高。研究為更高效地提取純化綠豆淀粉及提高其綜合利用價值提供了一定的理論參考。