李偉，李春根，穆曉紅，陳黎明，趙子義

1.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029；2.北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010；3.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京 100700；4.北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院，北京 100029

強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）屬于主要累及中軸關節(jié)的慢性自身免疫性疾?。?］，主要的病理過程是骶髂關節(jié)、脊柱及附近肌腱、韌帶骨附著點的慢性炎癥并繼發(fā)纖維化、骨化及新骨形成［2］。目前此病的病因、病機尚不明確，考慮與遺傳、自身免疫、感染、內分泌紊亂等因素相關［3-4］。流行病學研究發(fā)現(xiàn)，我國的發(fā)病率為0.3%［5］左右，且男性較女性多發(fā)，男女發(fā)病比例約為3∶1［6］。目前，尚無此病的根治辦法，治療上主要以控制患者臨床癥狀，延緩病情發(fā)展，改善預后為主。西醫(yī)治療藥物主要有緩解病情抗風濕藥（disease-modifying antirheumatic drugs，DMARDs）、非甾體類抗炎藥（nonsteroidal antiinflammatory drugs，NASIDs）、糖皮質激素、生物制劑等。非甾體類抗炎藥，是治療強直性脊柱炎的首選藥物，可以明顯緩解患者疼痛、晨僵等癥狀，但是不能阻止病情的進展并且長時間使用會導致胃腸道不良反應與肝腎功能損害［7］。緩解病情抗風濕類藥，目前臨床上主要使用的是氨甲蝶呤、柳氮磺吡啶等，可以有效改善患者病情［8］。但是Zochling等［9］研究發(fā)現(xiàn)，目前缺乏明確的證據(jù)證明緩解病情抗風濕類藥物對于AS患者中軸病變有效。生物制劑以其強大的抗炎及其免疫抑制作用在治療AS方面具有廣大的應用前景，但一旦停用可能導致病情加重而且價格昂貴［10］。中醫(yī)藥治療AS疾病具有獨特的優(yōu)勢。

中醫(yī)學并無“強直性脊柱炎”病名，多將其歸屬于“骨痹”“大僂”等范疇。中醫(yī)學認為本病屬于本虛標實之證，腎督空虛為本，感受外邪為標［11］，風寒濕邪留滯筋骨關節(jié)，陽氣不足，瘀血痰濁內生，脈絡瘀阻［12］。治療當以“標本兼治”為原則。補陽還五湯是《醫(yī)林改錯》的經典方劑，具有補氣活血通絡之功效，是治療強直性脊柱炎的常用方劑，均取得了較好的臨床療效。陳倩倩等［13］研究發(fā)現(xiàn)，補陽還五湯可以降低AS患者血紅細胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、C反應蛋白（C-reactiveprotein，CRP）水平，改善胸廓、脊柱關節(jié)活動度及臨床癥狀。相關動物實驗表明補陽還五湯能夠通過下調小鼠血清Rho激酶活性，抑制ROCK1（recombinant rho associated coiled coil containing protein Kinase 1）、TF（recombinant tissue factor）、MMP-2（matrix metallopeptidase-2）、MMP-9（matrix metallopeptidase-9）等AS相關基因介導的血管平滑肌細胞增殖，最終抑制AS病變的形成與發(fā)展［14］。現(xiàn)代藥理學研究亦表明，補陽還五湯具有擴張血管，抑制血小板聚集，改善局部微循環(huán)等作用［15］。目前，補陽還五湯治療強直性脊柱炎的主要活性成分及其分子機制未見系統(tǒng)描述。網絡藥理學是一門新興學科，是基于分子層面，通過數(shù)據(jù)可視化分析，構建藥物-有效成分-疾病-靶點網絡來預測藥物治療疾病的作用機制，彌補了“單成分、單靶點、單藥物、單疾病”研究模式的不足。因此，本次研究采用網絡藥理學方法預測補陽還五湯治療強直性脊柱炎的有效成分、作用靶點、關鍵通路，并解釋其作用機制。

1 資料與方法

1.1 補陽還五湯藥物化學成分及其相關靶點的搜集采用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（traditional chinesemedicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）、中藥分子機制綜合數(shù)據(jù)庫（traditional Chinese medicine integrated database，TCMID）、中藥分子機制生物信息學分析工具（a Bioinformatics Analysis Tool for MolecularmechANism of Traditional Chinese Medicine，BATMANTCM），檢索補陽還五湯組成藥物活性化學成分，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-like，DL）≥0.18為標準對所有活性成分進行篩選，并搜集有效化學成分相關靶點。

1.2 強直性脊柱炎疾病靶點的搜集通過人類基因數(shù)據(jù)庫（GeneCards）、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（onlinemendelian inheritance in man，OMIM）、治療靶標數(shù)據(jù)庫（therapeutic target database，TTD）、DrugBank數(shù)據(jù)庫，以“Ankylosing spondylitis”為關鍵詞搜集強直性脊柱炎的疾病靶點。刪除重復的靶點，導入Uniprot（Universal Protein）數(shù)據(jù)庫進行標準化處理。

1.3 藥物-疾病交集靶點、韋恩圖及活性成分-作用靶點的構建將補陽還五湯有效成分相關靶點及強直性脊柱炎疾病靶點導入venny 2.1.0在線作圖工具，獲得藥物-疾病交集靶點及其韋恩圖并將其交集靶點、有效成分，導入Cytoscape 3.6.1軟件，對藥物有效成分相關靶點-疾病相關靶點進行映射，構建活性成分-作用靶點網絡圖?；钚猿煞?、作用靶點用“節(jié)點”表示，節(jié)點之間的相互關系用“邊”表示。

1.4 蛋白互作（protein protein interaction，PPI）網絡的構建將藥物-疾病的交集靶點導入STRING軟件中（https：//string-db.org），選擇置信度score≥0.400，隱藏游離的節(jié)點。下載TSV數(shù)據(jù)文件，導入Cytoscape 3.6.1軟件進行數(shù)據(jù)可視化分析，使用cytoHubba插件的MCC算法找出PPI網絡的核心基因。

1.5 GO生物功能及KEGG信號通路富集分析采用DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫（The database for annotation，visualization and integrated discovery）對藥物、疾病的交集靶點進行基因本體（gene ontology，GO）生物功能與京都基因和基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信號通路富集分析，設定標準為P值小于0.05，使用imageGP作圖軟件對pvalue值最小的前20條結果制作氣泡圖進行可視化分析。

2 結果

2.1 補陽還五湯藥物化學成分及其相關靶點通過TCMSP、TCMID、BATMAN-TCM 3個數(shù)據(jù)庫結合相關文獻檢索，共獲得補陽還五湯藥物化學成分106個，其中赤芍29個，川芎7個，當歸尾2個，地龍3個，紅花22個，黃芪20個，桃仁23個；共獲取相關靶點1 031個。

2.2 強直性脊柱炎疾病靶點搜索結果通過GeneCards、OMIM、TTD、DrugBank等數(shù)據(jù)庫并結合相關文獻，獲得疾病靶點2 148個，其中DrugBank數(shù)據(jù)庫101個，GeneCards數(shù)據(jù)庫1 994個，OMIM數(shù)據(jù)庫50個，TTD數(shù)據(jù)庫3個，刪除重復的靶點，最終獲得強直性脊柱炎疾病靶點2 093個。

2.3 藥物-疾病交集靶點、韋恩圖及藥物-成分-疾病-靶點網絡將補陽還五湯藥物成分相關靶點、強直性脊柱炎疾病相關靶點導入venny 2.1.0在線作圖工具，共獲得雌激素受體-1（estrogen receptor 1，ESR1）、雄激素受體（Androgen Receptor，AR）、RELA蛋白（v-rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A，RELA）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、基質金屬蛋白酶2（matrix metallopeptidase-2，MMP2）等82個交集靶點及韋恩圖（見圖1）；將藥物-疾病交集靶點與藥物有效成分相互作用關系及屬性文件導入Cytoscape 3.6.1軟件并進行映射，構建藥物-成分-疾病-靶點網絡圖（見圖2）；根據(jù)Cytoscape軟件NetworkAnalyzer分析工具算出有效成分degree值，degree值越大表示節(jié)點的重要性越大。藥物有效成分degree值位于前5位的分別為槲皮素（quercetin）為56，山柰酚（kaempferol）為24，木樨草素（luteolin）為21，黃芩素（baicalein）為14，芒柄花黃素（formononetin）為12。見表1。

圖2 補陽還五湯治療強直性脊柱炎“有效成分-作用靶點”網絡圖

表1 補陽還五湯藥物有效成分及OB、DL值（degree值前10位）

圖1 補陽還五湯-強直性脊柱炎交集靶點及韋恩圖

2.4 蛋白互作（PPI）網絡結果將藥物-疾病的82個交集靶點導入STRING軟件中，擇置信度score≥0.400，下載TSV數(shù)據(jù)文件，導入Cytoscape 3.6.1軟件，共得到82個節(jié)點，1 121條邊，使用cytoHubba插件的MCC算法找出PPI網絡的核心基因，VEGFA、IL-10、基質金屬蛋白酶9（matrix metallopeptidase 9，MMP9）、前列腺素內過氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）等基因為PPI網絡核心基因。見圖3、圖4。

圖3 補陽還五湯治療強直性脊柱炎作用靶點蛋白互作（PPI）網絡圖

圖4 補陽還五湯治療強直性脊柱炎前10位核心靶點蛋白互作（PPI）網絡圖

2.5 補陽還五湯治療強直性脊柱炎作用靶點GO生物功能富集分析結果采用DAVID數(shù)據(jù)庫對補陽還五湯治療強直性脊柱炎作用靶點進行GO生物功能富集分析，共獲得P＜0.05的GO功能條目366條，其中生物過程（biological process，BP）284條，細胞組分（cellular component，CC）31條，分子功能（molecular function，MF）51條。生物過程主要富集在細胞對脂多糖的反應、RNA聚合酶II啟動子轉錄的正調控、炎癥反應、轉錄的正調控，DNA模板化、對藥物的反應等；細胞組分主要富集在細胞外間隙、胞外區(qū)、質膜外側、膜筏、細胞器膜等；分子功能主要富集在酶結合、轉錄因子結合、細胞因子活性、RNA聚合酶II轉錄因子活性，配體激活序列特異性DNA結合、類固醇激素受體活性等。見圖5、圖6、圖7。

圖5 補陽還五湯治療強直性脊柱炎作用靶點的BP分析示意圖

圖6 補陽還五湯治療強直性脊柱炎作用靶點的CC分析示意圖

圖7 補陽還五湯治療強直性脊柱炎作用靶點的MF分析示意圖

2.6 補陽還五湯治療強直性脊柱炎作用靶點KEGG信號通路富集分析結果通過DAVID數(shù)據(jù)庫對補陽還五湯治療強直性脊柱炎作用靶點進行KEGG信號通路富集分析，刪除“cancer”相關通路，共獲得P＜0.05的KEGG信號通路87條，根據(jù)P值對前30條信號通路繪制氣泡圖。結合相關文獻發(fā)現(xiàn)核因子κB（nuclear factor-k-gene binding，NFκB）信號通路、核苷酸寡聚化結構域（nucleotide oligomerzation domain，NOD）樣受體信號通路、缺氧誘導因子1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）信號通路、細胞因子-細胞因子-受體相互作用等信號通路是補陽還五湯治療強直性脊柱炎的關鍵通路。見圖8。前10位信號通路富集細節(jié)見表2。

表2 補陽還五湯治療請直性脊柱炎前10位信號通路富集細節(jié)表

圖8 補陽還五湯治療強直性脊柱炎作用靶點的KEGG富集分析示意圖

3 討論

強直性脊柱炎的病機為腎督空虛，陽氣不足，風寒濕外邪侵襲，留滯筋骨關節(jié)，痰濁瘀血內生阻于脈絡［11-12］。補陽還五湯是治療AS的經典方劑，方中黃芪大補元氣，氣行則血行，瘀去則絡通為君藥；當歸活血而補血，化瘀而不傷正為臣藥；桃仁、紅花、赤芍、川芎、地龍活血祛瘀，通經活絡為佐藥，共奏補氣活血通絡之良效。本次研究，借助網絡藥理學的研究方法，共獲得補陽還五湯藥物活性成分106個，通過可視化分析并結合相關文獻獲悉槲皮素、山柰酚、木樨草素、黃芩素、芒柄花黃素等成分是補陽還五湯治療強直性脊柱炎的關鍵藥物成分。槲皮素屬于黃酮類化合物，相關研究證實槲皮素具有抗炎、抗氧化、清除氧自由基、抗凋亡、免疫調節(jié)等作用［16］。研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可以抑制人體外周血單核細胞促炎細胞因子TNF-α的增殖及基因水平，降低IL-1β、IL-6等炎癥因子以及MMP3、MMP9的表達，抑制炎癥介質的產生，從而改善炎癥癥狀［17-18］。動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素通過抑制小鼠脊髓小膠質細胞MMP9、MMP2的活化，具有改善疼痛的作用［19］。山柰酚、芒柄花黃素通過下調MMP9、抗酒石酸酸性磷酸酶、整合素β3，抑制破骨細胞骨吸收相關蛋白與基因的表達水平及單核巨噬細胞向破骨細胞的增殖分化，具有骨保護作用［20-21］。此外山柰酚還可以降低FGFR3活性，抑制堿性成纖維細胞因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）對FGFR3-RSK2信號軸的激活水平，調控滑膜細胞的增殖遷移及T細胞介導的炎性細胞因子IL-7、IL-21、TNF-α的釋放，緩解炎癥反應［20］。研究發(fā)現(xiàn)，木樨草素通過調控NF-κB通路和M1巨噬細胞極化，抑制巨噬細胞促炎癥細胞因子IL-6、IL-12、TNF-α的釋放而緩解炎癥癥狀［22］；動物研究還發(fā)現(xiàn)，木樨草素通過抑制脂多糖介導的NF-κB通路可以減緩細胞凋亡［23］；Kritas等［24］研究證明木樨草素具有抗氧化作用，可以抑制肥大細胞介導的炎癥及過敏反應。黃芩素具有抗炎、抗菌、抗氧化、免疫調節(jié)、抗癌等作用，黃芩素屬于黃嘌呤氧化酶抑制劑，有效抑制黃嘌呤氧化過程中的產生的氧自由基，其具備的羥基結構也賦予了其自由基清除活性［25-26］。張海麗等［27］通過動物實驗研究證實，黃芩素可以抑制脂多糖、三磷酸腺苷誘導的巨噬細胞炎癥反應。

此外，黃芩素通過調控花生四烯酸代謝通絡，抑制環(huán)氧煤、脫氧酶、核因子及細胞因子的產生而發(fā)揮強大的解熱鎮(zhèn)痛作用［26］。

通過藥物-疾病作用靶點富集分析結合相關文獻發(fā)現(xiàn)，補陽還五湯治療強直性脊柱炎關鍵靶點基因為VEGFA、IL-10、MMP9、PTGS2等。章敏等［28］研究發(fā)現(xiàn)VEGF等增殖與遷移，介導了骨與軟骨的損傷。IL-10是理想的抗炎因子，Rabelo等［29］研究發(fā)現(xiàn)，在接受治療的AS患者中IL-10呈現(xiàn)高表達水平，代表了抑制性反饋途徑及對炎癥的抑制反應，Tian等［30］通過動物實驗發(fā)現(xiàn)IL-10還具有抑制滑膜增殖及促進關節(jié)軟骨修復作用。MMP9屬于蛋白水解酶家族，通過對膠原、蛋白多糖、細胞外基質的降解作用，導致了骨組織及關節(jié)軟骨的破壞，此外，由于對細胞外介質膠原蛋白的破壞作用，導致細胞屏障的破壞，血管通透性增加和機體炎癥反應的發(fā)生［31-32］。PTGS2的高表達會導致成纖維細胞樣滑膜細胞的增殖，影響血清中TNF-α、IL-1β、IL-6的表達水平，加劇炎癥反應［33］。通過對藥物-疾病作用靶點的GO生物功能富集分析結果，并查閱相關文獻發(fā)現(xiàn)細胞對脂多糖的反應、類固醇激素受體活性等生物功能與AS的發(fā)生發(fā)展密切相關。研究發(fā)現(xiàn)，脂多糖具有抗原性，具有刺激機體產生免疫炎癥反應，誘導黏附分子、細胞趨化因子、炎癥細胞因子在局部關節(jié)的聚集，導致機體對自身蛋白聚糖的免疫反應［34］。類固醇激素包括雄激素、雌激素、孕激素等，研究發(fā)現(xiàn)類固醇激素通過激活類固醇激素受體啟動轉錄調節(jié)，通過神經膠質細胞的作用，為神經元提供營養(yǎng)支持及神經保護［35］。

通過對補陽還五湯治療強直性脊柱炎的作用靶點，進行KEGG富集分析并結合相關文獻發(fā)現(xiàn)NF-κB信號通路、NOD樣受體信號通路、HIF-1信號通路、細胞因子-細胞因子-受體相互作用等通路是補陽還五湯治療強直性脊柱炎的關鍵通路。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB信號通路在強直性脊柱炎的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，其主要機制是，一方面活化的NF-κB信號通路加速了TNF-α、IL-8、黏附細胞因子等炎癥介質的基因表達，加劇了炎癥反應；另一方面阻斷成纖維滑膜樣細胞的凋亡，促進了成纖維滑膜樣細胞的增殖［36］。核苷酸結合寡聚域（nucleotide oligomerzation domain，NOD）樣 受 體（NOD-like Receptors，NLRs）主要存在于機體免疫細胞及上皮細胞中，在調控機體免疫及炎癥反應方面具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，NLR激活后形成高分子復合體，通過受體相互作用蛋白2，進一步激活NF-κB信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinases，MAPK）信號通路，導致炎癥反應的發(fā)生；此外，NOD作為細胞內模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR），通過識別細胞壁胞壁酰二肽（muramyl dipeptide，MDP）成分參與機體固有免疫反應，也介導了炎癥介質的釋放［37-38］。吳洪亮［39］通過動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α通過活化BMP信號通路，促進脂肪干細胞的成骨分化，抑制骨小梁破損，具有良好的骨組織修復作用。相關研究發(fā)現(xiàn)細胞因子受體作用蛋白通過活化TNF信號通路、Toll樣受體信號通路、驅動細胞壞死、壞死非依賴途徑調節(jié)炎癥小體形成等機制介導了細胞壞死及機體炎癥反應的發(fā)生［40］。

綜上所述，補陽還五湯治療強直性脊柱炎主要是通過槲皮素、山柰酚、木樨草素、黃芩素、芒柄花黃素等活性成分作用于VEGFA、IL-10、MMP9、PTGS2等靶點基因，從而調節(jié)多條生物學功能與信號通路，最終達到治療作用。但是，此次研究尚存在不足之處，需要后期進一步實驗驗證。