時明偉，蔣西玲，史智君，王孟雨，陳新旺

1.河南中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450008；2.南陽市第二人民醫(yī)院，河南 南陽 473000；3.河南省人民醫(yī)院，河南 鄭州 450008；4.河南中醫(yī)藥大學，河南 鄭州 450046

目前，因社會節(jié)奏、生活壓力等諸多問題，失眠已成為最常見的睡眠障礙之一，影響從兒童到老年各個年齡階段的人。研究表明，至少33%的成年人出現(xiàn)間歇性失眠癥狀，10%～22%的成年人有慢性睡眠困難［1-3］。失眠的特點是難以入睡、難以保持睡眠、整晚頻繁醒來、醒來無法再入睡、睡眠無法恢復等，常合并有心血管疾病或抑郁、焦慮等情緒障礙。長時間的失眠狀態(tài)還會導致認知、社交和身體機能的下降，增加工作事故，甚至有自殺傾向［4-5］。因此，失眠的機制研究及適宜干預方法的探討是臨床研究的重點。

睡眠是一個周期性的、節(jié)律性的復雜生理過程，由自身生物鐘和機體平衡機制嚴格調(diào)控，睡眠/覺醒周期與神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)和生理變化密切相關(guān)，腦內(nèi)的相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元活動來控制睡眠與覺醒［6］。研究表明，下丘腦小分子神經(jīng)肽可能在維持睡眠覺醒的觸發(fā)開關(guān)中具有重要作用［7-8］，參與睡眠-覺醒的調(diào)節(jié)。Orexin覺醒纖維最重要的作用是維持覺醒，當其功能被抑制時，則覺醒減少，睡眠增加［9］，反之則會維持覺醒狀態(tài)。艾灸療法在臨床治療失眠中效果顯著，且當艾灸使用量增加時效果尤甚［10-11］。本研究通過采用重灸法來觀察下丘腦組織中Orexin-A蛋白表達的變化情況，以闡述重灸在失眠治療中的作用及對Orexin-A表達的影響，為進一步探討灸法在治療失眠中的作用機制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動物SPF級雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量（200±10）g，山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司提供，生產(chǎn)批號：SCXK（魯）-20140007。大鼠飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學動物實驗中心，自由攝取食物和水，室溫22℃，濕度20%～30%，12 h/12 h明暗交替。

1.2 藥物與試劑對氯苯丙氨酸（美國Sigma公司，批號：SHBH7873）；兔抗大鼠Orexin-A多克隆抗體、生物素標記山羊抗兔IgG（武漢博士德生物工程有限公司，貨號：BA2677-1、BA1005）；即用型SP免疫組化染色試劑盒（北京中杉金橋生物有限公司，貨號：SPN-9001）；枸櫞酸緩沖液（上海信裕生物科技有限公司，貨號：90801A-20）；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）、TBST緩沖液、PBST緩沖液（上海源葉生物科技有限公司，貨號：R20857、R21284、R20863）；精制細艾絨（南陽漢醫(yī)艾絨廠）。

1.3 儀器清鈴撳針（規(guī)格：0.3×0.2 mm，固始公元醫(yī)療器械有限公司，注冊號：豫食藥監(jiān)械（準）字2010第2270165號）；BX53型顯微圖像采集系統(tǒng)（日本Olympus公司）；DYY-6C型電泳儀（北京六一儀器廠）。

2 方法

2.1 分組造模與干預將大鼠按體質(zhì)量隨機分為5組，即空白組、模型組、重灸組、針刺組和溫和灸組，每組8只。調(diào)節(jié)生理鹽水的pH至7～8，將對氯苯丙氨酸配置成30 g·L-1的混懸液。除空白組外，其余組大鼠按10 mL·kg-1的劑量腹腔注射對氯苯丙氨酸溶液，每天1次，連續(xù)2 d，建立失眠大鼠模型。造模成功后，將大鼠固定在特制鼠籠中，使其不能來回移動，于每天下午14點開始干預。重灸組大鼠背俞穴位置剃毛，涂抹大蒜汁，一次性灸至破潰或化膿后單籠飼養(yǎng)，期間不進行任何處理；針刺組在背俞穴應用撳針治療，膠帶固定，防止撳針脫落，每2天更換一次；溫和灸組于背俞穴處進行常規(guī)溫和灸治療，每次艾灸10 min，灸至皮膚微微潮紅為度，每天1次，連續(xù)6 d?？瞻捉M、模型組大鼠只固定不做其它處理。背俞穴選取雙側(cè)“心俞”“脾俞”“腎俞”穴位，定位參照余曙光主編的上?？茖W技術(shù)出版社《實驗針灸學》教材［12］。

2.2 免疫組化測定下丘腦組織中Orexin-A的表達每組取6只大鼠的部分下丘腦組織，固定，切片，片厚4μm，脫蠟，水化，PBS沖洗3次，滴加3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，室溫孵育10 min。蒸餾水漂洗2 min，PBS沖洗后抗原修復，放入枸櫞酸緩沖液，加熱沸騰，反復3次，冷卻30 min，PBS沖洗3次。正常山羊血清室溫孵育30 min，滴加Orexin-A一抗（1∶100），4℃過夜。室溫20 min，PBS沖洗2次，每次2 min，滴加羊抗兔IgG二抗（1∶100），PBS沖洗3次，每次3 min。DAB顯色，蒸餾水水洗2次，蘇木素輕度復染2 min，中性樹膠封片。顯微鏡觀察切片，每張切片隨機選取5個不同的視野，用Image-ProPlus 6.0病理圖像分析軟件，根據(jù)染色面積和強度進行半定量分析，結(jié)果用光密度（optical density，OD）值表示。

2.3 Western Blot檢測Orexin-A的表達各組取6只大鼠的部分下丘腦組織，蛋白裂解、提取、研磨、離心、取上清液，測蛋白濃度后配膠、上樣，進行轉(zhuǎn)膜。5%脫脂牛奶封閉1 h，加入稀釋后的一抗，4℃過夜。TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，二抗室溫孵育1 h；PBST緩沖液洗凈二抗，進行化學發(fā)光、顯影、定影，膠片掃描，應用Gel-proPlus軟件計算目的蛋白和內(nèi)參蛋白β-actin的光密度值，進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2.4 統(tǒng)計學方法用SPSS 20.0軟件對結(jié)果進行統(tǒng)計學處理，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05表示有顯著性差異，P＜0.01表示有極顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 Orexin-A蛋白免疫組化染色結(jié)果與空白組比較，模型組大鼠下丘腦組織中Orexin-A的蛋白表達顯著升高（P＜0.05），說明模型制備成功。與模型組比較，重灸組、針刺組、溫和灸組大鼠下丘腦組織中Orexin-A的蛋白表達顯著降低（P＜0.05）；與重灸組比較，溫和灸組與針刺組大鼠下丘腦組織中Orexin-A的蛋白表達顯著升高（P＜0.05）；與針刺組比較，溫和灸組大鼠下丘腦組織中Orexin-A的蛋白表達顯著升高（P＜0.05）。提示，重灸可明顯降低失眠模型大鼠下丘腦組織中Orexin-A的蛋白表達水平。見表1、圖1。

表1 各組大鼠下丘腦組織中Orexin-A陽性表達細胞的OD值比較 （±s）

表1 各組大鼠下丘腦組織中Orexin-A陽性表達細胞的OD值比較 （±s）

注：與空白組比較，△P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05；與重灸組比較，▲P＜0.05；與針刺組比較，▽P＜0.05

Orexin-A空白組組別 n 0.12±0.01模型組 6 0.52±0.01△重灸組 6 0.23±0.01*針刺組 6 0.28±0.01*▲溫和灸組 6 0.41±0.01*▲▽6

圖1 各組大鼠下丘腦組織中Orexin-A陽性細胞表達免疫組化檢測圖（×200）

3.2 Orexin-A蛋白W estern Blot檢測結(jié)果與空白組相比，模型組大鼠下丘腦組織中Orexin-A的蛋白表達水平顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，重灸組、針刺組和溫和灸組大鼠下丘腦組織中Orexin-A的蛋白表達顯著降低（P＜0.05）；與重灸組比較，針刺組和溫和灸組大鼠下丘腦組織中Orexin-A的蛋白表達顯著升高（P＜0.05）；與針刺組比較，溫和灸組大鼠下丘腦組織中Orexin-A的蛋白表達顯著升高（P＜0.05）。提示，重灸可抑制失眠模型大鼠下丘腦組織中Orexin-A蛋白的表達。見圖2、圖3。

圖2 W estern Blot檢測各組大鼠下丘腦組織中Orexin-A的表達

圖3 Orexin-A蛋白表達的比較

4 討論

Orexins也被稱為食欲素，包含Orexin-A和Orexin-B，位于下丘腦外側(cè)，屬于兩個孤兒G蛋白偶聯(lián)受體Orexin-1（OX1R）和Orexin-2（OX2R）的內(nèi)源性配體，最初被認為是與攝食行為有關(guān)，但其主要作為睡眠/覺醒周期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，其纖維末梢及受體廣泛分布于包括大腦皮層在內(nèi)的眾多腦區(qū)［13-14］。Orexins系統(tǒng)與膽堿能、單胺能神經(jīng)元之間存在廣泛的聯(lián)系，參與多種神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)，如乙酰膽堿、組胺、去甲腎上腺素、羥色胺和多巴胺等，組成一個控制睡眠-覺醒的復雜網(wǎng)絡(luò)［15-16］。OX1R在海馬區(qū)、下丘腦旁核、下丘腦腹內(nèi)側(cè)核、背縫核、藍斑等腦區(qū)表達；OX2R主要存在大腦皮質(zhì)、海馬、背縫核和許多下丘腦核，包括室旁核和結(jié)節(jié)乳頭體核，而背縫核、藍斑、結(jié)節(jié)乳頭體核是眾所周知的覺醒開始區(qū)［17-19］。研究表明，敲除Orexins基因的小鼠、貓均會出現(xiàn)嗜睡癥狀［20-21］。在藍斑、背外側(cè)被蓋核、腦室或側(cè)腦室注射Orexin則可引起睡眠減少，覺醒增加的情況，這與Orexin-A能夠作用于下丘腦多個內(nèi)穩(wěn)態(tài)中心，增加神經(jīng)電活動，抑制快動眼睡眠，提高覺醒度有關(guān)［22］。

古代醫(yī)籍中關(guān)于“重灸法”記載甚多，《小品方》記載“取穴甚少，灸壯甚多”［23］；《備急千金要方·婦人方》：“婦人胞落頹，灸臍中三百壯”［24］，提出施灸時要注重艾灸的量，施灸時的壯數(shù)根據(jù)情況可多達幾百壯。古人認為，只有灸得發(fā)瘡，疾病才得以痊愈。《針灸資生經(jīng)》中云：“凡著艾得灸瘡發(fā)，所患即差，不得瘡發(fā)，其病不愈”［25］。古代醫(yī)家在施灸時都要求灸量充足、得氣?！夺t(yī)宗金鑒·刺灸心法要訣》記載：“凡灸諸病，必火足氣到始能愈”［26］?！爸鼐姆ā笔歉鶕?jù)古人大病用大劑量艾灸，以及在治病時強調(diào)“灸瘡必發(fā)，去病如把抓”的觀點，使得灸治能夠達到相應的刺激，更好的調(diào)整臟腑功能。現(xiàn)代臨床研究發(fā)現(xiàn)，針對一些頑固性疾病和慢性病，在進行針灸治療時，加大灸量達到適合的刺激強度才能發(fā)揮灸法的作用［27-28］。不同的灸量對皮下組織影響的差異性、疼痛閾、巨噬細胞吞噬能力、微循環(huán)、免疫應答等可產(chǎn)生不同的效果［29-30］。失眠癥屬于一種慢性病癥，長時間不愈會導致全身臟腑的損害，本課題根據(jù)重灸法思想，將發(fā)灸瘡設(shè)定為刺激強度，作用于心俞穴、脾俞穴、腎俞穴，起到調(diào)心安神、健脾益氣、交通心腎等作用，使機體臟腑經(jīng)絡(luò)調(diào)和通達，氣血平和順暢，機體歸于“陰平陽秘”，寤寐有節(jié)的狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示，Orexin-A蛋白在失眠模型大鼠中的表達增加，大鼠保持覺醒的狀態(tài)；通過重灸、針刺、溫和灸的干預后，Orexin-A的表達明顯降低，其中以重灸對Orexin-A蛋白表達的影響最為明顯，其次是針刺組、溫和灸組。提示，重灸對于失眠的干預效果最好。

綜上所述，重灸可改善失眠模型大鼠下丘腦Orexin-A的蛋白表達，進而影響大鼠的睡眠，改善睡眠質(zhì)量。本研究為重灸治療失眠的作用提供了實驗依據(jù)，為進一步研究灸法的量效關(guān)系提供了借鑒，但重灸治療失眠的作用機制還有待進一步深入研究。