程清波,楊艷萍,王瀅,程文濤,張晉芬,張小莉
1.應(yīng)城市人民醫(yī)院,湖北 應(yīng)城 432400;2.武漢科技大學(xué)附屬醫(yī)院,湖北 武漢 430000
肝癌是臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤疾病,在我國(guó)的死亡率高居惡性腫瘤第二位,而每年新發(fā)病例數(shù)量占全球50%以上,且發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì),已成為我國(guó)重大公共健康問(wèn)題[1-2]。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展,手術(shù)、放化療、靶點(diǎn)治療等手段不斷提高,肝癌得到一定程度的控制,但總體療效仍不理想[3]。近年來(lái),中醫(yī)藥在腫瘤治療中的應(yīng)用受到越來(lái)越多的重視。中醫(yī)認(rèn)為,腫瘤屬于“積聚”的范疇,《難經(jīng)》中記載:“肝之積為肥氣,在左脅下,如覆杯”[4],其中肝積、肥氣等描述與肝癌相似。山慈菇是蘭科植物杜鵑蘭和獨(dú)蒜蘭的假球莖,具有清熱解毒、消癰散結(jié)之功效[5-6]。研究顯示,山慈菇在乳腺癌、肝癌、胃癌等癌癥中表現(xiàn)出抗腫瘤作用,可明顯抑制新生毛細(xì)血管的生成[7-9]。現(xiàn)今山慈菇與肝癌的研究大多集中于杜鵑蘭的單體成分,而有關(guān)含藥血清的藥理研究較少?;诖耍狙芯靠疾焐酱裙胶幯澹≒seudobulbus Cremastrae seu Pleiones pharmaceutic serum,PCPS)對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2生長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)、凋亡及間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響,為山慈菇對(duì)肝癌的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與動(dòng)物動(dòng)物:40只健康SD大鼠,雌性,2月齡,體質(zhì)量180~220 g,購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,許可證號(hào):SYXK(京)2019-0030。大鼠正常攝食飲水,12 h/12 h晝夜交替,室內(nèi)溫度22~25℃,濕度40~60%。
細(xì)胞:人肝癌細(xì)胞HepG2(上海恒斐生物科技有限公司,貨號(hào):SCC-110211)。
1.2 藥物與試劑山慈菇購(gòu)自億弘堂藥業(yè)有限公司。Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒(弗元生物科技有限公司,貨號(hào):FY600016-20T);二甲基亞砜(上海聯(lián)碩生物科技有限公司,貨號(hào):0231);細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(cell counting kit 8,CCK8)、EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物,貨號(hào):C0071S、C0038);細(xì)胞固定液、甘氨酸(浙江聯(lián)碩生物科技有限公司,貨號(hào):E703-1L、0167);戊巴比妥鈉、滲透劑(化源網(wǎng),貨號(hào):57-33-0、1639-66-3);上皮鈣黏素(E-cadherin)抗體、波形蛋白(Vimentin)抗體、p27抗體、Survivin抗體、神經(jīng)鈣黏素(N-cadherin)抗體和GAPDH抗體(圣克魯斯生物技術(shù)公司,貨號(hào):sc-21791、sc-373717、sc-1641、sc-17779、sc-8424、sc-51332);HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(武漢艾美捷科技有限公司,貨號(hào):4030-05);DMEM高糖培養(yǎng)基(Worldrm生物商城,貨號(hào):D6046);RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(鄭州九龍生物制品有限公司,貨號(hào):BC-B-021、JLAQ-110);RIPA裂解液(上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司,貨號(hào):PC101);蛋白定量試劑盒、結(jié)晶紫指示劑、碘化丙啶(propidium iodide,PI)(上海源葉生物公司,貨號(hào):R21252-500T、R22103、25535-16-4);75%乙醇(南京化學(xué)試劑股份有限公司,貨號(hào):64-17-5)。
1.3 儀器Transwell小室(北京明陽(yáng)科華生物科技有限公司,貨號(hào):BD-353502);人工基底膜(北京盈豐大通科技有限公司,貨號(hào):354234);Being BPN-RHP型CO2培養(yǎng)箱(武漢集思儀器設(shè)備有限公司);MA-6000型熒光定量PCR儀(濟(jì)南千司生物技術(shù)有限公司);FrontierTM5000型離心機(jī)(美國(guó)奧豪斯公司);BDF-25V270型低溫冰箱(山東博科科學(xué)儀器有限公司);BXF-80型倒置顯微鏡(上海炳宇光學(xué)儀器有限公司);EPS-300型電泳儀(上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司);JS-680D型凝膠成像儀(杭州得聚儀器設(shè)備公司);1703940型半干電轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)伯樂(lè)公司);CytoFLEX型流式細(xì)胞儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司);XSP-63B型熒光顯微鏡(上海光學(xué)儀器公司);DNM-9606型酶標(biāo)儀(南京普朗醫(yī)用設(shè)備有限公司);ZHBF-RE型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(北京中環(huán)北方環(huán)??萍加邢薰荆?。
2.1 山慈菇濃煎液的制備準(zhǔn)確稱取100 g山慈菇,將其粉碎后,置于去離子水中浸泡2 h,通過(guò)水煎法制備山慈菇提取液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將提取液濃縮至濃度為1 kg·L-1,即為山慈茹濃煎液[10]。
2.2 PCPS的制備將40只雌性SD大鼠隨機(jī)分為空白組和山慈菇低、中、高劑量組,每組10只,山慈菇低、中、高劑量組分別以5 mL·kg-1、10mL·kg-1、20mL·kg-1的劑量灌胃給予1 kg·L-1山慈菇濃煎劑,每天1次,連續(xù)6 d,空白組給予生理鹽水。末次給藥2 h后,以1 mL·kg-1的劑量腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠,腹主動(dòng)脈采血,靜置2 h,2 000 r·min-1離心15 min,離心半徑20 cm,分離上層血清,置于56℃水浴30 min,過(guò)濾除菌,置于-20℃?zhèn)溆茫?1]。
2.3 細(xì)胞培養(yǎng)肝癌細(xì)胞HepG2為貼壁細(xì)胞,以含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%時(shí),進(jìn)行消化傳代培養(yǎng),選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。
2.4 細(xì)胞形態(tài)觀察將HepG2細(xì)胞以1×106mL-1接種于6孔板,待細(xì)胞貼壁后分別添加空白組、山慈菇低劑量組、山慈菇中劑量組、山慈菇高劑量組大鼠的含藥血清,培養(yǎng)24 h,光鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。
2.5 CCK8法檢測(cè)HepG2細(xì)胞活力將HepG2細(xì)胞以1×105mL-1接種于96孔板,待細(xì)胞貼壁后分別添加空白組、山慈菇低劑量組、山慈菇中劑量組、山慈菇高劑量組大鼠的含藥血清,培養(yǎng)24 h、48 h、72 h及96 h后,加入含有10μL CCK8的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)1~4 h(待培養(yǎng)基顏色變?yōu)槌壬?,?50 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔吸光度。
2.6 EdU染色檢測(cè)HepG2細(xì)胞增殖將HepG2細(xì)胞以1×106mL-1接種于6孔板,待細(xì)胞貼壁后分別添加空白組、山慈菇低劑量組、山慈菇中劑量組、山慈菇高劑量組大鼠的含藥血清,培養(yǎng)24 h,再加入50μmol·L-1EdU培養(yǎng)基100μL,繼續(xù)培養(yǎng)2 h,分別加入細(xì)胞固定液、甘氨酸、滲透劑進(jìn)行細(xì)胞固化,Apollo染色和DNA染色后,于熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)粉色熒光細(xì)胞(即為增殖細(xì)胞)。
2.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)HepG2細(xì)胞凋亡將HepG2細(xì)胞以5×104mL-1接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中,待細(xì)胞貼壁后分別添加空白組、山慈菇低劑量組、山慈菇中劑量組、山慈菇高劑量組大鼠的含藥血清,培養(yǎng)48 h,收集細(xì)胞,加入預(yù)冷的75%乙醇,4℃固定過(guò)夜,再分別加入Annexin V-FITC和PI,避光孵育20 min,加入結(jié)合緩沖液,1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。
2.8 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HepG2細(xì)胞侵襲以Matrigel基質(zhì)膠包被Transwell小室底膜的上室面,置于六孔板,將HepG2細(xì)胞以1×106mL-1接種于Transwell小室上室,下室添加含有20%胎牛血清的培養(yǎng)基,待細(xì)胞貼壁后分別添加空白組、山慈菇低劑量組、山慈菇中劑量組、山慈菇高劑量組大鼠的含藥血清,培養(yǎng)24h,拭去基質(zhì)膠和上室內(nèi)細(xì)胞,75%預(yù)冷酒精固定30 min后,以0.1%結(jié)晶紫染色5~10 min,光鏡下拍照并計(jì)數(shù)。
2.9 蛋白免疫印跡法檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)將HepG2細(xì)胞以1×106mL-1接種于6孔板,待細(xì)胞貼壁后分別添加空白組、山慈菇低劑量組、山慈菇中劑量組、山慈菇高劑量組大鼠的含藥血清,培養(yǎng)24 h后,添加RIPA裂解液提取總蛋白,采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞中細(xì)胞周期抑制因子p27、凋亡抑制因子Survivin及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)記物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的表達(dá),以GAPDH為內(nèi)參,計(jì)算各目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。
2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采取統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 17.0分析處理,數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,本文所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn),兩組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3.1 PCPS對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響光鏡下觀察顯示,空白組細(xì)胞為橢圓形或短梭形,有短偽足;PCPS處理后細(xì)胞偽足減少,且20 mL·kg-1PCPS組細(xì)胞體積明顯增大。見(jiàn)圖1。
圖1 PCPS對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響(×200)
3.2 PCPS對(duì)HepG2細(xì)胞活力的影響與空白組比較,10 mL·kg-1、20 mL·kg-1PCPS處理后,細(xì)胞活力明顯降低(P<0.05),但5 mL·kg-1PCPS處理后細(xì)胞活力無(wú)明顯變化。見(jiàn)圖2。
圖2 PCPS對(duì)HepG2細(xì)胞活力的影響
3.3 PCPS對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響與空白組比較,10 mL·kg-1、20 mL·kg-1PCPS組細(xì)胞增殖率明顯降低(P<0.05),但5 mL·kg-1PCPS組細(xì)胞增殖率無(wú)明顯變化。見(jiàn)圖3。
3.4 PCPS對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響與空白組比較,10 mL·kg-1、20 mL·kg-1PCPS組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05),但5 mL·kg-1PCPS組細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯變化。見(jiàn)圖4。
圖4 PCPS對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響
3.5 PCPS對(duì)HepG2細(xì)胞侵襲的影響與空白組比較,10 mL·kg-1、20 mL·kg-1PCPS組細(xì)胞侵襲率明顯降低(P<0.05),但5 mL·kg-1PCPS組細(xì)胞侵襲率無(wú)明顯變化。見(jiàn)圖5。
圖5 PCPS對(duì)HepG2細(xì)胞侵襲的影響
3.6 PCPS對(duì)HepG2細(xì)胞p27和Survivin蛋白表達(dá)的影響與空白組比較,10 mL·kg-1、20 mL·kg-1PCPS組細(xì)胞中p27蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05),Survivin蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05),但5 mL·kg-1PCPS組細(xì)胞中p27和Survivin蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化。見(jiàn)圖6。
圖6 PCPS對(duì)HepG2細(xì)胞p27和Survivin蛋白表達(dá)的影響
3.7 PCPS對(duì)HepG2細(xì)胞中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化蛋白表達(dá)的影響與空白組比較,10 mL·kg-1、20 mL·kg-1PCPS組細(xì)胞中E-cadherin蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05),而N-cadherin和Vimentin的蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05),但5 mL·kg-1PCPS組上述蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化。見(jiàn)圖7。
圖7 PCPS對(duì)HepG2細(xì)胞中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化蛋白表達(dá)的影響
由于對(duì)腫瘤的認(rèn)識(shí)不足,多數(shù)肝癌患者確診時(shí)已進(jìn)入中晚期,錯(cuò)失治療的最佳時(shí)期,臨床治療時(shí)常加大化療劑量,控制肝癌細(xì)胞,但其毒副作用也非常明顯[12]。同時(shí),長(zhǎng)期化療可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥,使治療效果不佳[13]。因此,尋求安全、有效的治療藥物,一直是醫(yī)學(xué)界的研究熱點(diǎn)。隨著各類腫瘤細(xì)胞和腫瘤動(dòng)物模型研究的日益成熟,中藥以其療效肯定,藥性溫和,持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)的特點(diǎn),在腫瘤康復(fù)治療中展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[14-15]。龔正等[16]觀察不同中藥復(fù)方聯(lián)合鹽酸??颂婺嶂委熗砥诜切〖?xì)胞肺癌療效發(fā)現(xiàn),艾愈膠囊(山慈菇、白英、當(dāng)歸等)或復(fù)方斑蝥膠囊(斑蝥、人參、黃芪等)聯(lián)合鹽酸??颂婺岬寞熜Ь鶅?yōu)于單用鹽酸??颂婺?,且不增加藥物的副作用。山慈菇是蘭科植物杜鵑蘭和獨(dú)蒜蘭的假球莖,在臨床上多以復(fù)方入藥,用于腫瘤的治療。現(xiàn)代藥理研究顯示,山慈菇提取的單體成分具有抗腫瘤作用,可通過(guò)細(xì)胞毒作用抑制腫瘤細(xì)胞增殖與侵襲轉(zhuǎn)移、抑制新生血管生成、誘導(dǎo)其凋亡及免疫調(diào)節(jié)等[17]。Liu等[18]從杜鵑蘭醇提物中分離的雙菲類化合物對(duì)乳腺癌細(xì)胞BT474和SKBR3有明顯的細(xì)胞毒性。姜爽等[19]觀察到山慈菇多糖對(duì)小鼠骨肉瘤細(xì)胞S180具有明顯的抑瘤作用,可能與提高機(jī)體免疫力有關(guān)。中藥藥理研究中,含藥血清藥理研究也是一種體外實(shí)驗(yàn)法,可明顯克服粗體物體外實(shí)驗(yàn)的干擾,更為接近中藥在體內(nèi)環(huán)境中產(chǎn)生藥理效應(yīng)的真實(shí)過(guò)程[20]。陳思等[21]通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),PCPS可有效抑制人乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3的活性,加速細(xì)胞凋亡,并抑制其遷移能力。以上實(shí)驗(yàn)充分肯定了山慈茹的抗腫瘤活性,但PCPS在肝癌中的抗腫瘤作用及其機(jī)制尚不完全清楚,因此,本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探究PCPS對(duì)肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)特征的影響及相關(guān)作用機(jī)制。
癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、侵襲是腫瘤惡化的特征。本研究通過(guò)CCK8和EdU染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),PCPS干預(yù)肝癌細(xì)胞后,可明顯抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖能力。p27蛋白是細(xì)胞周期負(fù)向調(diào)控因子的主要成員,主要對(duì)外部促進(jìn)或抑制細(xì)胞增殖的信號(hào)起反應(yīng)[22]。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示,經(jīng)PCPS處理后肝癌細(xì)胞中p27蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào),提示PCPS抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖可能與p27的激活有關(guān)。此外,在Transwell小室實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn),PCPS可顯著抑制肝癌細(xì)胞的侵襲能力。而癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithe-lialmesenchyml transition,EMT)密切相關(guān)[23]。Ecadherin為上皮標(biāo)志蛋白,Vimentin和N-cadherin為間葉標(biāo)志蛋白,它們?cè)诩?xì)胞黏附、遷移等方面發(fā)揮重要作用[24],其中,Ecadherin下調(diào)、Vimentin和Fibronectin上調(diào)被認(rèn)為是EMT發(fā)生的重要標(biāo)志[25-26]。在本研究中,經(jīng)PCPS處理后,肝癌細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào),而N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào),提示PCPS可能通過(guò)調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,抑制HepG2細(xì)胞的侵襲能力。
凋亡是細(xì)胞程序性死亡的一種形式,能有序和有效地去除受損細(xì)胞,與很多疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān),包括癌癥[27-28]。在本研究中,通過(guò)凋亡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),PCPS處理HepG2細(xì)胞48 h后,細(xì)胞凋亡率明顯升高。Survivin蛋白作為重要的凋亡抑制因子,可直接抑制凋亡終末效應(yīng)酶活性,阻斷細(xì)胞凋亡過(guò)程,還可與周期蛋白激酶相互作用阻滯凋亡信號(hào)通路[29]。蛋白免疫印跡發(fā)現(xiàn),經(jīng)PCPS處理后,HepG2細(xì)胞中Survivin蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào),提示PCPS可能通過(guò)下調(diào)Survivin蛋白的表達(dá),從而誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的凋亡。此外,細(xì)胞偽足可促進(jìn)細(xì)胞遷移、運(yùn)動(dòng),偽足減少,貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞會(huì)變圓脫落,從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[30]。本研究通過(guò)光鏡下觀察各組細(xì)胞的形態(tài)發(fā)現(xiàn),經(jīng)PCPS處理的HepG2細(xì)胞偽足減少,細(xì)胞明顯增大。細(xì)胞體積逐漸增大,會(huì)使細(xì)胞腫脹破裂,導(dǎo)致凋亡。以上結(jié)果再次提示,PCPS可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡。另外,本研究實(shí)驗(yàn)中以10 mL·kg-1、20 mL·kg-1PCPS組效果更為顯著,提示山慈菇的臨床應(yīng)用中需要注意其劑量,以保證其更好地發(fā)揮抗腫瘤作用。
綜上所述,PCPS可有效抑制HepG2細(xì)胞的增殖、侵襲能力,誘導(dǎo)凋亡,抑制其上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。