李慧，邢學勇，王一新，楊爽，趙麗，郭俊華

1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院，河南 新鄉(xiāng) 453000；2.河南大學，河南 開封 475000

過敏性哮喘（allergic asthma，AA）是以高反應及氣道炎癥為主要特征，所有年齡段均可發(fā)病，嚴重影響人們的健康［1］。目前，激素類藥物是治療輕度AA的常用藥物，短期內可改善氣喘癥狀，但對重癥及激素抵抗型AA療效并不理想，且長期使用激素有一定的安全風險［2］。研究證實，慢性炎癥反應是AA病理、生理改變的基礎，可導致氣道高反應性，引發(fā)疾病的反復發(fā)作，增加治療的難度［3］。因此，抗炎藥物逐漸成為AA的研究熱點。研究發(fā)現，中藥提取物魚藤素可不同程度抑制多種腫瘤細胞的增殖、遷移，且具有較強的抗炎作用［4-5］。但關于魚藤素對AA的抗炎作用及機制研究尚少。核轉錄因子-κB（nuclear factorκB，NF-κB）/p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 motigen-activated protein kinase，MAPK）通路可介導炎癥反應，在哮喘發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究基于NF-κB/MAPK通路研究魚藤素對AA模型大鼠的影響。

1 材料

1.1 動物SPF級雄性Wistar健康大鼠46只，6～8周齡，體質量（200±20）g，購自鄭州市惠濟區(qū)華興實驗動物養(yǎng)殖場，許可證號：SCXK（豫）2019-0002，動物倫理批準號：XXYXY-2020-032。自由進水飲食，飼養(yǎng)環(huán)境溫度維持（24±1）℃，相對濕度（55±5）%，12 h/12 h明暗交替下適應性飼養(yǎng)。

1.2 藥物與試劑魚藤素（純度＞98%，美國Sigma公司，批號：045M4736V）。卵清蛋白（ovalbumin，OVA）（美國Spectrum公司，貨號：AL125）；白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA試劑盒（武漢菲恩生物科技有限公司，貨號：EM0109）；IL-13ELISA試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司，貨號：ARB12179）；Trizol試劑（武漢純度生物科技有限公司，貨號：CD-13433-ML）；BCA蛋白定量試劑盒（美國MedChemExpress公司，貨號：HY-15908）；兔抗鼠NF-κB p65、p-NF-κB p65、細胞外信號調節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、p-ERK、p38 MAPK、p-p38 MAPK抗體（美國Abcam公司，貨號：ab207297、ab247871、ab32081、ab192591、ab218177、ab221013）。

1.3 儀器WBP型流量型整體體積描記箱、整體體積描記系統(tǒng)（美國Buxco公司）；SM2010R型切片機、EG1150分體式包埋機、DM500光學顯微鏡（德國Leica公司）；PE2400電泳儀、CheniDoc XRS全自動凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 模型建立、分組及干預46只SPF級雄性Wistar大鼠，適應性喂養(yǎng)7 d后，隨機選取8只為正常組，其余38只建立哮喘模型。造模開始第1～3天對大鼠采用腹腔注射OVA致敏液［10 mg OVA和100 mg Al（OH）3］1 mL，第8天注射1次，第15天開始行1%OVA溶液霧化激發(fā)，每次40 min，隔天1次，共6 d。大鼠出現煩躁不安、呼吸加快、抓耳、大小便失禁、紫紺等即為模型建立成功。正常組均以生理鹽水代替致敏混懸液和霧化液，其他操作相同。將造模成功的32只大鼠隨機分為模型組、魚藤素低劑量組、魚藤素中劑量組、魚藤素高劑量組，每組8只。末次霧化6 h后用魚藤素干預進行，魚藤素低、中、高 劑 量 分 別 為1 mg·kg-1、2 mg·kg-1、4 mg·kg-1，正常組與模型組均給予同體積生理鹽水腹腔注射，連續(xù)7 d。

2.2 大鼠肺功能的測定末次用藥后2 h，將大鼠置入流量型整體體積描記箱，每箱1只大鼠，分批輪流測試。大鼠可于箱中自由活動，呼吸接近自然，使大鼠在箱中適應10 min，待其安靜后采用整體體積描記系統(tǒng)記錄大鼠呼吸時箱中的壓力變化，將信號傳輸至系統(tǒng)，計算大鼠呼吸速率、吸氣峰流量、呼氣峰流量。

2.3 大鼠肺泡灌洗液（bronchoalveolarlavage fluid，BALF）中IL-1β、IL-13的測定 末次用藥6 h后，頸椎脫臼處死大鼠，逐層分離頸部皮膚，暴露氣管，取出肺，以手術線結扎右肺并將其固定；左肺經2 mL 37℃生理鹽水灌洗3次，回收BALF后（回收率＞80%），2 800 r·min-1離心15 min（離心半徑為12 cm），收集BALF上清液，用ELISA試劑盒檢測BALF中IL-1β、IL-13水平。

2.4 HE染色觀察AA模型大鼠肺組織病理變化每組隨機選擇3只大鼠，取結扎未經灌洗的右肺，用40ng·L-1多聚甲醛溶液固定48 h，流水沖洗30 min后常規(guī)乙醇脫水，石蠟包埋，以病理切片機制作成連續(xù)切片，厚度為5μm，HE染色后用顯微鏡對肺組織病理變化進行觀察。

2.5 W estern Blot法檢測大鼠肺組織NF-κB p65、p-NF-κB p65、p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK、p-ERK蛋白表達每組隨機選擇3只大鼠，取60 mg結扎未經灌洗的右肺組織，充分研磨后轉移至離心管，加入細胞裂解液于冰上裂解，12 000 g離心15 min后取上清，收集沉淀后經BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取50μg樣品與等體積上樣緩沖液充分混勻，恒定電壓下電泳，轉膜后加入封閉液，室溫下?lián)u床孵育2 h，加入稀釋一抗（1∶1 000），4℃孵育過夜，TBTS漂洗3次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶10 000），常溫孵育2 h，TBTS漂洗3次，每次10 min，暗室中顯影。采用全自動凝膠成像系統(tǒng)掃描，并分析灰度值。

2.6 統(tǒng)計學方法采用SPSS 25.0統(tǒng)計學軟件分析數據，計量資料以均值±標準差（±s）表示，多樣本計量資料以方差分析檢驗，以SNK-q檢驗分析兩兩樣本。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 大鼠的一般情況正常組大鼠毛色順滑、有光澤，呼吸情況良好；模型組大鼠毛色暗淡、豎毛，煩躁不安、呼吸局促、前肢縮抬、站立不穩(wěn)、大小便失禁、紫紺，腹式呼吸且節(jié)律無規(guī)則，行動遲緩，隨激發(fā)次數的增加，上述癥狀逐步加重且頻率增加；魚藤素低、中、高劑量組出現不同程度類似模型組的癥狀，但程度均有所改善。

3.2 魚藤素對大鼠肺功能的影響與正常組比較，模型組大鼠呼吸速率顯著升高（P＜0.05），吸氣峰流量、呼氣峰流量顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，魚藤素低、中、高劑量組大鼠呼吸速率顯著降低（P＜0.05），吸氣峰流量、呼氣峰流量顯著升高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠肺功能參數比較 （±s）

表1 各組大鼠肺功能參數比較 （±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05

組別 n呼吸速率/次·min-1吸氣峰流量/mL·s-1呼氣峰流量/mL·s-1 8 165.34±17.06 120.56±13.02 214.06±22.37模型組 8 205.67±19.33* 77.53±8.04* 96.65±9.81*魚藤素低劑量組8 194.80±20.17＃ 88.10±8.91＃ 108.72±11.16＃魚藤素中劑量組8 188.75±19.14＃ 97.33±9.87＃ 124.97±13.08＃魚藤素高劑量組8 172.35±18.92＃108.21±11.43＃ 156.67±17.02正常組＃

3.3 魚藤素對大鼠BALF中IL-1β、IL-13水平的影響與正常組比較，模型組大鼠BALF中IL-1β、IL-13水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，魚藤素低、中、高劑量組大鼠BALF中IL-1β、IL-13水平顯著降低（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠BALF中IL-1β、IL-13水平比較 （±s，ng·L-1）

表2 各組大鼠BALF中IL-1β、IL-13水平比較 （±s，ng·L-1）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05

組別 n IL-1β IL-13正常組8 502.31±48.62 18.56±2.01模型組 8 6 539.37±754.76* 96.32±9.87*魚藤素低劑量組 8 4 127.94±450.27＃ 70.26±7.69＃魚藤素中劑量組 8 2 926.83±302.48＃ 54.68±6.71＃魚藤素高劑量組 8 1 203.57±289.32＃ 40.97±4.20＃

3.4 魚藤素對大鼠肺組織病理變化的影響正常組大鼠肺泡組織結構較為完整，肺泡間隔正常，未觀察到炎癥浸潤；模型組大鼠可明顯觀察到肺泡結構異常，肺泡間隔中有大量炎癥浸潤，肺泡壁變??；魚藤素低、中、高劑量組大鼠肺泡間隔中炎癥浸潤減輕，其中魚藤素高劑量組減輕最為明顯。見圖1。

圖1 大鼠肺組織病理變化（HE染色，×200）

3.5 魚藤素對大鼠肺組織蛋白表達的影響與正常組比較，模型組大鼠肺組織p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK/ERK水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，魚藤素低、中、高劑量組大鼠肺組織p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK/ERK水平顯著降低（P＜0.05）。見表3、圖2。

圖2 大鼠肺組織相關蛋白免疫印跡圖

表3 各組大鼠肺組織p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-p38 M APK/p38 MAPK、p-ERK/ERK水平比較 （±s）

表3 各組大鼠肺組織p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-p38 M APK/p38 MAPK、p-ERK/ERK水平比較 （±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05

組別 n p-NF-κB p65/NF-κBp65 p-p38MAPK/p38MAPK p-ERK/ERK 3 0.25±0.03 0.19±0.02 0.32±0.03模型組 3 0.73±0.08* 0.65±0.06* 0.79±0.08*魚藤素低劑量組3 0.54±0.06＃ 0.58±0.05＃ 0.66±0.07＃魚藤素中劑量組3 0.49±0.05＃ 0.44±0.04＃ 0.42±0.05＃魚藤素高劑量組3 0.36±0.04＃ 0.31±0.03＃ 0.38±0.04正常組＃

4 討論

AA病因復雜，過敏性體質、空氣污染、職業(yè)接觸、家族遺傳史等均為該病發(fā)生的危險因素［6-8］。臨床研究認為，AA的發(fā)病機制與嗜酸性粒細胞氣道浸潤、淋巴細胞亞群失衡、肺泡巨噬細胞功能失常、細胞因子與免疫球蛋白水平異常升高等有關［9-10］。吸入性糖皮質激素是AA常用治療藥物，可有效控制部分患者急性癥狀，但長期用藥可能導致骨代謝異常、生長抑制等不良反應［11-12］。故探尋有效抑制氣道炎癥反應的藥物，是促進AA轉歸、改善預后的關鍵。

研究發(fā)現，NF-κB/MAPK信號通路被過度激活，在AA的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用［13-14］。正常生理狀態(tài)下，NF-κB以非活性物質的形式存在于細胞質中，當機體應激狀態(tài)下其抑制物IκB磷酸化后，對NF-κB的抑制作用消失，NF-κB被激活，磷酸化后的NF-κB可轉至細胞核中促使基因轉錄，從而上調炎癥因子水平，加劇炎癥反應［15-16］。MAPK通路在炎癥反應中同樣扮演著重要角色，其中包括p38 MAPK、ERK介導的級聯(lián)反應，該通路被激活后將促使炎癥因子的分泌量增加，從而加劇炎癥反應［17-19］。研究證實，與正常組大鼠比較，哮喘模型大鼠MAPK通路活性顯著增強［20］。本研究結果顯示，魚藤素低、中、高劑量組p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK/ERK水平均低于模型組，且呈劑量依賴性。提示魚藤素可能通過抑制NF-κB/MAPK信號通路發(fā)揮抗AA作用。

IL-1β來源于樹突狀細胞、中性粒細胞及巨噬細胞，可上調黏蛋白5ac表達，促使黏液分泌，導致氣道重塑加?。?1-22］。IL-13為炎癥因子級聯(lián)反應中始動因子，與對應受體結合后，可導致肺泡間彈力纖維斷裂，造成胸膜增厚、黏液增加，參與AA進程。本研究結果顯示，正常組大鼠未觀察到炎癥細胞浸潤，模型組大鼠肺泡結構異常，可觀察到大量炎癥細胞浸潤，魚藤素低、中、高劑量組上述變化均顯著改善，其中高劑量組減輕最為明顯，提示魚藤素可減輕AA模型大鼠肺組織病理改變；魚藤素低、中、高劑量組大鼠的呼吸速率及BALF中IL-1β、IL-13水平降低，吸氣峰流量、呼氣峰流量上升，提示魚藤素可改善大鼠的肺功能，降低BALF中炎癥因子水平，且呈劑量依賴性。魚藤素是一種魚藤酮類化合物，提取自魚藤屬、灰葉屬植物，具有抗腫瘤、抑制血管生成的功效，且對周圍正常細胞影響甚微，廣泛應用于癌癥、血管性疾病的治療［23-25］。有報道顯示，魚藤素具有顯著的抗炎作用，可通過抑制促炎因子釋放等減輕炎癥反應［26-28］。本研究采用魚藤素干預AA模型大鼠后，BALF中IL-1β、IL-13水平顯著降低，且可減輕肺組織病理變化，與張培［29］的研究結果基本一致，進一步證實魚藤素在AA中的抗炎作用。

綜上所述，魚藤素可改善AA大鼠的肺功能，緩解氣道炎癥，減輕肺組織病理變化，作用機制可能與抑制NF-κB/MAPK信號通路有關。