徐志龍，尹雅潔，夏 險(xiǎn)，梁運(yùn)祥，趙述淼，胡遠(yuǎn)亮*

(1. 湖北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，食用野生植物保育與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黃石 435002；2. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070)

角蛋白是一種硬質(zhì)蛋白，在羊毛、羽毛和指甲等物質(zhì)中含量豐富[1]，比如在禽類羽毛中粗蛋白的含量高達(dá)90%，其中主要為角蛋白[2]。這些物質(zhì)通常是農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物，無(wú)害化處理需要大量的資金投入。若有適宜的方法水解利用這些廢棄蛋白資源，以代替畜禽日糧中價(jià)格昂貴的動(dòng)物性蛋白原料，如魚(yú)粉或肉粉等，將產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益[3-5]。

角蛋白分子內(nèi)和分子間存在大量的二硫鍵，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，能抵抗大多數(shù)常見(jiàn)蛋白水解酶，如胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的降解作用[6]。采用傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法，高溫、高壓、強(qiáng)酸及強(qiáng)堿，不僅浪費(fèi)大量的能源，增加環(huán)境負(fù)擔(dān)，而且破壞氨基酸的生物學(xué)活性，大大降低了羽毛蛋白質(zhì)資源的利用效率。

因此，篩選高效角蛋白降解菌，研究其所產(chǎn)角蛋白酶的性質(zhì)，對(duì)羽毛粉資源化利用具有重要意義。本研究以羽毛粉為唯一碳氮源，從土壤環(huán)境中篩選高產(chǎn)角蛋白酶菌株，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，為利用微生物發(fā)酵技術(shù)開(kāi)發(fā)羽毛角蛋白飼料資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品

從富含羽毛質(zhì)的環(huán)境中采集土壤樣品，3份樣品分別采自江西省宜春市張巷鎮(zhèn)、湖北省武漢市某家禽廠和咸寧市某家禽廠。

1.2 培養(yǎng)基

Luria-Bertani (LB)培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g?L-1，酵母提取物5 g?L-1，氯化鈉10 g?L-1，pH 7.5，121 ℃滅菌、30 min。

羽毛粉培養(yǎng)基：羽毛粉10 g?L-1，K2HPO40.5 g?L-1，KH2PO41.2 g?L-1，NaCl 0.5 g?L-1，MgSO40.1 g?L-1，CaCl20.2 g?L-1，pH 7.5，121 ℃滅菌、30 min[7]。

1.3 初篩和復(fù)篩

稱取10 g土壤樣品，加入到90 mL的無(wú)菌水中，混合均勻并進(jìn)行梯度稀釋，然后涂布在羽毛粉平板上初篩培養(yǎng)，37 ℃、36 h。挑取生長(zhǎng)良好的單菌落，在LB平板上進(jìn)行分離純化，純化的單菌落繼續(xù)接種至羽毛粉平板上驗(yàn)證培養(yǎng)，37 ℃、48 h，挑取生長(zhǎng)情況良好的菌落保藏，同時(shí)按1.4方法所述測(cè)定角蛋白酶活力進(jìn)行復(fù)篩。

1.4 角蛋白酶活力測(cè)定

將菌株接種至LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、180 r?min-1培養(yǎng)24 h，取2 mL培養(yǎng)液接種至羽毛粉液體培養(yǎng)基，37 ℃、180 r?min-1培養(yǎng)36 h，離心8 500 r?min-1、5 min，取上清液1 mL，50 mmol?L-1的Tris-HCl緩沖液2 mL、羽毛粉50 mg，混勻，37 ℃水浴10 min，加入10%三氯乙酸2 mL作用15 min以終止反應(yīng)。將終止反應(yīng)液離心，10 000 r?min-1、5 min，取上清液于280 nm測(cè)定光吸收值。對(duì)照組首先加入10%三氯乙酸溶液2 mL抑制酶活性，然后加入上清液1 mL，其他條件保持一致[8-9]。酶活力單位定義：在該反應(yīng)條件下，使穩(wěn)定后280 nm光吸收值，每分鐘增加0.01所需的酶量為1個(gè)單位[8-9]。計(jì)算公式如下：U=5n×ΔA280/(0.01×10)

式中：U為樣品角蛋白酶活力（U?mL-1），5為終反應(yīng)體積（mL），n為樣品稀釋倍數(shù)，ΔA280為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的光吸收值的差值，10為反應(yīng)時(shí)間（min）。

1.5 菌株鑒定

將復(fù)篩獲取的高產(chǎn)角蛋白酶菌株，在羽毛粉平板上劃線培養(yǎng)，37 ℃，36 h。挑選單菌落，采用菌落PCR法，以通用引物27F/1492R擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因進(jìn)行鑒定，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性94 ℃，4 min；變性94 ℃，1 min，退火50 ℃，40 s，延伸72 ℃，45 s，循環(huán)30次；終延伸72 ℃，10 min[10]。將PCR產(chǎn)物純化后送檢測(cè)序，利用Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行DNA序列BLAST，采用軟件MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.6 酶學(xué)性質(zhì)研究

pH值。分別配制不同pH值的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（0.2 mol?L-1，pH 4.0～7.0）、Tris-HCl緩沖液（0.1 mol?L-1, pH 7.5～8.0）和甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（0.1 mol?L-1，pH 9.0～10.0），測(cè)定不同pH值條件下角蛋白酶活力，研究pH值對(duì)酶活力的影響。用pH 4.0～10.0緩沖液，以1∶1稀釋酶液，4℃處理1 h，最適pH條件下測(cè)定角蛋白酶活力，以未處理組的酶活力為100%，研究該酶的pH穩(wěn)定性。

溫度。保持其他條件不變，分別于不同溫度條件下（30～65 ℃），測(cè)定角蛋白酶活力，研究溫度對(duì)酶活性的影響。酶液分別于60 ℃和80 ℃下處理1 h、2 h、4 h和8 h，最適條件下測(cè)定酶活力，以未處理組的酶活力為100%，研究該酶的溫度穩(wěn)定性。

離子和EDTA對(duì)角蛋白酶活力的影響。以終濃度5 mmol?L-1分別向反應(yīng)體系中加入不同的離子（NH42+、Ba2+、Co2+、Mn2+、Ca2+、Cu2+、Mg2+）或EDTA溶液，最適條件37 ℃，pH 7.5條件下測(cè)定酶活力，以蒸餾水為對(duì)照同時(shí)實(shí)驗(yàn)，計(jì)算相對(duì)酶活力。

表面活性劑、氧化劑和有機(jī)溶劑對(duì)酶活力的影響。反應(yīng)體系以終濃度1%或5%的分別添加SDS，吐溫80，H2O2；以終濃度1%分別添加甲醇、乙醇、二甲苯、異丙醇、異戊醇和甲醛，最適條件37 ℃，pH 7.5條件下測(cè)定酶活力，以蒸餾水為對(duì)照，分別計(jì)算相對(duì)酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選

通過(guò)對(duì)3份土壤樣品進(jìn)行初篩，挑選生長(zhǎng)良好的菌落進(jìn)行分離純化、保藏并測(cè)定角蛋白酶活力復(fù)篩（表1），結(jié)果表明編號(hào)KS12的菌株產(chǎn)角蛋白酶活力最高，達(dá)46.89 U?mL-1，選擇該菌株進(jìn)行鑒定并研究其角蛋白酶性質(zhì)。

表1 測(cè)定角蛋白酶活力復(fù)篩結(jié)果Table 1 Result of keratinase activity

2.2 菌株鑒定

如圖1A所示，LB平板上菌株KS12的菌落形態(tài)為半透明狀，無(wú)反光，中間凹陷，邊緣較厚，光滑且無(wú)規(guī)則。革蘭氏染色鏡檢表明，菌體呈單個(gè)或鏈狀排列，著色均勻，無(wú)莢膜，桿狀，部分已產(chǎn)生孢子，初步認(rèn)定為革蘭氏陽(yáng)性芽孢桿菌（圖1）。

圖1 KS12菌落形態(tài)和顯微形態(tài)Figure 1 Colony morphologies and microscopic of strain KS12 on LB plate and feather powder plate

擴(kuò)增16S rRNA鑒定表明，KS12菌株與Bacillus subtilisM015（KP192484.1）同源性最高，序列相似度為100%，且KS12菌株在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上進(jìn)化距離與B. subtilis親緣關(guān)系最近（圖2）。因此，命名為B. subtilisKS12。

圖2 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Figure 2 Phylogenetic tree of strain KS12 based on 16S rRNA

2.3 酶學(xué)性質(zhì)研究

2.3.1 pH、溫度對(duì)角蛋白酶活力和穩(wěn)定性影響 如圖3（a）所示，B. subtilisKS12產(chǎn)角蛋白酶在堿性環(huán)境中保持較高活力，最適pH值7.5；使用不同pH緩沖液處理1 h表明，該酶pH 8.0和9.0條件下，相對(duì)酶活力分別為97.2%和95.7%，見(jiàn)圖3（b）。當(dāng)pH＜4.0或＞9.0時(shí)，其穩(wěn)定性快速下降，相對(duì)酶活力低于50%。

圖3 pH和溫度對(duì)角蛋白酶活力和穩(wěn)定性的影響Figure 3 Effect of pH and temperature on activity and stability of the keratinase

研究發(fā)現(xiàn)，該酶最適反應(yīng)溫度37 ℃，當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)，相對(duì)酶活力49.3%，達(dá)到45 ℃時(shí)，相對(duì)酶活力46.8%，見(jiàn)圖3（c）。該酶于60 ℃，80 ℃水浴1 h，酶活力分別為61.4%，59.5%。隨著保溫時(shí)間的延長(zhǎng)，角蛋白酶活力迅速下降，2 h酶活力不足5%，見(jiàn)圖3（d）。這些結(jié)果說(shuō)明，B. subtilisKS12產(chǎn)角蛋白酶對(duì)溫度較為敏感。

2.3.2 不同離子對(duì)角蛋白酶活性的影響 如圖4所示，5 mmol?L-1的Ca2+、Mg2+對(duì)B. subtilisKS12角蛋白酶活力有促進(jìn)作用，其中Mg2+對(duì)角蛋白酶促進(jìn)作用較強(qiáng)，相對(duì)酶活力達(dá)159%。EDTA則對(duì)酶活力基本沒(méi)有影響，但Cu2+對(duì)角蛋白酶活力產(chǎn)生較強(qiáng)的抑制作用，相對(duì)酶活力僅有3.7%。

圖4 金屬離子對(duì)角蛋白酶活性的影響Figure 4 Effect of metal irons on keratinase activity

2.3.3 表面活性劑和氧化劑對(duì)角蛋白酶活性的影響由表2可知，SDS和H2O2抑制角蛋白酶活性。低濃度1%的吐溫80對(duì)角蛋白酶激活作用不明顯，但濃度為5%時(shí)，具有激活作用，相對(duì)酶活力達(dá)140.4%。

表2 表面活性劑和氧化劑對(duì)角蛋白酶活性的影響Table 2 Effect of various surfactants and oxidizer on keratinase activity

2.3.4 有機(jī)溶劑對(duì)角蛋白酶活性的影響 體系中以1%加入不同有機(jī)溶劑，發(fā)現(xiàn)角蛋白酶活力均受到抑制，說(shuō)明該酶對(duì)有機(jī)溶劑的耐受性較差，其中，二甲苯的抑制效果最為明顯，相對(duì)酶活力僅有34.1%（表3）。

表3 有機(jī)溶劑對(duì)角蛋白酶活性的影響Table 3 Effect of various organic solvent on keratinase activity

3 討論與結(jié)論

以羽毛粉作為唯一的碳、氮源，篩選得到1株角蛋白酶產(chǎn)生菌，經(jīng)鑒定并命名為B. subtilisKS12。芽孢桿菌被認(rèn)為是極具潛力的角蛋白酶產(chǎn)生菌，研究表明Brevibacillus brevisUS575菌株所產(chǎn)的胞外角蛋白酶KERUS相比NUE 12 MG和KOROPON MK EG角蛋白酶具有更高的水解作用、底物特異性和催化活性，能夠獨(dú)立完成全部的羽毛降解[11]；來(lái)自B. tequilensisQ7的角蛋白酶KERQ7相比一些商業(yè)酶也具有更強(qiáng)大的角蛋白降解能力[12]。質(zhì)譜分析KERUS單體分子量為29.1 KD，KERQ7為28.4 KD，兩種酶都能夠被PMSF和DFP完全抑制，表明屬于絲氨酸蛋白酶家族[11]。

角蛋白酶的理化性質(zhì)根據(jù)微生物的來(lái)源有所不同，大多數(shù)最適pH范圍7.0～9.5，最適作用溫度40～70℃[13-15]。來(lái)源于Purpureocillium lilacinumLPS#876的角蛋白酶在pH 4.0～9.0，37℃保溫1 h，相對(duì)酶活力92%以上，65℃保溫50 min，仍保持15%的相對(duì)酶活性[16]。少數(shù)角蛋白酶可以在極堿和更高溫度下保持較高酶活性，比如來(lái)源于細(xì)菌Streptomyces的角蛋白酶，其最適作用pH和溫度分別為11.5和75℃[17]。本研究中B. subtilisKS12酶學(xué)性質(zhì)與多數(shù)角蛋白酶相似，在37℃和pH 7.5～9.0的堿性條件下較穩(wěn)定。

金屬離子Ca2+和Mg2+對(duì)B. subtilisKS12角蛋白酶活性有一定的促進(jìn)作用，但重金屬Co2+、Mn2+和Cu2+抑制角蛋白酶活性，通常Co2+[18]、Cu2+[19]和Hg2+[11,20]會(huì)不同程度的抑制角蛋白酶活性。螯合劑EDTA對(duì)B. subtilisKS12角蛋白酶的影響小，但對(duì)Bacillus thuringiensisAD-12分泌的角蛋白酶BtKER產(chǎn)生抑制作用[21]，該菌分泌的角蛋白酶與金屬相關(guān)，因此，添加EDTA使其活性受到影響。

角蛋白酶活性受到表面活性劑SDS、氧化劑H2O2和有機(jī)溶劑不同程度的抑制。1%吐溫80對(duì)B.subtilisKS12角蛋白酶無(wú)激活作用，但高濃度5% 吐溫80提高角蛋白酶活性。研究結(jié)果與鏈霉菌分泌的角蛋白酶性質(zhì)相似，當(dāng)吐溫80濃度為0.1%時(shí)，相對(duì)酶活力僅98%，但濃度為0.5%時(shí)，相對(duì)酶活力達(dá)到109%[21]。此外，有機(jī)溶劑的存在，均對(duì)該角蛋白酶產(chǎn)生抑制作用。

由于角蛋白性質(zhì)堅(jiān)硬，在環(huán)境中難被降解，因此，從自然界中很難篩選到可以高效分解羽毛角蛋白的微生物。以自然界中篩選的降解微生物為基礎(chǔ)，構(gòu)建基因工程菌，提高角蛋白酶在菌體中的表達(dá)量，其應(yīng)用前景將更為廣闊。