周 力，李蔣偉，張瑩瑩，張懷霞，馬博妍，高占紅，吳占月，侯生珍，王志有，桂林生

(青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧810016)

作為青藏高原及其毗鄰地區(qū)的特有物種，藏羊?qū)Ω吆０蔚貐^(qū)少氧、嚴(yán)寒和牧草匱乏等特殊惡劣環(huán)境具有良好的適應(yīng)力，是高原畜牧業(yè)最為珍貴的種質(zhì)資源[1]。長期以來，不僅為牧區(qū)人民提供生產(chǎn)及生活的必需品如肉、骨和毛等，同時(shí)也是青海省畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)的主要支柱之一[2]。由于青藏高原平均海拔4 000 m以上，嚴(yán)酷的自然環(huán)境和氣候條件導(dǎo)致牧草生長期較短，枯草期長達(dá)9個(gè)月之久，而藏母羊妊娠后期正值枯草季節(jié)。由于枯草季節(jié)牧草中粗蛋白和脂肪含量只占青草季節(jié)的68.9 %和34.4%[3]，長期的營養(yǎng)攝入不足不僅影響妊娠期母羊分娩機(jī)能和產(chǎn)后恢復(fù)，同時(shí)還限制胎兒的正常生長發(fā)育。

作為反芻動(dòng)物最復(fù)雜的生物體系之一，瘤胃微生物群落具有大量的基因資源。飼糧結(jié)構(gòu)、宿主遺傳和飼養(yǎng)管理等因素均能對(duì)微生物的內(nèi)環(huán)境產(chǎn)生明顯的影響[4]。飼糧作為微生物發(fā)酵的底物，其性質(zhì)和組成直接影響微生物的定植過程。董春曉等[5]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相較于葵花籽殼組日糧和油菜秸稈組日糧,玉米秸稈組和玉米芯組日糧不僅可以確保育肥湖羊的生產(chǎn)性能, 并且有利于纖維分解菌的生存, 可促進(jìn)纖維素在瘤胃中的降解。在羔羊上的研究發(fā)現(xiàn)，增加高谷物飼料的比例，能夠顯著降低瘤胃微生物群落的豐富度和多樣性[6]。其他研究也指出在飼糧中添加植物油[7]、抗生素[8]、微生態(tài)制劑[9]以及維生素[10]等均能明顯的影響瘤胃細(xì)菌結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到調(diào)控瘤胃發(fā)酵模式的目的。目前，關(guān)于冬季補(bǔ)飼對(duì)藏羊瘤胃微生物多樣性的研究鮮有相關(guān)報(bào)道?；诖耍狙芯客ㄟ^16 S rDNA高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)定妊娠后期藏羊瘤胃微生物群落結(jié)構(gòu)及功能的多樣性，從微生物角度闡述冬季補(bǔ)飼對(duì)藏母羊瘤胃揮發(fā)性脂肪酸、微生物菌群及羔羊生長發(fā)育的影響，為促進(jìn)藏羊生產(chǎn)力提供理論依據(jù)和技術(shù)途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及地點(diǎn)

選擇年齡（3歲）、胎次（2胎）及體重（45.67±3.12 kg）相近的健康妊娠期藏羊440只，隨機(jī)分為處理組（test，T）和對(duì)照組（control check，CK），每組220只。試驗(yàn)時(shí)間為2018年12月—2019年1月。養(yǎng)殖地點(diǎn)位于青海省海南州同德縣河北鄉(xiāng)夏知邁村。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)?zāi)秆蛲诎l(fā)情，集中配種。妊娠前期（配種后0～105 d），所有母羊均為放牧飼養(yǎng)；妊娠后期（配種后106～150 d），處理組母羊在放牧基礎(chǔ)上，歸牧后每只母羊補(bǔ)飼0.1 kg·d-1精料補(bǔ)充料。對(duì)照組歸牧進(jìn)入圈舍后不接受補(bǔ)飼。所有試驗(yàn)羊放牧草場(chǎng)條件一致，自由飲水，歸牧?xí)r間為每天19:30。藏羊未有現(xiàn)行飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，參考中國肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T 816-2004）[11]進(jìn)行日糧配制?；A(chǔ)日糧組成和營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成和營養(yǎng)水平表（干物質(zhì)基礎(chǔ)）Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets（DM basis）

1.3 樣品采集

試驗(yàn)結(jié)束后，從試驗(yàn)組和對(duì)照組中隨機(jī)選擇 5只和 6 只母羊頸靜脈放血屠宰后，采集瘤胃內(nèi)容物于無菌離心管中，3 500 r·min-1離心 15 min，取上層液體混勻后通過4層紗布過濾，將濾液分為2份，一份裝于5 mL凍存管中，用于測(cè)定瘤胃細(xì)菌多樣性；另一份用于測(cè)定瘤胃液揮發(fā)性脂肪酸（VFA）含量。同時(shí)，每組隨機(jī)選擇100只新生羔羊，測(cè)定其體重、體高、體長、胸圍及尻寬等生長發(fā)育指標(biāo)。

1.4 瘤胃液VFA含量測(cè)定

參考Liang等[12]方法進(jìn)行，利用氣相色譜儀（Thermo Scientific，美國）測(cè)定瘤胃液揮發(fā)性脂肪酸的含量。

1.5 16 S rRNA PCR擴(kuò)增

采用 E.Z.N.A.?stool DNA Kit（Omega Bio-tek,Norcross, GA, USA）試劑盒提取瘤胃液DNA。所提取的DNA質(zhì)量及濃度通過Nanodrop 1000 spectrophotometer （Thermo Scientific，Wilmington，USA）進(jìn)行檢測(cè)。利用 Illumina HiSeq 2500 PE250 平臺(tái)檢測(cè)微生物V3+V4可變區(qū)多樣性，分析瘤胃微生物多樣性及不同水平豐度。PCR擴(kuò)增上游引物為：5′-CCTAC GGGNGGCWGCAG，下游引物為5′-GGACTACHVG GGTATCTAAT。具體反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 2 min后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，依次為 95 ℃ 2 min和72 ℃ 30 s，然后72 ℃延長 5 min。本試驗(yàn)中，將高度相似性的序列(97%)歸為1個(gè)操作分類單位（Operational taxonomic units，OTU），測(cè)序數(shù)據(jù)采用UPARSE 軟件進(jìn)行OTUs聚類分析，相關(guān)圖表采用R語言數(shù)據(jù)包進(jìn)行繪制。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2013對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，利用SPSS 15.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），T檢驗(yàn)法比較2組數(shù)據(jù)的差異顯著性，所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 冬季補(bǔ)飼對(duì)新生羔羊生長發(fā)育的影響

由圖1可見，冬季補(bǔ)飼能夠顯著影響新生羔羊的體重、體高和胸圍。處理組羔羊的體重、體高和胸圍分別比對(duì)照組羔羊高出29.07 %、11.82 %和12.69 %，差異顯著（P＜ 0.05）。體長和尻寬差異不顯著（P＞ 0.05）。

圖1 冬季補(bǔ)飼對(duì)新生羔羊生長發(fā)育的影響Figure 1 Effect of dietary supplements on growth traits of lamb during the cold season

2.2 冬季補(bǔ)飼對(duì)妊娠后期藏母羊瘤胃液揮發(fā)性脂肪酸含量的影響

由表2可見，處理組瘤胃液總揮發(fā)性脂肪酸（TVFA）、丙酸和丁酸含量顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)；同時(shí)乙酸和異丁酸顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。

表2 冬季補(bǔ)飼對(duì)妊娠后期藏母羊瘤胃液揮發(fā)性脂肪酸含量的影響Table 2 Effect of supplemental feeding in winter on volatile fatty acid content in rumen fluid of Tibetan ewes during late pregnancy

2.3 測(cè)序結(jié)果

本試驗(yàn)中，11份瘤胃液樣本中總共獲得原始序列1 252 166條，其中有效序列1 155 747條，序列度蓋度為92.30 %。相似度大于97 %的有效序列聚類為3418個(gè)OTU，其中2194個(gè)OTU為2組母羊共有，637個(gè)OTU為對(duì)照組獨(dú)有，587個(gè)OTU為處理組獨(dú)有。

2.4 冬季補(bǔ)飼對(duì)妊娠后期母羊瘤胃微生物Alpha多樣性的影響

應(yīng)用Wilcoxon法對(duì)Alpha多樣性中Chao1、Ace、Shannon和Simpson等指數(shù)進(jìn)行分析（表3），結(jié)果顯示，與處理組相比，對(duì)照組的Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)分別顯著（P＜ 0.05）。Chao1 指數(shù)和Ace 指數(shù)方面，兩組間差異不顯著（P＞ 0.05）。

表3 瘤胃微生物Alpha多樣性指數(shù)Table 3 Alpha diversity indexes of rumen microbiota

2.5 冬季補(bǔ)飼對(duì)妊娠后期母羊瘤胃微生物Beta多樣性的影響

基于Unifrac算法在OTU水平上對(duì)瘤胃微生物進(jìn)行principal co-ordinates analysis （PCoA），圖3（a）結(jié)果顯示，2組藏羊聚類明顯，說明冬季補(bǔ)飼對(duì)藏羊瘤胃微生物區(qū)系存在具有顯著的影響。此外，為更好地反映數(shù)據(jù)的非線性結(jié)構(gòu)，對(duì)2組藏羊樣本進(jìn)行nonmetric multidimensional scaling（NMDS）分析，結(jié)果進(jìn)一步佐證了兩組藏羊瘤胃微生物區(qū)系差異明顯（圖3（b））。

圖3 Beta多樣性分析Figure 3 Analysis of Beta diversity

2.6 冬季補(bǔ)飼對(duì)妊娠后期母羊瘤胃微生物相對(duì)豐度的影響

門水平上，擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）以及疣微菌門（Verrucomicrobia）相對(duì)豐度較高，2組和分別占細(xì)菌總量的55.80 %、16.56 %及14.75 %，為優(yōu)勢(shì)菌門（表4）。通過對(duì)比排名前10菌門的差異發(fā)現(xiàn)，2組的3個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門差異并不顯著（P＞ 0.05），但處理組的藍(lán)藻菌門（Cyanobacteria）的豐度僅為0.98 %，比對(duì)照組低1.04 %（P＜ 0.05）。

表4 門水平上瘤胃細(xì)菌組成分析Table 4 Composition analysis of rumen bacteria at phylum level

屬水平上，普雷沃菌屬-1（Prevotella-1）、理研菌科RC9腸道群（Rikenellaceae-RC9-gut-group）和普雷沃氏菌科-UCG-001（Prevotellaceae-UCG-001）為藏羊的瘤胃微生物優(yōu)勢(shì)菌屬（表5）。通過對(duì)比排名前10菌門的差異發(fā)現(xiàn)，兩組的3個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門差異并不顯著（P＞ 0.05）。

表5 屬水平上瘤胃細(xì)菌組成分析Table 5 Composition analysis of rumen bacteria at genus level

2.7 功能預(yù)測(cè)

利用Tax4Fun軟件進(jìn)行KEGG Pathway的功能性注釋，結(jié)果如圖4所示，2組妊娠期藏母羊瘤胃微生物主要富集于復(fù)制和修復(fù)（replication and repair）、碳水化合物代謝（carbohydrate metabolism）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（signal transduction）、氨基酸代謝（amino acid metabolism）、輔因子和維生素代謝（metabolism of cofactors and vitamins）、核苷酸代謝（nucleotide metabolism）和能量代謝(energy metabolism)等功能通路。

圖4 KEGG注釋分布圖Figure 4 Distribution graph of KEGG annotation

3 討論與結(jié)論

3.1 冬季補(bǔ)飼對(duì)新生羔羊生長發(fā)育的影響

青藏高原惡劣的氣候環(huán)境以及由于懷胎造成瘤胃擠壓使得妊娠藏母羊營養(yǎng)長期攝入不足，造成產(chǎn)后癱瘓、生產(chǎn)弱羔或死羔現(xiàn)象頻發(fā)。因此，科學(xué)補(bǔ)飼是維持妊娠藏母羊自身和胎兒發(fā)育必不可少的生產(chǎn)環(huán)節(jié)。董凌云等[13]研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)飼顆粒飼料能夠促進(jìn)妊娠母羊的采食量、消化量和氮保留量，同時(shí)增加新生羔羊體重。此外，李聯(lián)萍等[14]同樣證實(shí)，妊娠母羊產(chǎn)羔前一個(gè)月補(bǔ)飼精料補(bǔ)充料能夠提高羔羊存活率。本研究中，妊娠后期藏母羊補(bǔ)飼精料后，不僅能夠提高新生羔羊的初始體重，同時(shí)還顯著增加其體高和胸圍指標(biāo)，這與上述研究結(jié)果基本一致。推測(cè)可能存在2方面原因，首先補(bǔ)充精料可促進(jìn)母羊血液中g(shù)rowth hormone（GH）、insulin-like growth factor-1（IGF-1）和insulin-like growth factor-1（IGF-2）濃度，而這些因子一定程度能通過刺激上皮細(xì)胞DNA合成，促進(jìn)瘤胃上皮乳頭發(fā)育，進(jìn)而維持瘤胃功能[15]。其次，補(bǔ)飼精料為母羊提供了更為充足的碳源和氮源，促進(jìn)瘤胃微生物的繁殖，維持瘤胃的正常功能[16]。故妊娠母羊營養(yǎng)的攝入充分能夠最大程度上維持并促進(jìn)羔羊的生長發(fā)育。

3.2 冬季補(bǔ)飼對(duì)妊娠后期藏母羊瘤胃液揮發(fā)性脂肪酸含量的影響

反芻動(dòng)物瘤胃的發(fā)育狀況與其發(fā)酵功能密切相關(guān)，瘤胃內(nèi)微生物能夠在厭氧條件下產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸（包括乙酸、丙酸、丁酸和戊酸等）和菌體蛋白，為機(jī)體提供能量和營養(yǎng)物質(zhì)[17]。靳繼鵬等[18]認(rèn)為，高山細(xì)毛羊瘤胃乙酸/丙酸隨著補(bǔ)飼料中粗料的增加呈現(xiàn)升高態(tài)勢(shì)。劉敏雄[19]曾報(bào)道, 當(dāng)粗飼料含量增高時(shí), 纖維素分解菌占優(yōu)勢(shì), 乙酸含量上升,而飼糧中淀粉含量高時(shí), 分解淀粉的微生物占優(yōu)勢(shì),丙酸含量顯明顯增多。Serment等[20]研究指出，在日糧維持需要的基礎(chǔ)上再提高20%的能量, 能明顯降低乙酸的含量，總VFA濃度會(huì)隨精料比例的增加而上升, 乙酸/丙酸則下降。本試驗(yàn)中，對(duì)照組瘤胃液總揮發(fā)性脂肪酸（TVFA）、丙酸和丁酸含量顯著低于處理組；同時(shí)乙酸和異丁酸顯著高于處理組，這與上述研究結(jié)論相似。

3.3 冬季補(bǔ)飼對(duì)妊娠后期藏母羊瘤胃微生物菌落結(jié)構(gòu)的影響

本試驗(yàn)通過多樣性分析發(fā)現(xiàn)對(duì)照組的Shannon和Simpson指數(shù)分別顯著高于和低于處理組，說明對(duì)照組瘤胃微生物多樣性優(yōu)于處理組。楊碩等[21]發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)飼精料不但能夠顯著降低大青山絨山羊瘤胃細(xì)菌的OTUs 數(shù)量，同時(shí)還顯著降低細(xì)菌的多樣性。該結(jié)論與本研究相近。說明，盡管日糧中的精料可以在一定程度上能夠?yàn)榧?xì)菌提供更多的蛋白以及碳水化合物，保證細(xì)菌的生長量需求[22]。但是，伴隨著精料的增加，非結(jié)構(gòu)碳水化合物同樣會(huì)隨著增加，導(dǎo)致瘤胃產(chǎn)生乳酸和揮發(fā)性脂肪酸的大量生成，可能一定程度上降低了pH值下降，而過低的pH值不利于瘤胃中降解纖維物質(zhì)的細(xì)菌的活性。

3.4 冬季補(bǔ)飼對(duì)妊娠后期藏母羊瘤胃微生物相對(duì)豐度的影響

反芻動(dòng)物的瘤胃微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性受諸多因素影響，如營養(yǎng)、遺傳以及宿主年齡等，尤其是日糧的結(jié)構(gòu)組成、營養(yǎng)配比及飼喂方式進(jìn)能顯著影響瘤胃中微生物內(nèi)平衡[23]。本研究結(jié)果揭示，妊娠后期藏母羊瘤胃微生物優(yōu)勢(shì)菌群分別是擬桿菌門和厚壁菌門，其相對(duì)豐度分別為55.80 %和16.56 %，該結(jié)果與Liu等[24]在山羊瘤胃微生物的研究結(jié)果一致。前期，諸多研究證實(shí)，日糧的類型和組成對(duì)瘤胃中擬桿菌門具有一定程度的影響[25]。王柏輝等[26]以蘇尼特羊?yàn)檠芯繉?duì)象，發(fā)現(xiàn)日糧中亞麻籽能夠顯著提高瘤胃細(xì)菌中擬桿菌門的相對(duì)豐度。本研究發(fā)現(xiàn)，冬季補(bǔ)飼有降低瘤胃擬桿菌門的趨勢(shì)。結(jié)合擬桿菌門的功能，即通過靶向結(jié)合多糖，如纖維素、果膠以及木聚糖等，能夠?yàn)樗拗髁鑫肝⑸锾峁┐罅康奶荚?，進(jìn)而參與機(jī)體的碳水化合物代謝[27]。

3.5 冬季補(bǔ)飼對(duì)妊娠后期藏母羊瘤胃微生物KEGG通路的影響

李海琴等[28]試驗(yàn)表明，湖羊瘤胃中占比最高的功能為碳水化合物的代謝，其次為氨基酸代謝，與COG數(shù)據(jù)庫所預(yù)測(cè)的碳水化合物、轉(zhuǎn)錄和氨基酸運(yùn)輸與代謝功能一致。閆小蘭等[29]試驗(yàn)顯示，羔羊瘤胃內(nèi)菌群功能主要集中在碳水化合物代謝和氨基酸代謝。本研究進(jìn)行KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)比分析后發(fā)現(xiàn)，復(fù)制和修復(fù)（replication and repair）、碳水化合物代謝（carbohydrate metabolism）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（signal transduction）等功能基因的相對(duì)豐度在2組中較高，與上述研究結(jié)果相似。補(bǔ)飼精料能夠?yàn)榱鑫柑峁└嗟臓I養(yǎng)物質(zhì)，使得細(xì)菌主要富集于碳水化合物代謝相關(guān)通路。

妊娠后期藏母羊的冬季補(bǔ)飼能夠提高瘤胃總揮發(fā)性脂肪酸、丙酸和丁酸的含量，同時(shí)為胎兒的生長發(fā)育提供必要的營養(yǎng)需求，但本研究中精料的攝入量一定程度上影響了母羊瘤胃細(xì)菌的多樣性。因此，如何在維持胎兒營養(yǎng)需求和母羊瘤胃健康之間尋求平衡，是團(tuán)隊(duì)后期在藏羊營養(yǎng)調(diào)控方面研究的重點(diǎn)。