王林青，樊 霖，趙 宇，田潤博，崔建濤，韓昊瑩，趙 麗，陳紅英,3*

(1. 鄭州師范學院分子生物學鄭州市重點實驗室，鄭州 450044；2. 河南農業(yè)大學動物醫(yī)學院，鄭州 450002；3. 鄭州市豬重大疫病防控重點實驗室，鄭州450002；4. 河南牧業(yè)經濟學院動物醫(yī)藥學院， 鄭州 450008)

豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）是一種呈球形、無囊膜且單股閉合環(huán)狀DNA病毒，屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，為目前已知的最小的動物病毒[1]。在全球范圍的豬群中，迄今發(fā)現(xiàn)PCV有3個血清型：豬圓環(huán)病毒1型、2型和3型（PCV1、PCV2和PCV3）。PCV1于1974年首次被發(fā)現(xiàn)存在于豬腎細胞PK-15中，但不產生細胞病變[2]，且對豬無致病性[3]。而PCV2于1997年首次被報道，能夠引起豬發(fā)生包括仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）、豬皮炎與腎病綜合征（PDNS）和繁殖障礙等豬圓環(huán)病毒相關疾?。≒CVAD）[4-6]，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經濟損失。

2016年，美國Palinski等[7]和Phan等[8]分別從患有PDNS、繁殖障礙的母豬和關節(jié)腫脹和消瘦等疾病的母豬或仔豬檢測到PCV3。PCV3基因組為2 000個堿基，與PCV2相似，含有2個主要的開放閱讀框（ORF1和ORF2），分別編碼rep和cap蛋白。PCV2和PCV3臨床表現(xiàn)相似且難以區(qū)分，并且常以單獨或混合感染的方式感染豬[9]，使我國乃至世界養(yǎng)豬業(yè)面臨巨大的挑戰(zhàn)。因此，建立一種能同時檢測和鑒別PCV2和PCV3的方法，為提供有價值的流行病學信息以及啟動適當的預防和控制策略至關重要。

熒光定量PCR作為一種新技術，因其與普通PCR相比，具有更加快速、敏感、特異性強和自動化程度高等特點而不斷發(fā)展，并廣泛地應用于生命科學研究的各個領域。因此，本試驗根據GenBank中已發(fā)表的PCV2和PCV3基因組核苷酸序列，分別設計了2對特異性引物，在同一個PCR反應管中進行兩種病原的熒光定量檢測，旨在為同時檢測和鑒別兩種病原提供一種新方法。

1 材料與方法

1.1 病毒、菌株及臨床樣品

PCV3陽性病料由鄭州市豬重大疫病防控重點實驗室對疑似PCV3感染的病料樣品進行PCR擴增和測序而獲得，作為PCV3的陽性對照。pMD18-PCV2陽性全基因組質粒、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬藍耳病病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）以及豬細小病毒（PPV）均由鄭州市豬重大疫病防控重點實驗室保存。DH5α感受態(tài)細胞購自北京康為世紀有限公司。

66份臨床樣品（包括血清、淋巴結和脾臟等）為2017—2019年，采自河南省鄭州、原陽和許昌等7個地市豬場。臨床樣品中一部分來源于河南各地健康豬群組織，另一部分為患有腹瀉、流產死胎及圓環(huán)病毒感染相關疾病的病死豬組織。取適量組織進行研磨，于–80 ℃反復凍融3次，12 000 r·min-1離心6 min。取上清液，–80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

pMD18-T載體購自寶生物工程（大連）有限公司；2×Taq MasterMix（中國北京）購自北京康為世紀有限公司；DNA凝膠回收試劑盒、SanPrep柱式DNA和RNA小量抽提試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；ChamQ TM Universal SYBR qPCR Master Mix、Trizol和反轉錄試劑盒均購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.3 引物的設計與合成

利用DNAstar（version5.0）軟件MegAlign程序對GenBank中已發(fā)表的PCV2全基因組序列（ KT719404.1、DI434116.1和MH169117.1）進行同源性分析，應用Primer6.0引物設計軟件，基于PCV2基因組上393～665 bp高度保守區(qū)域，設計1對特異性引物PCV2-F/R（表1），針對PCV3基因組上168～305 bp保守區(qū)域并參考Xu等設計的引物[10]，兩對引物均由奧科鼎盛（武漢）生物科技有限公司合成。

表1 PCV2和PCV3檢測引物Table 1 Primers for the detection of PCV2 and PCV3

1.4 標準品模板的制備

根據SanPrep柱式DNA提取試劑盒說明書，提取PCV3、PRV和PPV的 DNA，根據Trizol說明書提取PEDV、PRRSV和CSFV總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書合成cDNA，并于–80 ℃保存?zhèn)溆?。利用PCV2和PCV3特異引物PCV2-F/R和PCV3-F/R，以pMD18-PCV2全基因組質粒以及提取的PCV3 DNA為模板，分別進行PCR擴增。反應條件為：95 ℃5 min；95 ℃ 20 s , 60 ℃ 20 s,72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)；最終72 ℃延伸10 min。反應結束后，擴增產物經3.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將膠回收試劑盒回收純化的PCR產物，克隆至pMD18-T載體中，構建重組質粒（pMD18-PCV2和pMD18-PCV3）并測序。測序正確的質粒pMD18-PCV2和pMD18-PCV3作為PCV2和PCV3的標準品, 經紫外分光光度計檢測其濃度，并根據公式：質粒濃度（ng·μL-1）× 6.022 × 1023/質粒長度× 660 × 109，換算為拷貝數/μL。

1.5 雙重熒光定量PCR反應條件優(yōu)化及標準曲線的建立

為了尋求最合適的雙重熒光定量PCR反應體系和反應條件，對退火溫度（55～65℃）、引物量以及延伸時間進行摸索。將標準品分別用去離子水作10倍系列稀釋，選取6個稀釋度（10-3～10-8）為模板，每個梯度標準品設立3個重復，用CFX96TM型熒光定量PCR儀進行熒光定量擴增。用熒光定量PCR儀的分析軟件對熒光定量擴增結果進行分析，并建立標準曲線。

1.6 特異性和敏感性試驗

采用優(yōu)化的雙重熒光定量PCR反應體系和反應條件，以PCV2、PCV3、PPV、PRV、CSFV、PEDV和PRRSV的核酸為模板，同時以去離子水為陰性對照，進行熒光定量PCR檢測。選取標準品的8個稀釋度（10-10～10-3）為模板，同時以去離子水為陰性對照, 進行熒光定量PCR（每個稀釋度作3個平行試驗），確定PCV2和PCV3的最低檢測線，同時進行常規(guī)PCR檢測，比較其敏感性。

1.7 重復性試驗

將1.5中所用樣品保存至4 ℃，每隔2周，同等條件下取3個稀釋度（如10-3、10-5和10-8）標準品為模板進行批內試驗，每個稀釋度做3個平行試驗；另對不同批次樣品按前述方法稀釋后定期進行熒光定量PCR檢測，重復進行3次檢測，分別計算其變異系數。

1.8 臨床樣品檢測

對2017—2019年河南省鄭州、原陽和許昌等地豬場的66份臨床樣品采用已建立的PCV2和PCV3雙重SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法和常規(guī)PCR方法進行檢測，比較這兩種檢測方法的檢出率，評價其臨床實用性。

2 結果與分析

2.1 標準品模板的制備結果

利用PCV2和PCV3的特異引物，以pMD18-PCV2全基因組質粒和PCV3的DNA為模板進行擴增和電泳，分別擴增出約251 bp和138 bp的特異性條帶（圖1），與預期擴增片段長度相一致。將回收純化的PCR產物克隆至載體pMD18-T中，構建重組質粒（pMD18-PCV2和pMD18-PCV3），作為標準品模板。經測序鑒定，結果顯示所克隆的PCV2和PCV3 基因序列分別為251 bp和138 bp，分別與參考序列KT719404和KX898030相應的區(qū)域同源性為100%，表明PCR擴增的產物是特異的。

圖1 PCV2/3單一及雙重PCR擴增結果Figure 1 PCV2/3 single and double PCR amplification results

2.2 雙重熒光定量PCR的優(yōu)化與標準曲線的繪制結果

經優(yōu)化雙重SYBR GreenⅠ熒光PCR的反應條件和反應體系，確定PCV2和PCV3雙重SYBR GreenⅠ實時熒光PCR反應體系為：SYBR GreenⅠPremix Ex Taq酶 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，標準陽性質粒1 μL，補充 ddH2O至20 μL；擴增條件為：95℃5 min；95℃15 s，60℃ 15 s，72℃ 20 s，共35個循環(huán)；最終72℃延伸10 min。

按照雙重熒光定量PCR反應體系和擴增條件，分別以PCV2和PCV3標準品的6個稀釋度（10-8～10-3）作模板進行熒光定量PCR擴增，PCV2獲得擴增曲線，見圖2（a），PCV3獲得擴增曲線，見圖2（b）。根據PCV2，PCV3擴增曲線，以標準品拷貝數對數值為橫坐標，Ct為縱坐標分別繪制PCV2和PCV3標準曲線（圖3），PCV2直線方程為y=–3.5731x+42.456，R2=0.999，截距為42.456；PCV3直線方程為y= –3.373 4x+ 40.513，R2= 0.999 3，截距為40.513。二者相關系數均為0.999，具有良好的線性相關。

圖2 PCV2/PCV3熒光定量PCR擴增結果Figure 2 PCV2/PCV3 real-time PCR amplification results

圖3 雙重SYBR Green I實時熒光定量PCR檢測PCV2/3的標準曲線Figure 3 Standard curve of PCV2/3 detection by dual SYBR Green I real-time PCR

2.3 特異性試驗和敏感性試驗結果

采用建立的PCV2，PCV3 雙重SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR，對PRV、PRRSV、PPV、CSFV和PEDV核酸進行檢測。結果顯示，均無特異性吸收峰值和擴增曲線，而PCV2和PCV3有擴增曲線（圖4），表明該方法具有良好特異性。

圖4 熒光定量PCR特異性試驗結果Figure 4 Fluorescence quantitative PCR specific test results

圖5 臨床樣本雙重PCR檢測結果Figure 5 PCR results of clinical samples

選取8個稀釋度（10-10～10-3）的標準品作為模板，進行雙重SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR。結果顯示，PCV2和PCV3的檢測下限分別為41.1 copies·μL-1和27 copies·μL-1；而常規(guī)PCR檢測時，PCV2和PCV3的檢測下限分別為4.11×102copies·μL-1和2.7×102copies·μL-1，說明所建立的熒光定量PCR檢測方法靈敏度優(yōu)于普通PCR檢測方法。

2.4 重復性檢測

選取3個稀釋度（10-3、10-5和10-8）的標準品作為模板，進行熒光定量PCR檢測。檢測結果顯示，不同濃度標準品模板的批內變異系數為0.320%～0.727%；而批間的變異系數為0.725%～0.886%，且批內和批間的變異系數均小于1%。表明本研究建立的雙重熒光定量PCR檢測方法具有重復性高且穩(wěn)定性良好的特性。

2.5 臨床樣品PCV2和PCV3的檢測

采用建立的PCV2/PCV3雙重熒光定量PCR，對2017—2019年采集的66份臨床樣品進行檢測。結果顯示，PCV2陽性41份，陽性率62.12%（41/66）；PCV3陽性32份，陽性率48.48%（32/66）；混合感染31份，陽性率46.96%（31/66）。普通PCR方法檢測為陽性的病料，熒光定量PCR檢測均為陽性，且熒光定量PCR檢出的陽性率高于普通PCR陽性率，表明本研究建立的雙重熒光定量PCR檢測方法更為靈敏。

3 討論與結論

自2016年Palinski等[7]報道美國豬場中檢測到PCV3以來，中國、波蘭和意大利等國家也相繼報道PCV3的存在[9-12]，這些研究結果證明，PCV3已在世界范圍內廣泛傳播，對養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的威脅。由于PCV3與PCV2臨床表現(xiàn)相似，且對PCV2和PCV3混合感染的檢測與鑒定仍存在困難[9]，因此，建立一種敏感且特異地同時檢測和區(qū)分PCV2和PCV3的方法十分必要。目前，季程遠等[13]、賀會利等[14]以及徐朋麗等[15]分別建立了能夠同時檢測PCV2和PCV3的雙重PCR檢測方法，該方法具有快速、準確和方便等方面的優(yōu)勢，但普通的PCR方法在感染早期病毒量含量較少時，往往不能做出準確的檢測，而熒光定量PCR具備普通PCR的特點，并且能夠更加靈敏地對健康的或有疑似癥狀的豬進行早期的診斷，以便提前采取預防或治療等有效措施，并且方法省去了電泳環(huán)節(jié)，避免了核酸染料對環(huán)境的污染以及操作人健康的危害，因此，本研究針對PCV2基因組上393～665 bp保守區(qū)域和PCV3基因組上168～305 bp保守區(qū)域，建立了PCV2/PCV3雙重SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法。

結果表明，該方法能特異地檢測PCV2和PCV3，對PRV、PRRSV、PPV、CSFV和PEDV等5種其他豬病原的檢測結果均為陰性，說明該方法具有良好的特異性；PCV2和PCV3檢測下限分別為41.1 copies·μL-1和27 copies·μL-1，其中PCV2的檢測下線明顯低于季程遠等[13]和徐朋麗等[15]所建立的常規(guī)PCR檢測方法，而PCV3的檢測下線明顯低于季程遠等[13]所建立的常規(guī)PCR檢測方法，并與徐朋麗等[15]所建立的常規(guī)PCR檢測方法，李卓昕等[16]所建立的SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR檢測方法以及張志等[17]所建立的Taqman實時熒光定量PCR檢測方法相當，表明該方法具有良好的敏感性；運用所建立的PCV2/PCV3 雙重SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法對2017—2019年采自河南地區(qū)的66份臨床樣品進行檢測，評價該方法的臨床實用性，結果顯示，PCV2陽性率為62.12%（41/66），PCV3的陽性率為48.48%（32/66），PCV2和PCV3的混合感染率為46.96%（31/66），并且熒光定量PCR方法的陽性率高于普通PCR方法的陽性率，表明熒光定量PCR更適合少量病毒的檢測且PCV2和PCV3的混合感染情況在河南省已經普遍存在。

本研究成功地建立了一種能同時檢測和鑒別PCV2和PCV3的雙重SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法。該方法對臨床樣品的檢測具有敏感、特異和可靠等特點，適合于PCV2和PCV3單獨或混合感染的早期診斷、定量檢測及流行病學調查，以便采取及時地防控和治療，為我國控制PCV2和PCV3感染提供有效的技術支持。