張萬方，何金嬌，康瑞麗，朱艷平，馬 瑞，張同雨，王 蕊，朱子任，郭晉汝，張晨雨，王選年

(新鄉(xiāng)學(xué)院生命科學(xué)與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453003)

氨芐青霉素（AMP）作為一種廣譜抗生素，廣泛應(yīng)用于人類生活的方方面面，在給人類帶來極大經(jīng)濟效益的同時，抗生素的濫用也導(dǎo)致了動植物體內(nèi)抗生素殘留，并進一步通過富集效應(yīng)給大自然和人類帶來了威脅[1]。氨芐青霉素殘留會對人類產(chǎn)生很多不良影響，如過敏反應(yīng)、呼吸不暢及癲癇病等[2-3]。隨著實現(xiàn)全面小康社會建設(shè)的腳步加快和人們生活水平的提高，食品安全越來越受到人們的重視，抗生素殘留問題也越來越受到人們的關(guān)注。目前常用的青霉素檢測方法有：微生物法、高效液相色譜法、免疫熒光法、生物傳感器法[4]等，但這些方法都有一些共同缺點：操作復(fù)雜，需要專業(yè)的儀器和技術(shù)人員。近年來有報道利用羅丹明B熒光法對氨芐青霉素殘留進行檢測[5]，此方法利用納米金使羅丹明B熒光信號淬滅進行檢測，但熒光信號本身很不穩(wěn)定，易發(fā)生促滅。因此還需要開發(fā)新的更穩(wěn)定、操作更簡便且更易推廣的檢測方法。

納米金比色法是利用納米金的光學(xué)特性制備的一種生物反應(yīng)器。納米金也稱膠體金，是一種粒徑1～100 nm的球形納米材料。納米金具有獨特的光學(xué)特性，小粒徑金納米粒子（10 ～ 20 nm）水溶液一般呈酒紅色，吸收峰在520 nm附近，當納米金由于外在的作用發(fā)生聚集時，其吸收峰將紅移到620 nm附近區(qū)域，其顏色也由酒紅色變?yōu)樗{紫色[6]。核酸適配體是一種寡核苷酸生物識別分子，它可以根據(jù)空間互補與所檢測靶標高特異性結(jié)合[7]。本研究通過設(shè)計開發(fā)一種發(fā)夾DNA探針，以核酸適配體為引發(fā)鏈，通過適配體與氨芐青霉素的結(jié)合引發(fā)適配體與發(fā)夾DNA探針的互補效應(yīng)，進一步引發(fā)級聯(lián)交叉互補放大效應(yīng)，最終實現(xiàn)可視化、高效檢測氨芐青霉素的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

氨芐青霉素，購于美國Sigma公司。 氯化鈉、檬酸三鈉和氯金酸( HAuCl4 )均為分析純，購于上海化學(xué)試劑公司。

1.2 氨芐青霉素核酸適配體及配套發(fā)夾DNA探針的合成

通過文獻得知氨芐青霉素的適配體序列為5＇-GCGGGCGGTTGTATAGCG-3＇[8]，發(fā)夾型核酸探針的序列為：H1：5＇-CATCTCGGTTTGGCTTTCTT GTTACCCCCATAACAAGAAAGCCAAACC-3＇；H2：5＇-TA ACAAGAAAGCCAAACCGAGATGGG TTTGGCTTTCTTGTTATGGGGG-3＇[9]。根據(jù)HCR放大技術(shù)的需要，在此基礎(chǔ)上重新設(shè)計氨芐青霉素適配體序列，命名為：AMP-1：5＇-CCGCC CGCTA ACAAGAAAGCCAAACCCAGATGTCTTGTTATG CGGGCGGTTGTATAGCG-3＇，所有的核酸序列均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 雜交鏈式反應(yīng)（HCR）溶液的配制

合成的核酸序列，使用ddH2O稀釋成1 μmol·L-1的核酸工作液備用。分別取100 μL H1、H2和AMP-1工作液于PCR管，95 ℃ 變性10 min，之后在1 h內(nèi)緩慢降溫至25 ℃。之后將三者1:1:1混勻，即為HCR溶液，–20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 納米金溶液的制備

取氯金酸配制成0.01%氯金酸溶液200 mL。打開磁力攪拌器，加熱并不斷攪動。當觀察到燒杯中的液體沸騰時，加入5 mL 1%的檸檬酸三鈉溶液；繼續(xù)煮沸攪拌，燒杯中溶液由淺灰色變藍、變紫最終為酒紅色，即為納米金溶液。停止加熱，保持攪拌至溶液降至室溫，分裝，置于4 ℃中存放[10-11]。

1.5 納米金溶液的表征

使用透射電子顯微鏡對納米金溶液的聚集狀態(tài)進行表征。實驗分為2組：（a）取4 mL制備好的納米金溶液；（b）取3 mL納米金 + 1 mL NaCl溶液（4 mol·L-1），按照要求將兩種溶液分別滴加到銅網(wǎng)表面，室溫下晾曬自然干燥。利用JEM-1200EX透射電子顯微鏡拍攝樣品，使用Nano Measurer軟件分析納米金的粒徑大小。

1.6 實驗原理

納米金粒子表面帶有負電荷，顆粒之間由于相互排斥力的存在使得納米金粒子分散在溶液中并保持穩(wěn)定的狀態(tài)。當加入發(fā)夾探針時，探針的單鏈粘性末端通過靜電作用而吸附在納米金粒子周圍，此時加入高濃度鹽，由于發(fā)夾探針的保護使得納米金依舊分散存在而不聚集[12]。而當體系中有目標物氨芐青霉素（AMP）存在時，AMP與其適配體AMP-1相互作用使得AMP-1的發(fā)夾打開，AMP-1序列末端與發(fā)夾探針H1的單鏈粘性末端互補，導(dǎo)致H1發(fā)夾打開，而H1的序列末端又與H2的單鏈粘性末端互補，因此又導(dǎo)致H2的發(fā)夾雙鏈打開，H2序列末端同樣設(shè)計了與H1粘性單鏈末端相互補的序列，故而H2反過來又會使得新的H1鏈的打開。由此導(dǎo)致H1，H2兩條鏈不斷地循環(huán)雜交形成無限延伸的雜交雙鏈DNA，實現(xiàn)信號的放大[9]。雙鏈DNA因磷酸骨架的暴漏而表現(xiàn)出負電性，與納米金表面的負電會產(chǎn)生相互排斥作用，使得納米金粒子失去保護，在高鹽濃度下發(fā)生聚集（圖1）。納米金粒子聚集后，顏色由酒紅色變?yōu)樗{紫色，吸收光譜發(fā)生紅移。

圖1 納米金核酸適配體HCR放大比色法原理圖Figure 1 The schematic diagram of nanometer gold nucleic acid aptor HCR amplification colorimetric method

1.7 實驗條件的優(yōu)化

1.7.1 NaCl濃度優(yōu)化 分別向100 μL納米金溶液中加入不同濃度的NaCl溶液，室溫條件下孵育10 min后用多功能酶標儀測定各個樣品的吸光值，尋找最佳NaCl濃度。

1.7.2 反應(yīng)時間的優(yōu)化 將納米金溶液與HCR溶液混合后孵育不同時間，以樣品組與空白組差值最大的時間作為最優(yōu)反應(yīng)時間。

1.7.3 HCR溶液使用量的優(yōu)化 取100 μL納米金溶液，分別加入不同體積的HCR溶液，隨后加入100 μL 1 mol·L-1的NaCl溶液，室溫孵育后酶標儀檢測分析。

1.8 基于HCR的納米金檢測的氨芐青霉素比色傳感方法

取100 μL納米金溶液加入優(yōu)化的HCR溶液后，加入不同濃度的氨芐青霉素，室溫下孵育10 min，然后加入100 μL NaCl，室溫孵育后酶標儀檢測分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米金的表征

將新制備的納米金溶液添加到比色皿中，設(shè)置雙蒸水為空白對照，檢測納米金溶液的吸收光譜，掃描波長為400～800 nm，掃描步長為5 nm。結(jié)果顯示，新制備的納米金溶液呈酒紅色，在520 nm處出現(xiàn)最高吸收峰（圖2A）。將3 mL納米金 + 1 mL NaCl（1、2和4 mol·L-1）溶液混勻，觀察顏色變化，發(fā)現(xiàn)隨著鹽濃度的升高，溶液逐漸由酒紅色變成藍色（圖2C）。取加入4 mol·L-1NaCl的納米金溶液檢測吸光值，發(fā)現(xiàn)最高吸收峰轉(zhuǎn)移到620 nm處，并且只有一個吸收峰（圖2B），因此推測此時納米金溶液已經(jīng)全部發(fā)生聚集。使用電子顯微鏡對新制備的納米金溶液和加入4 mol·L-1NaCl溶液后的溶液進行檢測，結(jié)果顯示新制備的納米金溶液成分散狀態(tài)，粒徑大小約為13 nm（圖2D），加入4 mol·L-1NaCl溶液后，納米金粒子聚集到一起，成團狀存在（圖2E），與文獻報道一致[13]。

圖2 納米金溶液的表征Figure 2 Characterization of nanometer gold solution

2.2 實驗條件的優(yōu)化

2.2.1 反應(yīng)條件的優(yōu)化 向納米金溶液中加入濃度梯度的NaCl溶液后，結(jié)果顯示隨著NaCl濃度的升高，吸光值A(chǔ)620/520的比值逐漸升高，當NaCl溶液的濃度為1 mol·L-1時達到峰值，說明此時納米金粒子已經(jīng)完全聚集，因此確定NaCl溶液的最佳濃度為1 mol·L-1（圖3(a)）。經(jīng)過一系列溫度梯度和不同反應(yīng)時間的優(yōu)化實驗，發(fā)現(xiàn)HCR溶液與納米金在37 ℃孵育30 min時鹽離子聚集納米金溶液效果最好，因此該選用條件為最佳反應(yīng)條件。

圖3 實驗條件的優(yōu)化Figure 3 Optimization of the experimental conditions

2.2.2 HCR溶液使用量的優(yōu)化 取100 μL納米金溶液分別加入不同體積的HCR溶液，37 ℃孵育30 min，然后向管中加入1 mol·L-1的NaCl溶液，使用酶標儀檢測520 nm和620 nm處的吸光值。結(jié)果顯示當加入30 μL HCR溶液時反應(yīng)達到平衡狀態(tài)(圖3(b)），說明此時HCR溶液中的核酸分子能夠完全保護在納米金粒子表面而使之不被鹽離子聚集，故HCR溶液的最佳體積為30 μL，即終濃度11.5% (V/V)為最佳濃度。

2.3 氨芐青霉素檢測體系的性能評價

2.3.1 體系靈敏度評價 為了確定HCR放大法的靈敏度范圍，將氨芐青霉素標準品配置成0～2 μmol·L-1的濃度梯度，按照1.7的方法進行檢測。結(jié)果顯示，隨著氨芐青霉素濃度的升高，吸光度比值逐漸升高，擬合方程為y=–0.008 7x2+ 0.261x–0.130 7，R2= 0.992 4（圖4(a)）。其中，當氨芐青霉素濃度在0～1.2 μmol·L-1時呈現(xiàn)線性關(guān)系，線性方程為y= 0.163 6x+ 0.025，R2= 0.995 3（圖4(b)），最低檢測限可達到10 nmol·L-1。以上結(jié)果表明，該方法有較高的靈敏度。

2.3.2 體系特異性評價 為了驗證該檢測體系的特異性，選取了慶大霉素、四環(huán)素、卡那霉素、新鏈霉素等抗生素與氨芐青霉素進行特異性分析，各種抗生素添加的終濃度均為1 μmol·L-1。結(jié)果顯示，當更換為其他抗生素時，A620/520的比值非常低，氨芐青霉素的吸光值比值顯著高于其他抗生素(圖4(c))，表明該檢測體系只對氨芐青霉素具有特異性反應(yīng)。

圖4 氨芐青霉素檢測體系的性能評價Figure 4 Performance evaluation of ampicillin detection system

2.4 實際樣品的檢測

為了對檢測方法的實際應(yīng)用能力進行檢驗，選取魚肉和豬肉兩種樣品，采用加標回收法進行驗證。使用乙腈提取，經(jīng)C18柱萃取[12]后加入不同濃度的氨芐青霉素標準品，然后按照1.7的方法進行檢測。結(jié)果顯示，氨芐青霉素的回收率在92.30%～103.27%之間（表1），該實驗結(jié)果表明納米金核酸適配體HCR放大比色法具有良好的檢測性能。

表1 動物性食品中氨芐青霉素檢測結(jié)果Table 1 The detection results of ampicillin in animal food

3 討論與結(jié)論

氨芐青霉素（AMP），是一種β-內(nèi)酰胺類廣譜抗生素，除抗感染以外，還具有促進動物生長的作用[14]，因此在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域如畜、禽以及水產(chǎn)養(yǎng)殖中被廣泛應(yīng)用[15-16]。隨著生活水平的提高，抗生素的殘留問題逐漸成為人們關(guān)注的新焦點。目前常用的氨芐青霉素檢測方法因操作復(fù)雜、成本高、反應(yīng)體系要求嚴苛等缺點很難投入大規(guī)模的使用。核酸適配體生物反應(yīng)器是近年來出現(xiàn)的一種新的檢測方法，該方法具有性能穩(wěn)定、操作簡單、靶分子范圍廣等優(yōu)點[17]。本文采用納米金核酸適配體雜交鏈式反應(yīng)比色法進行氨芐青霉素的檢測具有操作簡單、反應(yīng)快速、成本低等優(yōu)點，有利于進行大規(guī)模的推廣。

本研究設(shè)計合成了一條氨芐青霉素特異性核酸適配體DNA發(fā)夾和兩條DNA 發(fā)夾探針，利用發(fā)夾之間序列互補雜交的方法實現(xiàn)信號的級聯(lián)放大。研究表明該方法的靈敏度范圍為0～1.2 μmol·L-1，最低檢測限可達到10 nmol·L-1，并且特異性好，對其他類型的抗生素沒有非特異性反應(yīng)，對魚肉和豬肉的回收率為92.30% ～ 103.27%。綜上所述，該方法操作便捷、特異性好且靈敏度高，是檢測氨芐青霉素殘留的新方法。