陳彬 徐廷偉

(湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院 襄陽(yáng)市中心醫(yī)院神經(jīng)外科，湖北 襄陽(yáng) 441021)

腦膠質(zhì)瘤是一種比較常見(jiàn)的原發(fā)性顱腦腫瘤，其由大腦和脊髓膠質(zhì)細(xì)胞癌變所產(chǎn)生。因其為不能完全切除的原發(fā)性腦腫瘤，因此無(wú)法完全治愈。臨床常用的標(biāo)準(zhǔn)治療包括手術(shù)、放射治療和化療〔1，2〕。盡管進(jìn)行了這種強(qiáng)化治療，但腫瘤的耐藥性和復(fù)發(fā)限制了其療效〔3，4〕。替莫唑胺(TMZ)是膠質(zhì)瘤化療標(biāo)準(zhǔn)的烷基化劑。甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)啟動(dòng)子高甲基化是膠質(zhì)瘤對(duì)TMZ產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制之一〔5〕。盡管患者生存期得到延長(zhǎng)，但治療效果有限，因?yàn)槟z質(zhì)瘤往往在治療過(guò)程中對(duì)TMZ表現(xiàn)出適應(yīng)性耐藥。因此，針對(duì)耐藥膠質(zhì)瘤的治療具有重要的臨床治療意義。人類(lèi)基因組中僅有不到2%編碼成蛋白質(zhì)，超過(guò)90%的基因組轉(zhuǎn)錄為非編碼RNA〔6〕。LncRNA被定義為一類(lèi)長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸(nt)的非編碼RNA轉(zhuǎn)錄本，其不具有完整的開(kāi)放閱讀框。有證據(jù)表明，LncRNA在多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮作用，包括癌細(xì)胞的耐藥〔7，8〕。 LncRNA LINC00261參與多種癌癥的耐藥性調(diào)控〔9〕，但是其在腦膠質(zhì)瘤中是否對(duì)耐藥性具有調(diào)控作用尚且未知。本研究擬以膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251為研究對(duì)象，觀察LINC00261對(duì)其TMZ耐藥性的影響，旨在探討LINC00261增強(qiáng)TMZ耐藥膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)TMZ敏感性的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 組織標(biāo)本收集于襄陽(yáng)市中心醫(yī)院2018年3月至2019年6月外科手術(shù)切除的腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本20例，腦外傷內(nèi)減壓切除的正常腦組織20例。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬均簽署知情同意書(shū)；膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清(FBS)購(gòu)自四季青；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自上海聯(lián)碩生物公司；替莫唑胺購(gòu)自山東中天；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑購(gòu)自Sellect公司；RNA抽提試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒均購(gòu)自大連TaKaRa公司；Transwell小室均購(gòu)自Corning公司；LipofectamineTM2000試劑、電化學(xué)發(fā)光(ECL)液和RIPA蛋白裂解液均購(gòu)自碧云天；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251的培養(yǎng)：含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，傳代。

1.2.2細(xì)胞分組與處理 將正常培養(yǎng)的U251細(xì)胞標(biāo)記為U251組。將U251細(xì)胞按照陸芩等〔10〕的濃度梯度法建立TMZ耐藥U251細(xì)胞，標(biāo)記為U251/TMZ組。將TMZ(5、10、20、40、80 μg/ml)處理U251、U251/TMZ細(xì)胞48 h，分被標(biāo)記為5、10、20、40、80 μg/ml組，從中篩選最適濃度10 μg/ml用于后續(xù)試驗(yàn)。用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000試劑，加入4倍DNA或質(zhì)粒體積的脂質(zhì)體，將pcDNA、pcDNA-LINC00261、anti-miR-NC、anti-miR-182-5p、pcDNA-LINC00261+miR-NC、pcDNA-LINC00261+miR-182-5p轉(zhuǎn)染至U251/TMZ細(xì)胞，轉(zhuǎn)染4 h后，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，并用10 μg/ml TMZ處理48 h，用qRT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染的效率，確定轉(zhuǎn)染成功后，分別標(biāo)記為T(mén)MZ+pcDNA組、TMZ+pcDNA-LINC00261組、TMZ+anti-miR-NC組、TMZ+anti-miR-182-5p組、TMZ+pcDNA-LINC00261+miR-NC組、TMZ+pcDNA-LINC00261+miR-182-5p組，用于后續(xù)試驗(yàn)。將miR-NC、miR-182-5p、si-NC、si-LINC00261用同樣的方法轉(zhuǎn)染至U251細(xì)胞，分別標(biāo)記為miR-NC組、miR-182-5p組、si-NC組、si-LINC00261組。

1.2.3qRT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中LINC00261、miR-182-5p的表達(dá) 收集細(xì)胞，用RNA抽提試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA。再用qRT-PCR試劑盒檢測(cè)各個(gè)樣品中LINC00261、miR-182-5p的表達(dá)，以GAPDH、U6為內(nèi)參，2-△△Ct計(jì)算LINC00261、miR-182-5p的相對(duì)表達(dá)。引物信息：LINC00261上游引物5′-ACATTTGGTAGCCCCTGGAG-3′，下游引物5′-TCTTCCCCGGAGAACTAGCA-3′；miR-182-5p上游引物5′-TGCGGTTTGGCAATGGTAGAAC-3′，下游引物5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；GADPH上游引物5′-CCACCCAGAAGACTGTGGAT-3′，下游引物5′-TTCAGCTCAGGGATGACCTT-3′。

1.2.4MTT法檢測(cè)細(xì)胞抑制率 收集細(xì)胞，調(diào)整至5×105個(gè)/ml，取100 μl接種至96孔板，加入20 μl 5 g/L的MTT溶液，培養(yǎng)4 h。盡量棄去上清，加入150 μl的二甲基亞砜(DMSO)，震蕩混勻至結(jié)晶紫溶解。調(diào)整酶標(biāo)儀至490 nm波長(zhǎng)，檢測(cè)細(xì)胞的吸光度(A)。細(xì)胞的抑制率=〔1-A490樣品/A490對(duì)照〕×100%。

1.2.5Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移侵襲 選用含有基質(zhì)膠的Transwell小室進(jìn)行細(xì)胞的侵襲檢測(cè)，不含基質(zhì)膠的Transwell小室進(jìn)行細(xì)胞的遷移檢測(cè)，二者的操作步驟相同。操作步驟為：先將細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，調(diào)整至5×106個(gè)/ml。取200 μl細(xì)胞加入小室的上室內(nèi)，取600 μl含血清的培養(yǎng)基加入小室的下室，將小室置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。準(zhǔn)備甲醇固定液和結(jié)晶紫染色液備用。小心取出小室，用棉簽輕輕拭去聚碳酸酯膜上表面的細(xì)胞，然后將膜轉(zhuǎn)移至固定液中，30 min。將膜浸入染色液中染色15 min，用鑷子輕輕將膜下表面朝上在載玻片上固定。用顯微鏡觀察細(xì)胞的數(shù)量(×200)，取平均值。

1.2.6Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、p21的蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞并用含有苯甲基磺酰氟(PMSF)的裂解液裂解，提取用蛋白后用BCA法進(jìn)行蛋白定量，再用沸水浴10 min行變性處理。小心加樣后，調(diào)節(jié)電壓60 V進(jìn)行穩(wěn)壓電泳，約40 min，電壓調(diào)整至120 V進(jìn)行穩(wěn)壓電泳，1.5～2.0 h結(jié)束。結(jié)束后，將蛋白用轉(zhuǎn)膜儀濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，轉(zhuǎn)膜過(guò)程需要低溫環(huán)境下操作。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后進(jìn)行脫脂奶粉(5%)封閉、一抗孵育(兔抗人多克隆抗體CyclinD1、MMP-2、MMP-9、p21)、二抗孵育(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體)。將膜轉(zhuǎn)移至暗室內(nèi)，用ECL試劑進(jìn)行顯影、定影、曝光，用Quantity One凝膠分析軟件分析條帶的灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，目的條帶灰度值與內(nèi)參灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)情況。

1.2.7生物信息學(xué)預(yù)測(cè) 通過(guò)在線靶基因預(yù)測(cè)庫(kù)Target Scan(http：//www.targetscan.org/)預(yù)測(cè)LINC 00261的靶向結(jié)合位點(diǎn)。

1.2.8雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞中LINC00261與miR-182-5p的結(jié)合能力 收集細(xì)胞，裂解液將細(xì)胞充分裂解，再加入5 μl的熒光素酶緩沖液和底物，混合均勻后測(cè)量熒光強(qiáng)度，再加入海參熒光素酶緩沖液和底物，混勻檢測(cè)海參熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔。最后比較海參熒光素酶的強(qiáng)度，表達(dá)LINC00261與miR-182-5p的結(jié)合能力。值得注意的是，實(shí)驗(yàn)中以為psiCHECK2載體，螢火蟲(chóng)熒光素酶為內(nèi)參，psiCHECK2-LINC00261-野生型(WT)+miR-NC、psiCHECK2-LINC00261-突變型(MUT)+miR-NC為對(duì)照，觀察miR-182-5p對(duì)LINC00261表達(dá)的影響。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism6.0進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1LINC00261和miR-182-5p在膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中的表達(dá) 見(jiàn)表1，與正常腦組織相比，膠質(zhì)瘤組織中LINC00261表達(dá)顯著降低，miR-182-5p表達(dá)顯著升高(均P<0.001)。

2.2LINC00261和miR-182-5p在膠質(zhì)瘤細(xì)胞和膠質(zhì)瘤TMZ耐藥細(xì)胞中的表達(dá) 見(jiàn)表2，與U251組相比，U251/TMZ組細(xì)胞中LINC00261表達(dá)顯著降低，miR-182-5p表達(dá)顯著升高(均P<0.001)。

2.3不同濃度替莫唑胺對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞和膠質(zhì)瘤替莫唑胺耐藥細(xì)胞抑制率的影響 結(jié)果如表3所示，與U251組相比，U251/TMZ組細(xì)胞在替莫唑胺濃度為5、10、20、40、80 μg/ml的抑制率均顯著降低，IC50值顯著升高(P<0.05)。

表1 LINC00261和miR-182-5p在膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中的表達(dá)

表2 LINC00261和miR-182-5p在膠質(zhì)瘤細(xì)胞和膠質(zhì)瘤TMZ耐藥細(xì)胞中的表達(dá)及不同濃度TMZ對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞和膠質(zhì)瘤TMZ耐藥細(xì)胞抑制率的影響

2.4LINC00261過(guò)表達(dá)聯(lián)合TMZ(10 μg/ml)對(duì)U251/TMZ細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響 與TMZ+pcDNA組相比，TMZ+pcDNA-LINC00261組細(xì)胞中LINC00261表達(dá)顯著升高，細(xì)胞抑制率顯著升高，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)均顯著降低，p21蛋白表達(dá)顯著升高(均P<0.001)。見(jiàn)圖1、表3。

2.5抑制miR-182-5p表達(dá)聯(lián)合TMZ對(duì)U251/TMZ細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響 與TMZ+anti-miR-NC組相比，TMZ+anti-miR-182-5p組細(xì)胞中miR-182-5p表達(dá)顯著降低，細(xì)胞抑制率顯著升高，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)均顯著降低，p21蛋白表達(dá)顯著升高(均P<0.001)。見(jiàn)圖2、表4。

A：增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)；B：U251/TMZ細(xì)胞的遷移侵襲(結(jié)晶紫，×200)；圖2同

表3 LINC00261過(guò)表達(dá)聯(lián)合TMZ對(duì)U251/TMZ細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響

圖2 抑制miR-182-5p表達(dá)聯(lián)合替莫唑胺對(duì)U251/TMZ細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響

表4 抑制miR-182-5p表達(dá)聯(lián)合替莫唑胺對(duì)U251/TMZ細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響

2.6LINC00261靶向調(diào)控miR-182-5p的表達(dá) 通過(guò)在線預(yù)測(cè)軟件target scan預(yù)測(cè)到LINC00261與miR-182-5p之間存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)(圖3)。

圖3 LINC00261的序列中含有與miR-182-5p互補(bǔ)的核苷酸序列

與miR-NC組相比，miR-182-5p組WT-LINC00261細(xì)胞的熒光活性顯著降低(表5)。與pcDNA組(1.00±0.09)相比，pcDNA-LINC00261組細(xì)胞中miR-182-5p表達(dá)(0.41±0.08)顯著降低，與si-NC組(0.98±0.08)相比，si-LINC00261組細(xì)胞中miR-182-5p表達(dá)顯著升高(2.35±0.23；F=353.756，P=0.000)。

表5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.7miR-182-5p過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了INC00261過(guò)表達(dá)對(duì)U251/TMZ細(xì)胞TMZ耐藥性的作用 與TMZ+pcDNA組相比，TMZ+pcDNA-LINC00261組細(xì)胞中miR-182-5p表達(dá)顯著降低，細(xì)胞抑制率顯著升高，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)均顯著降低，p21蛋白表達(dá)顯著升高；與TMZ+pcDNA-LINC00261+miR-NC組相比，TMZ+pcDNA-LINC00261+miR-182-5p組細(xì)胞中miR-182-5p表達(dá)顯著升高，細(xì)胞抑制率顯著降低，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著升高，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)均顯著升高，p21蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表6、圖4、圖5。

表6 miR-182-5p過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了INC00261過(guò)表達(dá)對(duì)U251/TMZ細(xì)胞TMZ耐藥性的作用

圖4 U251/TMZ細(xì)胞的遷移侵襲(結(jié)晶紫，×200)

1～4:TMZ+pcDNA、TMZ+pcDNA-LINC00261、TMZ+pcDNA-LINC00261+miR-NC、TMZ+pcDNA-LINC00261+miR-182-5p

3 討 論

化療是癌癥的基本治療手段之一，然而，臨床治療失敗的主要原因是化療耐藥的產(chǎn)生。藥物外排、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡、靶基因突變等多種因素相互作用，導(dǎo)致耐藥機(jī)制復(fù)雜〔11〕。LncRNA一直是生物科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，最新研究表明，LncRNAs在乳腺癌、胃癌、肺癌等腫瘤的耐藥性中發(fā)揮著重要作用〔12〕。LINC00261是一種LncRNA，其在腫瘤抑制中發(fā)揮重要作用〔13〕。Shi等〔14〕在非小細(xì)胞肺癌的研究中報(bào)道，LINC00261在癌組織中的表達(dá)異常下調(diào)，并與患者的預(yù)后差呈正相關(guān)，在癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)LINC00261能夠抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，深入研究發(fā)現(xiàn)，LINC00261可靶向抑制LINC00261，抑制Wnt信號(hào)通路的活性進(jìn)而參與非小細(xì)胞肺癌的致病機(jī)制。Lin等〔15〕在研究中報(bào)道，抗氟尿嘧啶的食管癌中LINC00261表達(dá)降低，過(guò)表達(dá)LINC00261的氟尿嘧啶耐藥食管癌細(xì)胞中，細(xì)胞的增殖受到明顯抑制，凋亡能力明顯提升，沉默LINC00261的氟尿嘧啶耐藥食管癌細(xì)胞則可增強(qiáng)癌細(xì)胞的增殖和抗凋亡能力，這提示LINC00261可能成為治療耐藥食管癌的新靶點(diǎn)。我們推測(cè)LINC00261可能也參與抗癌藥物TMZ在膠質(zhì)瘤中的耐藥性調(diào)控。本研究通過(guò)RT-qPCR法檢測(cè)了膠質(zhì)瘤組織、膠質(zhì)瘤細(xì)胞、TMZ耐藥膠質(zhì)瘤細(xì)胞中LINC00261的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)LINC00261在膠質(zhì)瘤中表達(dá)異常下調(diào)，在耐藥膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)下調(diào)更明顯，可見(jiàn)，LINC00261在耐藥膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況與其在氟尿嘧啶耐藥食管癌中的表達(dá)情況相類(lèi)似。進(jìn)一步研究，用MTT、Transwell小室、Western印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)LINC00261的TMZ耐藥膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制率、遷移侵襲及相關(guān)蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)LINC00261可提高耐藥癌細(xì)胞的抑制率，抑制耐藥癌細(xì)胞的遷移侵襲，下調(diào)CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)，上調(diào)p21蛋白表達(dá)，可見(jiàn)，過(guò)表達(dá)LINC00261能夠增強(qiáng)TMZ耐藥膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的敏感性。深入研究，通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LINC00261可靶向負(fù)調(diào)控miR-182-5p，推測(cè)LINC00261增強(qiáng)TMZ耐藥膠質(zhì)瘤細(xì)胞的敏感性的機(jī)制可能與miR-182-5p具有相關(guān)性。

miRNA在人類(lèi)多種疾病中通過(guò)抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄或蛋白翻譯參與疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程〔16，17〕。Xue等〔18〕在膠質(zhì)瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，STAT3的異常激活或表達(dá)降低分別促進(jìn)或抑制miR-182-5p的表達(dá)，并且腫瘤抑制因子procadadherin-8(PCDH8)是miR-182-5p的候選靶基因，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中PCDH8的表達(dá)水平與磷酸化信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(p-STAT)3或miR-182-5p呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明miR-182-5p在膠質(zhì)瘤中發(fā)揮促進(jìn)癌癥惡化的作用。Cao等〔19〕在肝癌的研究中報(bào)道，miR-182-5p能夠促進(jìn)肝癌的惡性化進(jìn)展，其機(jī)制與靶向叉頭轉(zhuǎn)錄因子(FOX)O3a相關(guān)，推測(cè)miR-182-5p在膠質(zhì)瘤中可能可靶向FOXO3a參與膠質(zhì)瘤的進(jìn)展過(guò)程。史俊英等〔20〕在胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)，抑制miR-182-5p能夠增強(qiáng)氟尿嘧啶耐藥胃癌細(xì)胞對(duì)氟尿嘧啶的敏感性。本研究中檢測(cè)了膠質(zhì)瘤組織、膠質(zhì)瘤細(xì)胞、替莫唑胺耐藥膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR-182-5p的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-182-5p表達(dá)明顯上調(diào)，且抑制miR-182-5p能夠明顯的提高TMZ對(duì)耐藥膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制率，增強(qiáng)TMZ對(duì)耐藥膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抗遷移侵襲作用，可見(jiàn)，抑制miR-182-5p能夠增強(qiáng)TMZ對(duì)耐藥膠質(zhì)瘤細(xì)胞的敏感性，這與抑制miR-182-5p在氟尿嘧啶耐藥胃癌細(xì)胞中的增敏作用相似。重要的是，我們還發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-182-5p能夠逆轉(zhuǎn)LINC00261對(duì)TMZ耐藥膠質(zhì)瘤細(xì)胞抑制率、遷移侵襲的作用。這些研究結(jié)果為T(mén)MZ耐藥膠質(zhì)瘤的治療提供了潛在的治療靶點(diǎn)，遺憾的是，我們本在體內(nèi)對(duì)這些結(jié)果進(jìn)行更充分的驗(yàn)證。

綜上所述，LncRNA LINC00261可逆轉(zhuǎn)TMZ耐藥膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的耐藥性，其機(jī)制可能與靶向miR-182-5p有關(guān)，為耐藥膠質(zhì)瘤的治療提供新方向。