韓書芝 李海月 張鳳蕊 曹磊 平芬

(1河北省人民醫(yī)院老年病三科，河北 石家莊 050051；2承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸科)

可吸入顆粒物(PM)中的細顆粒物(PM2.5)已被公認是對人體健康危害最大且代表性最強的大氣污染物〔1〕。PM2.5污染的主要原因是能源部門的煤炭燃燒、機動車尾氣排放、大規(guī)模基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)和居民生活燃料的燃燒。顆粒物由多環(huán)芳烴(PAHs)和重金屬等一些有害成分組成，對人體多個器官造成損害〔2〕。有學(xué)者表明，由于PM2.5具有直徑小、表面積大，在空氣中長時間懸浮，易于吸附空氣中其他有害物質(zhì)等特點，PM2.5攜帶的鉛、錳、鋁、銅等重金屬，可在呼吸暴露后進入循環(huán)，選擇性地在血液、腦、肝、肺等靶器官中積累，對機體造成損傷，且這種損傷具有顯著的量效關(guān)系〔3〕。因此探索PM2.5的損傷機制，為霧霾所致疾病的防治提供有效的措施，具有重要臨床意義。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選擇雄性Wistar大鼠40只，體重150～200 g，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，飼養(yǎng)于醫(yī)院臨研中心動物房。

1.2實驗動物分組 將大鼠隨機分為5組，每組8只：空白對照組(C組)：不予任何處理。生理鹽水對照組(NS組)：給予氣管內(nèi)滴入生理鹽水(1 ml/kg)，每周1次。PM2.5染毒組(PM2.5組)：給予氣管內(nèi)滴入濃度為 7.5 mg/ml的PM2.5溶液(1 ml/kg)，每周1次。維生素C低劑量組(LVC組)：染毒同PM2.5染毒組，染毒同時給予10 ml/kg 的維生素C 溶液(濃度為10 mg/ml)灌胃，每天1次。維生素C高劑量組(HVC組)：方法同LVC組，維生素C濃度為30 mg/ml。實驗時間共4 w，各組大鼠均自由進食水，實驗結(jié)束后處死動物。

1.3標(biāo)本留取 用10%水合氯醛(4 ml/kg)對大鼠進行腹腔注射麻醉，麻醉成功后抽取腹主動脈5 ml，分離血清，-80℃ 保存待測。抽血后處死大鼠，手術(shù)暴露出氣管，行左肺灌洗，每次抽取5 ml 4℃ 預(yù)冷的1×磷酸鹽緩沖液(PBS)注入左肺，回吸得到灌洗液，重復(fù)3次，將收集的灌洗液混勻，4℃離心后，取上清-80℃保存。取下右下肺，甲醛固定，制作石蠟包塊，切片、蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察肺組織病理變化。余肺、肺泡灌洗液上清，-80℃保存。

1.4肺泡灌洗液中蛋白含量測定 肺泡灌洗液中蛋白含量采用二喹啉甲酸(BCA)法進行測定，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.5血清膽紅素的測定 采用化學(xué)氧化酶標(biāo)法檢測大鼠血清中總膽紅素(TBIL)和直接膽紅素(DBIL)含量，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，間接膽紅素(IBIL)=TBIL-DBIL。

1.6血紅素氧化酶(HO)-1、紅系衍生的核轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子(Nrf)2肺組織中的表達 采用免疫組化方法測定肺組織中HO-1、Nrf2 的表達，鏡下觀察到細胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆?？膳卸殛栃越Y(jié)果。同時檢測HO-1和Nrf2的灰度值，灰度值越大，代表表達越低。

1.7統(tǒng)計方法 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、LSD檢驗。

2 結(jié) 果

2.1大鼠肺組織病理改變 光鏡下觀察，C組和NS組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整，間質(zhì)無水腫，未見明顯炎癥細胞浸潤。PM2.5組大鼠肺泡間隔增厚或斷裂，肺泡有融合，肺間質(zhì)水腫，可見出血、炎性細胞浸潤。LVC組和HVC組大鼠肺組織鏡下改變較PM2.5組大鼠較輕。見圖1。

圖1 各組肺組織HE染色(×100)

2.2大鼠肺泡灌洗液中蛋白含量變化 PM2.5組肺泡灌洗液中蛋白含量明顯高于C組和NS組(P<0.05)；LVC組和HVC組蛋白含量較PM2.5組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；HVC組低于LVC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.3各組大鼠血清中各指標(biāo)含量的變化 PM2.5組與NS組和C組比較，TBIL、IBIL水平均明顯降低(P<0.05)，維生素C干預(yù)后血清TBIL、IBIL水平較PM2.5組明顯升高(P<0.05)，但不同劑量維生素C組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

2.4各組大鼠肺組織Nrf2、HO-1表達 光鏡下，PM2.5組胞質(zhì)中棕黃色及棕褐色顆粒表達減少，C組及NS組、LVC組及HVC組胞質(zhì)中棕黃色及棕褐色顆粒表達較PM2.5組增加。PM2.5組HO-1、Nrf2灰度值較C組及NS組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，維生素C干預(yù)后上述指標(biāo)灰度值下降，與PM2.5組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但不同劑量維生素C干預(yù)組間差異無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表1、圖2、圖3。

表1 各組肺泡灌洗液中蛋白及血清中各指標(biāo)含量及HO-1、Nrf2灰度值比較

圖2 HO-1免疫組化鏡下觀察染色結(jié)果(HE，×400)

圖3 Nrf2免疫組化鏡下觀察染色結(jié)果(HE，×400)

3 討 論

目前，環(huán)境污染是導(dǎo)致全球過早死亡和殘疾的最大原因〔4〕。PM2.5是對全球公共健康構(gòu)成最大威脅的主要空氣污染物〔5〕。據(jù)《GBD 2015》估計，環(huán)境暴露于PM2.5導(dǎo)致420萬人死亡和1.031億人勞動力損失，占全球死亡率的7.6%和勞動力總損失的4.2%〔6〕?？諝馕廴镜募毙杂绊懛从吃诟嗟暮粑腊Y狀、心血管事件增加、住院率和死亡率上。而長期影響包括兒童和青少年的肺生長發(fā)育遲緩、成人肺功能下降、心血管疾病和肺癌〔7〕。相關(guān)研究表明，PM2.5會增加呼吸系統(tǒng)疾病的風(fēng)險，包括哮喘、支氣管炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)及肺纖維化〔8，9〕。

顆粒物由多環(huán)芳烴和重金屬等一些有害成分組成，可通過不同機制刺激機體產(chǎn)生活性氧(ROS)，對體內(nèi)的脂質(zhì)、脫氧核糖核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子造成氧化損傷〔10，11〕。

研究認為，PM2.5導(dǎo)致死亡率升高的病理機制主要體現(xiàn)在以下幾個方面：①PM2.5與氧化應(yīng)激；②PM2.5與炎癥損傷；③PM2.5與核酸修復(fù)；④PM2.5與免疫反應(yīng)〔12〕。氧化應(yīng)激是機體內(nèi)氧化劑過量和(或)抗氧化劑減少引起的正常氧化/抗氧化失衡，可以被定義為ROS的產(chǎn)生與抗氧化防御系統(tǒng)對ROS的消耗相比，是一種不平衡的過剩狀態(tài)，在許多人類疾病的病理生理中起著重要作用，是多系統(tǒng)多器官氧化損傷的共同基礎(chǔ)，也是PM2.5引發(fā)的疾病發(fā)生、發(fā)展和惡化的關(guān)鍵，近年來研究證實，急性PM2.5暴露引起的炎癥和氧化應(yīng)激損傷可影響全身多個器官〔13，14〕。

呼吸系統(tǒng)作為機體的重要屏障之一，在PM2.5入侵和破壞全身的過程中起著重要作用?？諝馕廴竞笞钤绯霈F(xiàn)肺部炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，該反應(yīng)可能驅(qū)動凝血系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)及全身炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的變化〔15〕。PM2.5隨吸氣氣流被吸入肺部后不僅可沉積在肺部，還能夠透過肺泡壁進入到血液循環(huán)中，對全身多個器官造成危害。本實驗結(jié)果提示PM2.5可增加肺毛細血管的通透性，維生素C可降低肺毛細血管的通透性。

Nrf2是氧化應(yīng)激反應(yīng)中調(diào)節(jié)抗氧化防御系統(tǒng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在保持細胞氧化還原平衡方面起著關(guān)鍵作用，它調(diào)控還原型輔酶Ⅱ(NADPH)、醌氧化還原酶(NQO1)、谷氨酸半胱氨酸連接酶(GCL)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、過氧化氫酶(CAT)和HO-1等抗氧化酶的表達〔16，17〕，增加抗氧化酶的活性，進一步清除 ROS 和減輕細胞損傷。

HO-1是一種可誘導(dǎo)的抗氧化酶，在各種細胞中發(fā)揮著細胞保護作用，它的水平主要由抗氧化反應(yīng)元件(ARE)調(diào)節(jié)。它是通過激活Nrf2而表達的。HO-1在大多數(shù)細胞中是由氧化和炎癥信號誘導(dǎo)的〔18〕。HO-1催化血紅素降解產(chǎn)生一氧化碳、游離鐵和膽綠素，后者轉(zhuǎn)化為膽紅素，這在很大程度上是HO-1保護作用的原因〔19〕。HO-1表達的調(diào)節(jié)現(xiàn)在被認為是多種疾病的治療靶點。

Nrf2/HO-1信號通路是肺內(nèi)重要的抗氧化途徑。PM2.5暴露可使其表達受抑制，并誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生。導(dǎo)致細胞生理生化及代謝功能發(fā)生障礙，進而引起臟器組織損傷〔20，21〕。本實驗結(jié)果推斷氣管內(nèi)滴入PM2.5染毒，由于強刺激可能導(dǎo)致了Nrf2/HO-1信號通路的受損，抑制其功能的正常發(fā)揮，維生素C干預(yù)后Nrf2/HO-1信號途徑表達增強，從而發(fā)揮有效的抗氧化作用。維生素C是一種水溶性抗氧化劑，其抗氧化作用依靠可逆的脫氫反應(yīng)來完成，對自由基具有很強的清除能力，可保護機體免受氧化損傷所導(dǎo)致的急慢性疾病的發(fā)生及進展〔22〕。另一方面，維生素C可增加葡萄糖-6-磷酸鹽脫氫酶缺乏的個體溶血的風(fēng)險，增加腎結(jié)石的發(fā)病率，和鐵劑同用有增加鐵劑體內(nèi)蓄積〔23〕。鑒于維生素C 對機體影響的雙重作用，選擇合適的劑量尤為重要。本實驗結(jié)果也提示低劑量維生素C對PM2.5引起的氧化損傷已具有保護作用。PM2.5通過多種途徑對肺臟造成損害，氧化損傷作為主要途徑之一備受關(guān)注，但其確切機制仍有待進一步深入研究。