曉映 吳優(yōu) 張華 張躍平 李文光

(南通大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，江蘇 南通 226001)

膀胱癌是一類發(fā)生于膀胱黏膜上的惡性腫瘤，也是臨床上常見的惡性泌尿系統(tǒng)腫瘤類型之一〔1〕。膀胱癌發(fā)病原因較為復(fù)雜，有內(nèi)在遺傳和基因因素，外在的環(huán)境因素。研究顯示基因等內(nèi)在因素是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的根本因素。因此從基因角度闡明膀胱癌發(fā)病機(jī)制成為目前研究的熱點。非編碼RNA早期被認(rèn)為是一種無功能RNA，近期較多的報道表明，非編碼RNA參與胚胎發(fā)育、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和蛋白翻譯等多種生物學(xué)功能〔2,3〕。miR-141是一類非編碼RNA，其主要通過靶向下游基因的3′UTR區(qū)域，進(jìn)而調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)。近年來研究顯示其參與了不同的病理學(xué)過程，如腫瘤的增殖、凋亡、遷移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤耐藥等〔4～6〕。本研究擬分析miR-141在膀胱癌組織的表達(dá)及其對膀胱癌細(xì)胞生命活動的影響，為膀胱癌臨床診治提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1臨床資料 在南通大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會指導(dǎo)下，收集2017年6月至2018年12月南通大學(xué)附屬醫(yī)院收治且確診的108例膀胱癌患者作為研究對象，其中女30例，男78例，年齡35～81歲，平均年齡(60.32±12.44)歲。參照世界衛(wèi)生組織(WHO)腫瘤病理分級標(biāo)準(zhǔn)：G3 58例，G2 29例，G1 21例；腫瘤臨床分期按照TNM標(biāo)準(zhǔn)：T1～T2 49例，T3～T4 59例；腫瘤生長方式：禿頭狀45例，浸潤性63例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例，未見淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移63例。癌旁組織經(jīng)病理學(xué)檢測未見病理改變?；颊呋蚣覍倬私獗狙芯康哪康呐c內(nèi)容并簽署知情同意書。

1.2實驗材料 BIU-8膀胱癌細(xì)胞系購自美國ATCC細(xì)胞庫；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、胰酶、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑及青鏈霉素均購自美國Gibcon公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗小鼠二抗、人類runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(RUNX)3、微管蛋白(Tubulin)單克隆抗體均購自美國Santa cruz公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA提取試劑盒和qPCR Mix購自南京諾唯贊生物有限公司；雙熒光素酶報告基因試劑盒購自美國Promaga公司；5-乙炔基-2'脫氧尿嘧啶核苷(EdU)染色、CCK8細(xì)胞凋亡及增殖試劑盒均購自上海碧云天生物有限公司；流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；CFX96型熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建 BIU-8膀胱癌細(xì)胞以DMEM培養(yǎng)(含10%胎牛血清)，細(xì)胞至指數(shù)生長期時，消化并調(diào)整密度1×106個/ml，每孔200 μl接種至6孔板。細(xì)胞貼壁時，分別加入miR-Control慢病毒或miR-141抑制劑慢病毒，感染24 h，用含2 μg/ml嘌呤霉素培養(yǎng)基處理細(xì)胞，殺死未成功感染的細(xì)胞，存活的細(xì)胞分別命名為miR-141 KD組和miR-Control組。

1.4熒光定量PCR體系建立 膀胱癌組織和癌旁組織及miR-141 KD組和miR-Control組，以miRNA提取試劑盒提取組織或細(xì)胞總miRNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA。引物由上海生物工程有限公司合成，信息如下： miR-141-正義鏈:5′-ATCGGCGATCGCAACAGCCCA-3′;miR-141-反義鏈:5′-ATC GGT TTAAACAAGGTTCAGC-3′;U6正義鏈:5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′;U6反義鏈:5′-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3′。PCR條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃ 10 s，60 ℃ 30s，40個循環(huán)。以Bio-Rad熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行實驗，U6為內(nèi)參，計算組織或細(xì)胞miR-141 mRNA相對表達(dá)水平。

1.5EdU染色 胰酶消化miR-141 KD組和miR-Control組培養(yǎng)至指數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整密度為2×105個/ml，每孔200 μl接種于12孔板中，細(xì)胞貼壁后，將37℃預(yù)熱的2X的EdU工作液(20 μmol/L)，等體積加入6孔板，繼續(xù)孵育細(xì)胞120 min，EdU標(biāo)記細(xì)胞，去除培養(yǎng)液，加入1 ml 4%固定液室溫固定15 min，去除固定液，洗滌細(xì)胞，加入0.5 ml Click反應(yīng)液，混勻，室溫避光孵育30 min，去除炔烴+疊氮“點擊”Click反應(yīng)液，洗滌，Hoechst 33342溶液染核，洗滌，鏡下觀察細(xì)胞增殖。

1.6CCK8分析 同1.5步驟至細(xì)胞貼壁，分別于0、24、48和72 h加入20 μl CCK8試劑，孵育2 h后，檢測波長450 nm下的吸光度，每個時間點重復(fù)3次。

1.7細(xì)胞凋亡檢測 同1.5步驟至調(diào)整細(xì)胞密度為2×106個/ml，洗滌細(xì)胞，加入500 μl結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，加入5 μl Annexin V-FITC混勻，避光孵育10 min，洗滌游離染料，再加入5 μl PI，輕輕混勻，3 min后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.8雙熒光素酶報告基因 生物信息學(xué)預(yù)測miR-141靶基因可能是RUNX3。參考miR-30與RUNX3 3′-UTR的互補(bǔ)序列，設(shè)計缺失miR-141結(jié)合區(qū)域的突變體RUNX3 3′-UTR(RCAN1-Mut)及野生型RUNX3 3′-UTR(RCAN1-WT)序列，構(gòu)建熒光素酶報告載體。將RUNX3-Mut和RUNX3-WT熒光素酶報告質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到miR-141 KD組和miR-Control組，采用雙熒光素酶報告基因試劑盒檢測轉(zhuǎn)染48 h的熒光素酶活性。

1.9Western印跡 收集miR-141 KD組和miR-Control組，以蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液重懸，在冰上裂解30 min,于4℃ 15 000 r/min離心15 min，留取上清，用二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒對蛋白進(jìn)行檢測。將蛋白和緩沖液加入，99℃煮5 min使蛋白變性，進(jìn)行凝膠電泳十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上， 5%牛血清蛋白封閉1 h，將一抗RUNX3和Tubulin小鼠單克隆抗體1∶1 000稀釋后， 4℃下過夜孵育，PBST 洗滌3次，將二抗加入，室溫下反應(yīng)60 min，PBST洗滌3次，加入 ECL化學(xué)發(fā)光試劑，顯影拍照，以Tubulin蛋白為參考分析RUNX3相對表達(dá)量。

1.10統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1膀胱癌組織和膀胱癌細(xì)胞miR-141表達(dá) 與癌旁組織(1.05±0.22)比，膀胱癌組織中miR-141表達(dá)(2.21±0.20)顯著升高(t=40.546,P<0.05，n=108)。與miR-Control組(1.00±0.15)比，miR-141 KD組miR-141表達(dá)(0.31±0.13)顯著下調(diào)(t=6.021,P<0.05，n=3)。

2.2miR-141對細(xì)胞增殖的影響 與miR-Control組比，miR-141 KD組EdU陽性率顯著下調(diào)〔(10.26±1.25)% vs (6.95±1.36)%;t=3.103,P<0.0.5〕。與miR-Control組比，miR-141 KD組的增殖能力顯著下調(diào)(P<0.05)。見圖1和表1。

圖1 miR-141表達(dá)對膀胱癌細(xì)胞增殖的影響(Edu染色，×100)

2.3miR-141對膀胱癌細(xì)胞凋亡的影響 與miR-control組〔(5.12±0.98)%〕比，miR-141 KD組凋亡水平〔(33.41±6.15)%〕顯著增加(t=7.868,P<0.05)。見圖2。

2.4miRNA-141靶基因分析 采用生物信息學(xué)分析miR-141的靶基因，發(fā)現(xiàn)RUNX3可能靶點是miR-141，miR-141與RUNX3 3′-UTR存在7個堿基互補(bǔ)。miR-141 KD組轉(zhuǎn)染RUNX3-WT的細(xì)胞熒光素酶活性(1.01±0.14)顯著低于miR-control組熒光素酶活性(1.87±0.17，t=6.764,P<0.05)；miR-Control和miR-141 KD組轉(zhuǎn)染RUNX3-Mut的熒光素酶活性〔0.99±0.21 vs 1.01±0.14〕差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.137，P>0.05)。

2.5miR-141對RUNX3表達(dá)水平的影響 與miR-Control組RUNX3蛋白(1.06±0.18)比較，miR-141 KD組中RUNX3蛋白表達(dá)(2.21±0.35)顯著增加(t=5.061,P<0.05)。見圖3。

表1 miR-141表達(dá)對膀胱癌細(xì)胞增殖的影響

圖2 流式細(xì)胞術(shù)分析miR-141對細(xì)胞凋亡水平的影響

圖3 Western印跡分析miR-141對RUNX3表達(dá)水平的影響

3 討 論

微小RNA是一類非編碼單鏈RNA分子，參與動植物的轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控。miR-141作為眾多miRNA家族成員之一，其具有重要的生物學(xué)功能。目前研究顯示miR-141在胃癌、非小細(xì)胞肺癌、肝癌及乳腺癌中扮演著重要的角色，而且在不同的腫瘤組織中，miR-141的功能不盡相同，在某些腫瘤中是抑癌基因，在其他腫瘤中則為癌基因〔7～9〕。miR-141對膀胱癌的細(xì)胞生物學(xué)行為,特別是增殖和凋亡如何影響，及其分子機(jī)制目前研究尚少。本研究采用熒光定量PCR研究顯示在膀胱癌組織中miR-141表達(dá)水平顯著增加，提示miR-141在膀胱癌中可能扮演著癌基因角色。在膀胱癌細(xì)胞中通過慢病毒建立miR-141 KD的穩(wěn)定細(xì)胞系，體外細(xì)胞增殖實驗顯示miR-141沉默后顯著降低了膀胱癌細(xì)胞的增殖，可見miR-141具有促癌作用。此外，采用流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，miR-141沉默顯著增加了膀胱癌細(xì)胞的凋亡水平，也說明miR-141參與了細(xì)胞凋亡。

miRNA通過靶向下游靶基因3-UTR區(qū)域，進(jìn)而降解靶基因mRNA水平。生物信息學(xué)研究顯示RUNX3是miR-141的靶基因。RUNX3蛋白是轉(zhuǎn)錄生長因子β信號通路下游的轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β與RUNX3相互作用可導(dǎo)致Smad2和Smad3的激活，從而誘導(dǎo)相關(guān)目的基因咋細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和表達(dá)〔10,11〕。RUNX3作為抑癌基因，主要表現(xiàn)為跟基因在各種腫瘤組織標(biāo)本即細(xì)胞系中呈低水平表達(dá)，從而使信號通路異常，細(xì)胞抑制調(diào)節(jié)效應(yīng)失靈，細(xì)胞增殖明顯，而凋亡減少。研究顯示RUNX3高表達(dá)可上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白Bim的表達(dá)水平，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，達(dá)到抗腫瘤的效果〔12〕。本研究顯示，miR-141沉默可顯著增加RUNX3蛋白表達(dá)水平。RUNX3蛋白水平增加則誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制了細(xì)胞增殖。

本研究結(jié)果顯示，膀胱癌miR-141在膀胱癌組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，抑制了抑癌基因RUNX3蛋白的表達(dá)，降低了細(xì)胞凋亡，促進(jìn)了細(xì)胞增殖。本研究為膀胱癌治療提供了靶點和理論依據(jù)。