湯丹萍 程志剛 鄧少林

(武漢市中心醫(yī)院口腔科，湖北 武漢 430000)

舌鱗狀細(xì)胞癌是一種常見(jiàn)的頭頸部惡性腫瘤，其新發(fā)病例逐年增加，威脅著人類的健康和生命〔1,2〕。趨化因子配體(CCL)22是趨化因子組的成員之一，也稱為巨噬細(xì)胞來(lái)源的趨化因子(MDC)，由單核細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞表達(dá)〔3〕。它主要由單核細(xì)胞來(lái)源的M2巨噬細(xì)胞合成，屬于CC族趨化因子，CCR4是CCL22的受體，在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)和Th2細(xì)胞中表達(dá)，這在腫瘤治療中有一定的潛力〔4〕。據(jù)報(bào)道，CCL22在腫瘤微環(huán)境中的表達(dá)通過(guò)影響M1和M2樣巨噬細(xì)胞的平衡，導(dǎo)致舌鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后惡化〔5,6〕。CCL22對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的細(xì)胞表型變化和腫瘤生長(zhǎng)的影響尚未可知。miR-491-5p在多種癌癥中均出現(xiàn)表達(dá)失調(diào)〔7～10〕，但是miR-491-5p與CCL22在舌鱗狀細(xì)胞癌之間的關(guān)系尚未清楚。本研究旨在研究miR-491-5p對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)BALB/C裸鼠(18～20 g)30只，購(gòu)自湖南斯萊克實(shí)驗(yàn)生物有限公司，遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和倫理委員會(huì)章程對(duì)動(dòng)物進(jìn)行飼養(yǎng)和相關(guān)實(shí)驗(yàn)；人正?？谇唤琴|(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)NHOK、人舌癌細(xì)胞TCA8113、UM1、SCC1均購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心(ATCC)；杜氏培養(yǎng)基(DMEM)購(gòu)自Gibco；胎牛血清購(gòu)自Hyclone；噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自上海克拉瑪爾；LipofectamineTM2000購(gòu)自北京宜科思源科技有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海通蔚公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、聚偏氟乙烯(PVDF)膜購(gòu)自Roche；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)凋亡檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶公司；電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)公司；RIPA蛋白裂解液購(gòu)自BestBio；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)均用DMEM培養(yǎng)液(10%胎牛血清)進(jìn)行培養(yǎng)，條件為：37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞的分組 將正常培養(yǎng)的TCA8113細(xì)胞隨機(jī)分為miR-NC組、miR-491-5p組、anti-miR-NC組、anti-miR-491-5p組、si-NC組、si-CCL22組、miR-491-5p+pc DNA組、miR-491-5p+pc DNA-CCL22組。處理方法：將miR-NC、miR-491-5p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-491-5p、si-NC、si-CCL22、miR-491-5p mimics+pcDNA、miR-491-5p mimics+pc DNA-CCL22，按照LipofectamineTM2000試劑盒說(shuō)明書(shū)要求轉(zhuǎn)染至TCA8113細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6 h后，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染成功后，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3RT-qPCR實(shí)驗(yàn) 取適量需要檢測(cè)的細(xì)胞，用RNA抽提試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提取細(xì)胞的總RNA并合成cDNA，將其用RT-qPCR試劑盒進(jìn)行miR-491-5p、CCL22的檢測(cè)。結(jié)果以U6和GAPDH為內(nèi)參，2-△△Ct法檢測(cè)計(jì)算miR-491-5p、CCL22的表達(dá)。引物序列：miR-491-5p：上游引物GGAGTGGGGAACCCTTCC，下游引物GTGCAGGGTCCGAGGT；內(nèi)參U6：上游引物CTCGCTTCGGCAGCACA，下游引物AACGCTTCACGAATTTGCGT；CCL22上游引物：GGCACCTATCCAGTGCCACA，下游引物TGGTGGACCAGCCTGAAACTC；內(nèi)參GAPDH：上游引物TGTGTCCGTCGTGGATCTGA，下游引物TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG。

1.2.4Western印跡 取適量需要檢測(cè)的細(xì)胞或充分研磨的組織勻漿，用蛋白裂解液充分裂解，再用BCA定量試劑盒進(jìn)行定量，沸水浴變性后取上清進(jìn)行SDS-PAGE。電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，再將膜依次進(jìn)行脫脂奶粉(2.5%，2 h)封閉、一抗孵育(4℃，過(guò)夜)和二抗孵育(37℃，1.5 h)。結(jié)束后用ECL發(fā)光液進(jìn)行顯影曝光。結(jié)果以GAPDH為內(nèi)參，目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)。

1.2.5MTT實(shí)驗(yàn) 收集需要檢測(cè)的細(xì)胞，調(diào)至105個(gè)/ml，取100 μl接種至24孔板，每孔加入20 μl的MTT溶液，37℃孵育4 h，再加入150 μl的 DMSO，約2 min至完全溶解。設(shè)置酶標(biāo)儀波長(zhǎng)為490 nm，檢測(cè)細(xì)胞的吸光度(A)。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù) 將需要檢測(cè)的細(xì)胞用結(jié)合緩沖液懸浮，待用。按照Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)要求操作，加入Annexin V-FITC和PI，反應(yīng)20 min，盡快上流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析結(jié)果。

1.2.7雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 通過(guò)網(wǎng)站Target Scan(http://www.targetscan.org/)預(yù)測(cè)到miR-491-5p與CCL22之間存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)，為了驗(yàn)證這一預(yù)測(cè)，將CCL22 3′UTR-WT(含野生型CCL22 3′UTR片段)和CCL22 3′UTR-MUT(含突變的CCL22 3′UTR片段)熒光素酶報(bào)告載體，分別與miR-491-5p、miR-NC共轉(zhuǎn)染，按雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒技術(shù)手冊(cè)操作，記錄螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶激發(fā)值，以兩者的比值評(píng)價(jià)miR-491-5p與CCL22的結(jié)合力。

1.2.8裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn) 把SPF裸鼠分為control組、si-NC組和si-CCL22組，每組10只。用1 ml注射器吸取0.2 ml濃度為1×106個(gè)/ml的癌細(xì)胞，碘伏消毒后，裸鼠右前肢接種腫瘤，SPF環(huán)境下繼續(xù)飼養(yǎng)。接種后第3天開(kāi)始，每周1次測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)a(cm)和寬b(cm)，約第45天，腫瘤生長(zhǎng)已較大。斷頸法處死裸鼠，小心剝下瘤子，稱重。腫瘤體積的計(jì)算為V=a×b2×0.52(cm3)，取平均值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用PEMS3.2軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1miR-491-5p、CCL22在舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中的表達(dá) 與NHOK組相比，TCA8113組、UM1組、SCC1組舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中miR-491-5p mRNA表達(dá)明顯降低，CCL22 的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)均明顯升高(P<0.05)。其中TCA8113細(xì)胞的變化最大，故選用該細(xì)胞用于后續(xù)研究。見(jiàn)圖1，表1。

圖1 CCL22在舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中的蛋白表達(dá)

表1 miR-491-5p、CCL22在舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中的表達(dá)

2.2過(guò)表達(dá)miR-491-5p對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響 與miR-NC組相比，miR-491-5p組TCA8113細(xì)胞miR-491-5p mRNA表達(dá)顯著升高，在48、72 h時(shí)，細(xì)胞增殖顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高(均P<0.05)。見(jiàn)圖2，表2。

2.3miR-491-5p靶向CCL22 miR-491-5p的5′UTR端存在7個(gè)與CCL22的3′UTR端互補(bǔ)的核苷酸序列，見(jiàn)圖3。與miR-NC組相比，miR-491-5p組WT-CCL22細(xì)胞的熒光素酶活性明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)表3。與anti-miR-NC組CCL22蛋白(0.99±0.04)相比，anti-miR-491-5p組(2.01±0.14)顯著升高，與miR-NC組CCL22蛋白(1.00±0.66)相比，miR-491-5p組(0.38±0.01)顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖2 過(guò)表達(dá)miR-491-5p的舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡

表2 過(guò)表達(dá)miR-491-5p對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響

圖3 miR-491-5p與CCL22的靶向結(jié)合位點(diǎn)

表3 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4敲減CCL22對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響 與si-NC組相比，si-CCL22組TCA8113細(xì)胞CCL22蛋白表達(dá)明顯降低，在48、72 h時(shí)，細(xì)胞增殖明顯降低，細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)圖5，表4。

1～4：anti-miR-NC組，anti-miR-491-5p組，miR-NC組，miR-491-5p組

圖5 敲減CCL22的舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中CCL22蛋白表達(dá)

表4 敲減CCL22對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響

2.5敲減CCL22抑制裸鼠成瘤 與si-NC組相比，si-CCL22組腫瘤組織CCL22蛋白表達(dá)明顯降低，腫瘤質(zhì)量和體積也均明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)圖6，表5。

圖6 裸鼠成瘤中CCL22的蛋白表達(dá)

2.6過(guò)表達(dá)CCL22逆轉(zhuǎn)miR-491-5p對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用 與miR-491-5p+pc DNA組相比，miR-491-5p+pc DNA-CCL22組TCA8113細(xì)胞中miR-491-5p mRNA表達(dá)明顯降低，在48、72 h時(shí)，細(xì)胞增殖明顯升高，細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表6。

表5 敲減CCL22對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響

表6 過(guò)表達(dá)CCL22逆轉(zhuǎn)了過(guò)表達(dá)miR-491-5p對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、凋亡的調(diào)控

3 討 論

miRNA在各種腫瘤中的功能已得到國(guó)內(nèi)外的普遍認(rèn)可，包括頭頸部腫瘤〔11,12〕。Huang等〔13〕在口腔鱗狀細(xì)胞癌的研究中報(bào)道，miR-491-5p表達(dá)異常降低，與患者總體存活率低顯著相關(guān)，G蛋白耦聯(lián)受體激酶相互作用蛋白(GIT)1為miR-491-5p的靶標(biāo)，過(guò)表達(dá)miR-491-5p可抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移和侵襲，揭示miR-491-5p是口腔鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后的生物標(biāo)志物。Zheng 等〔14〕發(fā)現(xiàn)，miR-491-3p在耐藥舌癌中的表達(dá)水平顯著降低，過(guò)表達(dá)miR-491-3p可增強(qiáng)舌癌細(xì)胞對(duì)化學(xué)治療的敏感性，miR-491-3p可靶向抑制mTORC2成分Rictor，低水平的miR-491-3p與舌癌患者的預(yù)后不良相關(guān)，揭示miR-491-3p/mTORC2信號(hào)通路的靶向干預(yù)提供了理論基礎(chǔ)，增強(qiáng)化療對(duì)舌癌的敏感性。本研究說(shuō)明miR-491-3p對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的細(xì)胞表型有調(diào)控作用，為舌鱗狀細(xì)胞癌的診斷、治療提供新的生物標(biāo)志物；miR-491-3p在舌鱗狀細(xì)胞癌中的功能機(jī)制與CCL22關(guān)系密切，為探索miR-491-3p在舌鱗狀細(xì)胞癌中的調(diào)控機(jī)制提供參考。趨化因子是一種小的促炎趨化因子，在許多腫瘤相關(guān)的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和血管生成過(guò)程中發(fā)揮重要作用〔15,16〕。CCL22除了在先天免疫細(xì)胞活化和Th2中有腫脹效應(yīng)外，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中也有重要作用〔17〕。Kimura等〔6〕在舌鱗狀細(xì)胞癌的研究中報(bào)道，CCL22的表達(dá)量與癌癥的分級(jí)、患者總體存活率、CD8陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量和腫瘤惡性指數(shù)顯著相關(guān)，表明，CCL22在腫瘤微環(huán)境中的表達(dá)通過(guò)影響M1和M2樣巨噬細(xì)胞的平衡導(dǎo)致舌鱗狀細(xì)胞癌患者的預(yù)后惡化。本研究結(jié)果說(shuō)明CCL22的下調(diào)可抑制舌鱗狀細(xì)胞癌的惡化，提示CCL22抑制劑在抗舌鱗狀細(xì)胞癌中的巨大潛力。

綜上，miR-491-3p可抑制舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖和舌鱗狀細(xì)胞腫瘤的生長(zhǎng)，促進(jìn)凋亡，這與miR-491-3p靶向CCL22相關(guān)，為舌鱗狀細(xì)胞癌的靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。