王今越 王小虹 馮維斗

(1佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東 佛山 528000；2東北師范大學(xué)體育學(xué)院；3吉林省體育科研所)

運(yùn)動(dòng)是治療慢性病的良藥，在抑制和緩解炎癥、心血管病癥、胰島素抵抗、某些癌癥、免疫失調(diào)、神經(jīng)病變、增齡性認(rèn)知下降及肌肉流失等均有卓異表現(xiàn)，而熱量限制(CR)有類(lèi)似作用〔1～4〕。實(shí)踐中，二者并非總是單獨(dú)應(yīng)用，聯(lián)合實(shí)施模式早已廣泛應(yīng)用于國(guó)內(nèi)外中老年人減肥、2型糖尿病的控制〔1，5〕。而一些重量分級(jí)項(xiàng)目(格斗項(xiàng)目與舉重等)和騰躍技巧類(lèi)項(xiàng)目(體操、蹦床、跳水和花樣滑冰等)的運(yùn)動(dòng)員訓(xùn)練期中也要嚴(yán)格執(zhí)行CR來(lái)獲取競(jìng)賽規(guī)則及生物力學(xué)方面的優(yōu)勢(shì)〔6〕。盡管應(yīng)用如此廣泛，理論方面對(duì)運(yùn)動(dòng)+CR的了解并不深入，這不僅限制了該潛力模式的進(jìn)一步優(yōu)化，也忽視了其潛在的危險(xiǎn)。

肌肉健康是老年病學(xué)和運(yùn)動(dòng)學(xué)的關(guān)注熱點(diǎn)。運(yùn)動(dòng)+CR對(duì)肌肉的影響和機(jī)制報(bào)道很少〔7〕，迄今僅有幾個(gè)報(bào)道〔8～10〕研究很孤立，不能互相佐證，無(wú)法很好地解釋聯(lián)合模式在調(diào)控肌肉健康方面作用。

合成代謝是成體肌肉再生、修復(fù)與重塑的基礎(chǔ)。介導(dǎo)合成代謝的絲氨酸蘇氨酸激酶/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(Akt/mTOR)通路是影響肌肉健康的關(guān)鍵因素，對(duì)肌肉肥大和肌量維持有重要意義。機(jī)制上，Akt磷酸化Akt1底物(Akt1s1)，解除其對(duì)mTOR的抑制，促其激活下游的核糖體40 s小亞基S6蛋白激酶(p70S6K)最終啟動(dòng)mRNA 5′端的翻譯。mTORC也會(huì)活化并磷酸化重組人翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白(4E-BP)1，參與形成真核起始因子(eIF)4E復(fù)合物，啟動(dòng)翻譯并編碼細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白。規(guī)律的運(yùn)動(dòng)，特別是抗阻運(yùn)動(dòng)會(huì)激活該通路，介導(dǎo)肌肉生長(zhǎng)發(fā)育，而CR對(duì)Akt、mTOR的作用存在爭(zhēng)議〔1，11〕。本研究以此為切入點(diǎn)，調(diào)查Akt、mTOR在運(yùn)動(dòng)和(或)CR干預(yù)骨骼肌質(zhì)量中的作用。

1 材料和方法

1.1動(dòng)物和分組 清潔級(jí)雄性9 w、280～350 g wistar大鼠30只(吉大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SCXK吉2011-0004)，適應(yīng)性籠養(yǎng)3 d(全程獨(dú)籠飼養(yǎng))，期間自由進(jìn)食。稱重后(初始體重)，隨機(jī)分組。對(duì)照組(C 組):籠養(yǎng)8 w,自由進(jìn)食與飲水。 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組(T 組):自由進(jìn)食與飲水。 訓(xùn)練方案：前 3 d 為適應(yīng)性訓(xùn)練,首日與次日,3% 體重負(fù)荷(尾根部纏繞的鉛絲,以橡皮筋固定)、游泳 30 min,每天上午、下午各 1 次,第 3 日改為 6% ,其余同上。 從第 4 日至第 8 周結(jié)束為正式訓(xùn)練,8% 體重負(fù)荷、游泳約 60 min、每天 1 次、每周訓(xùn)練 6 d,周日休息。 游泳過(guò)程若出現(xiàn)力竭(水下10 s不能上浮),休息約2 min繼續(xù)訓(xùn)練。熱限組(R組):籠養(yǎng) 8 w,第 1 周前 4 d 按對(duì)照組上周平均進(jìn)食量 80% (即-20%)給食,隨后開(kāi)始按-40% 給食(每周按上一周對(duì)照進(jìn)食量均數(shù)校正),直到 8 w 結(jié)束。 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練+熱限組(T+R 組):訓(xùn)練方案同 T 組,飲食方案同 R 組。T和T+R組分配9只大鼠，各有2只無(wú)法完成訓(xùn)練方案淘汰，C、R組分配6只大鼠。全過(guò)程國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類(lèi)動(dòng)物常規(guī)飼料喂養(yǎng)、飼養(yǎng)環(huán)境為溫度23℃，濕度40%～60%、晝夜12 h光照、黑暗循環(huán)。每天下午六點(diǎn)提供食物。方案執(zhí)行首日為周一，塑鋼游泳池長(zhǎng)、寬、高為100 cm×50 cm×60 cm，水深50 cm，水溫保持在(31±2)℃。初始訓(xùn)練負(fù)荷以初始體重校正，其后以每周日重新稱重，校對(duì)下1 w負(fù)荷。

1.2樣本采集 為避免急性訓(xùn)練效果，所有樣本在最后1次訓(xùn)練結(jié)束36～48 h后采集。大鼠測(cè)量體重后，腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液(0.2 ml/100 g.bw)，麻醉后，以斷頸椎方式處死(處死前12 h禁食)，取右后腿，用4℃預(yù)冷的生理鹽水清洗，去除血污，濾紙吸干水分，稱重后切分成數(shù)段，錫箔紙包裹，做好標(biāo)簽，浸入液氮30 min后放入-80℃超低溫冰箱冷凍待測(cè)。

1.3主要試劑 Akt絲氨酸473磷酸化〔p-Akt (Ser473)〕抗體、p70S6K蘇氨酸389磷酸化〔p-p70S6K(Thr389)〕抗體，細(xì)胞信號(hào)公司(波士頓，美國(guó))，二抗及其他試劑，碧云天(南京，中國(guó))。

1.4Western印跡檢測(cè)肌肉蛋白含量 取50 mg腓腸肌放入小燒杯中，加入1 ml提前預(yù)冷的勻漿介質(zhì)〔210 mmol/L甘露醇，70 mmol/L蔗糖，5 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)，1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，0.1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)，0.5 mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)，10 mmol/L氟化鈉(NaF)，pH 7.5〕，剪碎肌組織，去除結(jié)締組織、脂肪等。電動(dòng)勻漿，轉(zhuǎn)速1 500～1 800 r/min，使組織勻漿化。勻漿液倒入離心管，12 000 g 4℃離心5 min；吸取上清即總蛋白樣品，BCA法測(cè)蛋白濃度，換算成單位重量肌肉蛋白含量?？贵w稀釋: p-Akt (Ser473) 1∶1 000:p-p70S6K(Thr389)1∶1 000。蛋白表達(dá)值為條帶的灰度值，以內(nèi)參微管蛋白(tubulin)校正。

1.5RT-qPCR 按照Trizol Reagent液說(shuō)明書(shū)提取總RNA。2 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄后執(zhí)行qPCR(ABI7500，美國(guó))，反應(yīng)使用協(xié)同熒光染料(SYBR-Green Master Mix，TaKaRa，中國(guó))，引物根據(jù)以往文獻(xiàn)設(shè)計(jì)〔12〕:成肌分化抗原(MyoD):正義鏈5′-CCTACTACAGTGAGGCGTCCA-3′，反義鏈5′-GTGGAGATGCGCTCCACTAT-3′(97 bp)；肌形成蛋白(MyoG):正義鏈5′-AGTGAATGCAACTCCCACA-3′，反義鏈5′-CGTAAGGGAGTGCAGGTTGT-3′ (129 bp)；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH):正義鏈5′-AGATGGTGAAGGTCGGAGTG-3′,反義鏈5′-GAAGGTCAATGAAGGGGTCA-3′ (117 bp)。PCR 條件：40循環(huán)95℃ 15 s，61℃(MyoD) 或60℃(MyoG)。GAPDH為內(nèi)參，相對(duì)表達(dá)量2-△△Ct。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS12.0進(jìn)行雙因素方差分析、SNK檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1肌肉質(zhì)量和蛋白含量 T組腓腸肌重量及蛋白含量顯著高于C組(P<0.05)；T+R組腓腸肌重量及蛋白含量顯著高于C組，但顯著低于T組(P<0.05)；R組腓腸肌重量及蛋白含量與C組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.2各組p-Akt、p-p70s6k、MyoD mRNA、MyoG mRNA、MyoD mRNA/MyoG mRNA比較 與C組比較，T組、R組、T+R組p-Akt顯著升高(P<0.05)，T組、T+R組p-Akt顯著高于R組(P<0.05)；與C組比較，T組、T+R組p-p70s6k、MyoD mRNA、MyoG mRNA顯著升高,R組顯著降低(P<0.05)，T組、T+R組p-p70s6k、MyoD mRNA、MyoG mRNA顯著高于R組(P<0.05)；T+R組p-p70s6k、MyoD mRNA、MyoG mRNA顯著低于T組(P<0.05)。與C組比較，T組、R組、T+R組MyoD mRNA/MyoG mRNA顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表1、圖1。

表1 各組腓腸肌的重量和蛋白含量及Akt、mTOR和生肌因子水平

圖1 各組p-Akt、p-p70s6k蛋白表達(dá)

3 討 論

骨骼肌質(zhì)量的改變(肥大或萎縮)影響著人體或動(dòng)物的整體運(yùn)動(dòng)能力和健康水平，訓(xùn)練(強(qiáng)度依賴性的)誘導(dǎo)肌肉肥大已有報(bào)道，而CR的作用則更為復(fù)雜——抑制衰老〔14，15〕、氧化應(yīng)激〔16〕誘發(fā)的肌肉萎縮，但對(duì)于正常成體肌肉的作用，是引起萎縮〔17〕與否〔8〕，報(bào)道并不一致。本研究顯示，CR不會(huì)降低肌肉量(以體重校正)，但會(huì)削弱了運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的肌肉肥大。從生物學(xué)意義和發(fā)展方向來(lái)看，運(yùn)動(dòng)的“前景”是“更強(qiáng)”，而CR的前景是“維持”，從需求來(lái)看，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練是“高能模式”，需要攝取更多熱量保持最強(qiáng)狀態(tài)，而CR進(jìn)入“省電模式”，減少維持生命之外的一切不必要的能量“開(kāi)銷(xiāo)”，故二者從需求、發(fā)展的方向上存在矛盾，這也導(dǎo)致了結(jié)果上的折中——聯(lián)合組肌肉量增長(zhǎng)的放緩?？紤]到炎癥誘發(fā)的脂肪填充、水腫會(huì)導(dǎo)致肌肉質(zhì)量虛高，本研究測(cè)試了肌肉蛋白含量，結(jié)果顯示，各處理組蛋白含量均未降低，排除上述誤判的可能。

Akt/mTOR通路在蛋白翻譯(上調(diào)翻譯起始和核糖體生物發(fā)生)中作用關(guān)鍵〔13〕。Akt在慢性訓(xùn)練后激活〔18～20〕，CR對(duì)Akt、mTOR的作用是降低與否存在爭(zhēng)議〔1，11〕，可能與CR強(qiáng)度、時(shí)間、采樣組織有關(guān)。本研究提示mTOR依賴性的蛋白翻譯對(duì)在3種肌肉質(zhì)量干預(yù)中都起重要作用。其中，CR組肌肉量改變與mTOR略有差異的原因可能是CR后分解代謝也在降低，部分抵消了mTOR的作用。Akt活性(p-Akt)的改變和mTOR不一致，在3個(gè)處理組均升高。Akt的改變可以解釋mTOR活性在運(yùn)動(dòng)后的上調(diào)，但無(wú)法解釋該指標(biāo)在CR后降低及“運(yùn)動(dòng)+CR”后升高減緩。這可能與mTOR的另一個(gè)重要調(diào)控劑AMPK負(fù)調(diào)控〔21〕有關(guān)，CR和運(yùn)動(dòng)均能夠激活A(yù)MPK〔22，23〕，3個(gè)處理組中，mTOR的波動(dòng)反映了AMPK、Akt的博弈，也因此，可能導(dǎo)致這與Akt同步性較弱。

生肌因子MyoD與MyoG在激活肌肉特異性基因轉(zhuǎn)錄(前者對(duì)應(yīng)快肌纖維基因、后者對(duì)應(yīng)慢肌纖維基因)中起關(guān)鍵作用，是主要生肌信號(hào)的效應(yīng)器〔24～26〕。二者比值是肌纖維的“快-慢”轉(zhuǎn)化的重要標(biāo)志〔24～26〕。本研究發(fā)現(xiàn)，改變趨勢(shì)，MyoD mRNA與MyoG mRNA二者均與p-p70s6k(mTOR激活標(biāo)志)一致，提示，各處理后mTOR依賴性的蛋白翻譯的改變至少部分要?dú)w因于MyoD 和MyoG 依賴性的基因轉(zhuǎn)錄的波動(dòng)。MyoD/MyoG在各處理組均降低，提示，運(yùn)動(dòng)、CR及“運(yùn)動(dòng)+CR”均使肌纖維發(fā)生“快-慢”的轉(zhuǎn)化。纖維類(lèi)型轉(zhuǎn)化方向標(biāo)志肌肉適應(yīng)的側(cè)重，快肌纖維收縮的力量大、速度快，慢肌纖維有氧代謝能力強(qiáng)、耐力強(qiáng)、更利于自身存活和組織健康〔25，27〕。本研究結(jié)果提示，慢性大強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)的作用是在快慢纖維同時(shí)發(fā)展基礎(chǔ)上，優(yōu)先發(fā)展慢肌纖維，即優(yōu)先改善耐力和生存，類(lèi)似情況的是“運(yùn)動(dòng)+CR”，差異僅是肌纖維增長(zhǎng)均有所減緩，而CR的效果則是在抑制快和慢肌纖維生長(zhǎng)基礎(chǔ)上，優(yōu)先保護(hù)慢纖維，即放棄力量和速度換取生存和耐力。

綜上，慢性CR不會(huì)降低肌肉質(zhì)量(以體重校正)，但會(huì)阻礙運(yùn)動(dòng)性肌肉肥大。mTOR介導(dǎo)的蛋白翻譯在運(yùn)動(dòng)、CR和二者聯(lián)合對(duì)肌量的調(diào)控中可能有關(guān)鍵作用，且生肌因子MyoD和MyoG 也參與了該調(diào)控的介導(dǎo)。CR未降低肌肉質(zhì)量可能是分解代謝降低部分抵消了合成代謝降低的效果。Akt在干預(yù)誘導(dǎo)的mTOR的改變中可能與AMPK負(fù)協(xié)同。運(yùn)動(dòng)、CR和二者聯(lián)合均讓肌肉向“慢”轉(zhuǎn)化，區(qū)別是，運(yùn)動(dòng)和聯(lián)合處理均是肌量增長(zhǎng)前提下的轉(zhuǎn)化，而CR是肌量基本保持不變下的轉(zhuǎn)化。條件所限，本文仍有一些問(wèn)題需要在未來(lái)解決：第一，因素之間的因果關(guān)系推論需要進(jìn)一步確認(rèn)(通過(guò)阻斷、激動(dòng)等方式)；第二，一些更直接指標(biāo)有待補(bǔ)充，如ATP的產(chǎn)量及肌纖維類(lèi)型轉(zhuǎn)化、細(xì)胞凋亡與自噬的組織學(xué)和形態(tài)學(xué)指標(biāo)等；第三，其他類(lèi)型肌肉反應(yīng)可能有差異，如比目魚(yú)肌(慢纖維為主)，有待研究。