溫淑珍 王娜娜 徐曉明 陳倩

(青島市中醫(yī)醫(yī)院(市海慈醫(yī)院) 1心內二科，山東 青島 266033；2干部保健科；3浙江省中醫(yī)院心內科)

臨床醫(yī)學將冠狀動脈急性、持續(xù)性供血、供氧不足而導致的機體心肌組織細胞壞死癥狀稱為急性心肌梗死，急性心肌梗死患者主要臨床表現(xiàn)為胸骨后持久、劇烈疼痛，嚴重威脅患者身體健康甚至生命安全〔1，2〕。近年來，我國急性心肌梗死發(fā)病率連年上升，引起廣大專家學者的關注〔3〕。臨床常用的治療急性心肌梗死的手段包括外科手術、溶栓治療、介入治療等，具有一定的治療效果，但是有研究表示，急性心肌梗死患者接受治療時，可能會出現(xiàn)心肌組織損傷程度更加嚴重的情況，臨床醫(yī)學將之稱為再灌注損傷〔4，5〕。再灌注損傷進一步加重患者心肌損傷嚴重程度，對患者預后造成嚴重威脅，因此減輕心肌細胞缺血再灌注損傷成為許多目前臨床研究熱點方向〔6，7〕。本研究中建立心肌細胞缺血再灌注損傷模型，靶向調控miR-208b-3p表達，旨在探究調控miR-208b-3p表達對心肌細胞缺血再灌注損傷的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1材料 研究細胞：H9c2心肌細胞株(中國醫(yī)學科學院)。主要試劑：小鼠抗兔miR-208b-3p抗體(BD公司)；小鼠抗大鼠Nemo樣激酶(NLK)抗體(Invitrogen公司)；大鼠抗小鼠過氧化氫酶(CAT)、晚期氧化蛋白產(chǎn)物(AOPP)抗體(Hyclone公司)；小鼠抗大鼠白細胞介素(IL)-17、IL-1β抗體(Sigma公司)；大鼠抗兔哺乳動物ATGb同源蛋白(Beclin-1)、微管相關蛋白1輕鏈(LC)3-Ⅱ抗體(Invitrogen公司)；兔抗大鼠磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)抗體(Gibco公司)；兔抗小鼠哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抗體(Selleck公司)。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2細胞分組處理 將H9c2心肌細胞株分為正常組、模型組、過表達組、沉默組，使用模型組、過表達組、沉默組細胞建立缺血再灌注損傷模型：將細胞接種于6孔板，添加DMEM高糖培養(yǎng)液2 ml(含胎牛血清)，使用37℃ CO2培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)，細胞壁長滿6孔板后將DMEM培養(yǎng)液去除，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次后添加2 ml培養(yǎng)液(不含血清)，將6孔板置于缺氧小盒內蓋上盒蓋，經(jīng)通氣孔輸注99%氮氣10 min，去除培養(yǎng)液后PBS清洗3次，再次添加DMEM高糖培養(yǎng)液2 ml(含胎牛血清)，5%CO2、37℃孵箱內培養(yǎng)120 min。

1.3慢病毒載體構建 miR-208b-3p上游引物序列：5′-GCATAAGAC-GAACAAAAG-3′；下游引物序列：3′-TGGAGCCT-GGGACGTG-5′。正反鏈混合后加入退火緩沖液，96℃反應4 min，冷卻，生成雙鏈。使用Eco31Ⅰ酶切線性化質粒pGenesil-1，100倍稀釋退火產(chǎn)物后與其連接，20℃水浴過夜，大腸桿菌DH5α轉化，次日選擇單克隆菌落，30 μg/ml Kana的LB培養(yǎng)液中接種，2 000 r/min離心，孵育過夜。模型組、過表達組、沉默組細胞重懸處理后分別加入4 μg生理鹽水、pcDNA3.1-miR-208b-3p、miR-208b-3p-siRNA，電擊后常溫保存2 h，培養(yǎng)箱內培養(yǎng)取出后添加含800 μg/ml G418的培養(yǎng)基再次培養(yǎng)。

1.4miR-208b-3p、NLK表達檢測 RT-PCR檢測miR-208b-3p、NLK表達。提取細胞總RNA，檢測RNA純度、含量，逆轉錄處理后獲得cDNA，使用Primer5.0軟件設計引物，采用2-△△Ct方法計算出需要檢測的miR-208b-3p、NLK表達量。

1.5酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測CAT、AOPP、IL-17、IL-1β 設置10個標準孔，設置1個空半空及若干待測樣品，在10 μl待測樣品中加入40 μl樣本稀釋液，封板膜封板，置于37℃水浴箱溫育30 min，清洗反應板5次，每次間隔30 s，拍干，在除空白孔以外的各孔中加入酶標液50 μl，封膜溫育30 min，清洗反應板5次，每次間隔30 s，拍干，在各孔中加入顯色A液、B液各50 μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光環(huán)境下顯色15 min，在反應孔內加入終止液50 μl/孔以終止反應，450 nm波長測量每孔吸光度，檢測CAT、AOPP、IL-17、IL-1β水平。

1.6細胞凋亡、周期分布檢測 TUNEL法檢測細胞凋亡，流式細胞術檢測細胞周期分布，觀察計算各組細胞凋亡率及細胞周期分布情況。

1.7Beclin-1、LC3-Ⅱ、PI3K、Akt、mTOR相對表達量檢測 使用Western印跡法檢測。提取50 μg蛋白，煮沸5 min使蛋白變性后用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后依據(jù)蛋白分子大小把凝膠切開并轉移至PVDF膜上，用Western封閉液把待測蛋白和內參蛋白封閉90 min在室內，按1∶1 000加到待測蛋白抗體，內參抗體以1∶2 000加入c-fos抗體，孵育過夜4C，使用Western洗滌液洗滌5次，每10 min 1次。按1∶5 000加入稀釋山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G，孵育60 min室溫水平搖床，洗滌5次Western洗滌液，每10 min 1次。經(jīng)過電化學發(fā)光(ECL)顯色和曝光后，進行BIO-RAD成像，使用Image J圖像分析系統(tǒng)檢測條帶的灰度值，以內參條帶灰度值與蛋白比值為結果統(tǒng)計分析。

1.8統(tǒng)計學處理 使用SPSS26.0軟件進行F檢驗、獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1miR-208b-3p、NLK表達比較 與正常組比較，模型組、過表達組、沉默組細胞miR-208b-3p表達較高，NLK表達較低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組、過表達組比較，沉默組細胞miR-208b-3p表達較低，NLK表達較高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2各組細胞氧化應激、炎癥反應比較 與正常組比較，模型組、過表達組、沉默組細胞CAT水平較低，AOPP、IL-17、IL-1β水平較高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組、過表達組比較，沉默組細胞CAT水平較高，AOPP、IL-17、IL-1β水平較低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

2.3各組細胞凋亡、周期分布情況比較 與正常組比較，模型組、過表達組、沉默組細胞各時間點凋亡率較高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組、過表達組比較，沉默組細胞各時間點凋亡率較低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與正常組比較，模型組、過表達組、沉默組細胞處于G1期的比例較低，處于S、G2期的比例較高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組、過表達組比較，沉默組G1期細胞比例較高，S、G2期比例較低，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。見表2。

表1 各組細胞miR-208b-3p、NLK表達氧化應激、炎癥反應比較

表2 各組凋亡、周期分布比較

2.4各組細胞自噬相關蛋白相對表達量比較 與正常組比較，模型組、過表達組、沉默組細胞Beclin-1、LC3-Ⅱ相對表達量較高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組、過表達組比較，沉默組細胞Beclin-1、LC3-Ⅱ相對表達量較低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3、圖1。

表3 各組細胞自噬相關蛋白相對表達量比較

圖1 細胞自噬相關蛋白表達

2.5各組細胞PI3K/Akt通路蛋白相對表達量比較 與正常組比較，模型組、過表達組、沉默組細胞PI3K、Akt、mTOR相對表達量較低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組、過表達組比較，沉默組細胞PI3K、Akt、mTOR相對表達量較高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4、圖2。

表4 各組細胞PI3K/Akt通路蛋白相對表達量比較

圖2 PI3K/Akt通路蛋白表達

3 討 論

心血管疾病是臨床最常見的致死病因，急性心肌梗死是臨床常見的心血管疾病，具有發(fā)病率高、治療難度大、病死率高的特點〔8，9〕。介入、溶栓等再灌注療法是臨床常用的治療急性心肌梗死的手段，再灌注治療雖具有一定的臨床療效，但可能會出現(xiàn)再灌注損傷，嚴重威脅患者預后〔10，11〕。氧化應激、細胞凋亡、自噬、壞死等均是心肌細胞缺血再灌注損傷的危險因素，減輕再灌注損傷對阻斷心肌細胞凋亡、維持心功能、改善患者預后具有重要意義〔12〕。

miRNA具有特異性、穩(wěn)定性、保守性等特點，與組織細胞增殖、侵襲、分化等生物學行為密切相關。miR-208b-3p是miRNA家族的重要成員，其表達變化與細胞凋亡能力變化具有密切聯(lián)系〔13〕。NLK為miR-208b-3p靶基因，是Wnt信號通路的重要組成因子，其表達變化與細胞凋亡密切相關〔14〕。本文研究結果顯示，沉默miR-208b-3p表達的再灌注損傷細胞NLK表達上調，出現(xiàn)這一研究結果的原因可能是NLK為miR-208b-3p靶基因，沉默miR-208b-3p表達能夠靶向調控NLK表達，從而對心肌細胞缺血再灌注損傷起到一定的保護作用。

有研究表示，機體心肌細胞的存活情況與機體抗氧化能力、炎癥反應密切相關〔15，16〕。隨著再灌注損傷的發(fā)生，Ca2+內流，細胞活性氧增多，活性氧具有促進細胞自噬的作用，因此抗氧化能力強弱與細胞自噬具有密切聯(lián)系。CAT是機體防御系統(tǒng)的重要酶類清除劑，能夠清除過氧化氫，減輕細胞損傷。AOPP是常用的體現(xiàn)機體氧化應激反應嚴重程度的產(chǎn)物。IL-17、IL-1β水平變化與炎癥反應密切相關。本文研究結果顯示，沉默miR-208b-3p表達的再灌注損傷細胞CAT、AOPP、IL-17、IL-1β受到明顯調控，說明沉默miR-208b-3p表達能夠提升心肌細胞缺血再灌注損傷后抗氧化能力，減輕氧化應激損傷、炎癥反應嚴重程度，從而起到減輕細胞損傷的作用。

細胞凋亡、周期分布與心肌細胞缺血再灌注損傷密切相關，有學者在研究中表示，心肌細胞再灌注損傷發(fā)生時，伴隨著嚴重的心肌細胞凋亡情況〔17〕。細胞周期分布在再灌注損傷發(fā)生發(fā)展過程中也起到重要作用，有研究表示，阻滯細胞周期分布能夠抑制細胞凋亡〔18〕。本文研究結果顯示，沉默miR-208b-3p表達的再灌注損傷細胞凋亡率較低，G1期細胞比例較高，說明沉默miR-208b-3p表達能夠阻滯細胞周期分布，抑制心肌細胞凋亡，出現(xiàn)這一研究結果的原因可能與調控細胞自噬、凋亡蛋白表達有關。

細胞自噬與再灌注損傷具有密切聯(lián)系，細胞自噬具有一定的保護細胞的作用，但是，再灌注狀態(tài)下，過度細胞自噬會使細胞損傷嚴重程度加重。Beclin-1、LC3-Ⅱ是細胞自噬標志物，常用于細胞自噬情況的檢測〔19，20〕。PI3K/Akt信號通路相關蛋白P13K、Akt、mTOR蛋白表達變化與細胞凋亡能力密切相關，靶向調控PI3K/Akt信號通路蛋白表達，能夠對細胞增殖、凋亡能力進行干預〔21，22〕。本文研究結果顯示，沉默miR-208b-3p表達的再灌注損傷細胞Beclin-1、LC3-Ⅱ表達下調，PI3K、Akt、mTOR表達上調，說明沉默miR-208b-3p表達能夠通過調控自噬相關蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ及凋亡相關蛋白PI3K、Akt、mTOR表達，抑制再灌注損傷細胞自噬、凋亡，從而對心肌細胞缺血再灌注損傷起到一定的保護作用。

綜上所述，沉默miR-208b-3p表達能夠減輕缺血再灌注損傷心肌細胞氧化應激損傷、炎癥反應，抑制心肌細胞凋亡、自噬，阻滯細胞周期分布，其機制可能為沉默miR-208b-3p表達能夠調控自噬蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ及細胞凋亡通路PI3K/Akt相關蛋白表達，從而減輕心肌細胞缺血再灌注損傷程度，為心肌缺血再灌注損傷的治療提供新的研究方向。