劉明明 殷濤

(赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院普外二科，內(nèi)蒙古 赤峰 024000)

肝缺血再灌注損傷(HIRI)常并發(fā)于肝部分切除術(shù)、肝移植等很多的肝外科手術(shù)中，它是各種機(jī)制相互作用對(duì)肝細(xì)胞造成損害，進(jìn)而導(dǎo)致肝功能受損，最終造成肝衰竭，嚴(yán)重影響患者預(yù)后〔1～3〕。缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α是一種在低氧條件下發(fā)揮作用的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在常氧條件下HIF-1α被降解而表達(dá)很少，在低氧條件下HIF-1α被激活而大量表達(dá)，研究證實(shí)，HIF-1α在調(diào)整細(xì)胞凋亡中起重要作用〔4～6〕。二甲基乙二酰甘氨酸(DMOG)是脯氨酸羥化酶的抑制劑，通常采用此方法來穩(wěn)定HIF-1α的表達(dá)。本研究利用大鼠肝缺血再灌注(HIR)模型，向大鼠體內(nèi)注入黃芪注射液及DMOG進(jìn)行預(yù)處理，觀察大鼠HIRI后生化指標(biāo)、免疫組化表達(dá)、凋亡情況及肝細(xì)胞形態(tài)變化，進(jìn)而探討黃芪對(duì)大鼠HIRI的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物與分組 雄性SD大鼠96只購于赤峰學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重(220±20)g，隨機(jī)分為4組：假手術(shù)(Sham)組、缺血再灌注(IR)組、黃芪(AG)組和AG+DMOG組，各組按再灌注1、6、12、24 h分為不同的時(shí)間點(diǎn)。

1.2主要試劑 AG注射液生產(chǎn)于成都地奧九泓藥業(yè)有限公司(批號(hào)：Z51021775)。HIF-1α免疫組化試劑盒是由上海市雅吉生物科技提供。HIF-1α引物是由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TOYOBO公司。B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司。TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自上海前塵生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1建立動(dòng)物模型 建立大鼠HIRI模型采用Pingle法。實(shí)驗(yàn)大鼠術(shù)前12 h禁食，不限飲水，稱體重。麻醉采用腹腔內(nèi)注射的方法。IR組：麻醉起效后，常規(guī)備皮，消毒鋪巾，切口選取上腹部正中切口，分離出Treitz韌帶，用血管夾阻斷肝門，造成70%HIR模型，40 min后移走血管夾恢復(fù)血流，實(shí)驗(yàn)前1 w開始每天自尾靜脈緩慢注射1次3.0 ml生理鹽水；Sham組：游離出肝十二指腸韌帶，不阻斷肝門；AG組：按10 g/kg比例用生理鹽水將AG稀釋到3.0 ml，再灌注前1 w開始每日自尾靜脈注入1次(注藥時(shí)間同IR組)。AG+DMOG組：按AG組比例，AG注射液與穩(wěn)定劑DMOG(40 mg/kg)一起用生理鹽水稀釋到3.0 ml，再灌注前1 w開始自尾靜脈注入1次(注藥時(shí)間同IR組)。

1.3.2標(biāo)本取材 各組在再灌注后各時(shí)間點(diǎn)分別對(duì)各時(shí)間點(diǎn)的大鼠心腔采2 ml血，移至離心管靜止后離心、提血清，再置于-20℃冰箱保存待測(cè)；各組大鼠在HIR6h隨機(jī)取1只大鼠的1塊左葉肝組織約60 mg，立即放入凍存管保存于液氮中；另取2塊修成1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm大小，迅速置于甲醛溶液中固定；再修成2塊約0.1 cm×0.1 cm×0.1 cm大小，并快速固定于3%戊二醛中。

1.4指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1肝生化指標(biāo)測(cè)定 取血清1 ml用生化分析儀測(cè)大鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平。

1.4.2免疫組化及結(jié)果判定 按HIF-1α免疫組化試劑盒操作說明書步驟操作，陰性對(duì)照采用磷酸鹽緩沖液(PBS)。HIF-1α的陽性表達(dá)為胞核/胞質(zhì)內(nèi)呈棕黃色顆粒。應(yīng)用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，光鏡下每張切片隨機(jī)取6個(gè)視野，分別計(jì)各視野中陽性細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算陽性細(xì)胞率(即陽性細(xì)胞數(shù)/視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù))。

1.4.3RT-PCR檢測(cè)HIF-1α表達(dá) 采用Oligo6 和Primer5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物，HIF-1α上游引物序列：5′-TACTGCAGCAACCAGGTG-3′，下游引物序列：5′-ACAGAAACGAAACCCCAC-3′；β-actin上游引物序列：5′-CTGTCCCTGTATGCCTC-3′，下游引物序列：5′-ATGTCACGCACGATTT-3′。從液氮中取出肝組織塊，參照Trizol試劑盒說明書操作，應(yīng)用分光光度法測(cè)總RNA純度和含量；按Taraka試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；擴(kuò)增；利用Eagle Eye型圖像分析系統(tǒng)觀察電泳的結(jié)果，測(cè)HIF-1α擴(kuò)增帶的OD值，用β-actin的OD值作為參照，從而得到HIF-1α和β-actin的OD值相對(duì)比值。

1.4.4Bax和Bcl-2蛋白測(cè)定 將切取的左肝部分組織加9倍量生理鹽水，用勻漿機(jī)制成10%肝勻漿，按試劑盒說明書分別采用ELISA測(cè)定肝勻漿中Bax和Bcl-2的含量。

1.4.5凋亡檢測(cè) 采用TUNEL法行肝組織切片細(xì)胞凋亡的原位檢測(cè)，具體步驟按試劑盒說明書操作。陽性結(jié)果判定：在光鏡下觀察到細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色顆粒的細(xì)胞即為凋亡細(xì)胞，各標(biāo)本的組織切片隨機(jī)選取5個(gè)400倍視野，從而算出凋亡細(xì)胞在平均每100個(gè)細(xì)胞中的存在比例，即凋亡指數(shù)(AI)。

1.4.6電鏡觀察 取出固定于戊二醛的小塊肝組織，按電鏡操作步驟進(jìn)行，最后觀察、攝片。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行方差分析及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組血清AST、ALT水平比較 各組AST、ALT水平比較：IR組>AG組>AG+DMOG組>Sham組(均P<0.05)。見表1。

表1 各組灌注后不同時(shí)間點(diǎn)血清AST、ALT水平比較

2.2各組HIF-1α mRNA和蛋白表達(dá)水平比較 各組肝缺血后再灌注各時(shí)間點(diǎn)HIF-1α mRNA及蛋白比較：Sham組

圖1 各組肝細(xì)胞再灌注6 h HIF-1α的表達(dá)(SP法，×200)

表2 各組再灌注后不同時(shí)間肝組織HIF-1α mRNA和蛋白表達(dá)水平比較

2.3各組Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較 各組肝組織Bcl-2、Bax蛋白比較：IR組>AG組>AG+DMOG組>Sham組(均P<0.05)。見表3。

表3 各組再灌注后不同時(shí)間肝組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平比較

2.4各組肝細(xì)胞AI水平比較 肝臟凋亡細(xì)胞核被染成棕褐色，各組肝細(xì)胞AI水平：IR組>AG組>AG+DMOG組>Sham組(均P<0.05)。見圖2，表4。

圖2 各組肝細(xì)胞再灌注6 h凋亡情況(TUNEL，×400)

表4 各組再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)肝細(xì)胞AI比較

2.5各組肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化 HIR 6 h后，在電鏡下觀察肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)：Sham組細(xì)胞內(nèi)線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列規(guī)則，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清楚；IR組細(xì)胞內(nèi)線粒體明顯腫脹、嵴結(jié)構(gòu)斷裂，且有很大部分空泡變性，有很大一部分細(xì)胞核核膜結(jié)構(gòu)消失，還有一部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴(kuò)張，其上的核糖體有很明顯的脫落；AG組有部分線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)略腫脹，排列尚可，細(xì)胞核核膜結(jié)構(gòu)相對(duì)清楚；AG+DMOG 組僅有很少的線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)略微腫脹，排列也較規(guī)則，核膜結(jié)構(gòu)非常清楚。見圖3。

2.6Pearson相關(guān)性分析 AG組和AG+DMOG組HIF-1α表達(dá)與Bcl-2蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.784，0.803；均P<0.001)。

圖3 各組肝細(xì)胞再灌注6 h超微結(jié)構(gòu)(×15 000)

3 討 論

缺血再灌注對(duì)大鼠肝臟造成了很大的打擊，而AG預(yù)處理在大鼠HIRI中發(fā)揮了重要的保護(hù)作用。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可看出，HIRI導(dǎo)致大鼠肝酶學(xué)指標(biāo)(ALT、AST)明顯升高，且對(duì)大鼠肝臟造成的損傷在HIRI早期(6 h)最為嚴(yán)重，本研究結(jié)果表明AG對(duì)大鼠HIRI有很好的保護(hù)作用，另外，因DMOG是HIF-1α的穩(wěn)定劑，故可推斷AG可能通過調(diào)節(jié)HIF-1α對(duì)HIRI起保護(hù)作用。HIRI是一個(gè)涉及多階段、多因素的復(fù)雜病理生理過程，目前認(rèn)為它與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)〔7～11〕。Bcl-2是參與HIRI過程中的一個(gè)重要的細(xì)胞凋亡抑制因子，主要表達(dá)產(chǎn)物定位在線粒體、核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，它可通過表達(dá)Bcl-2蛋白抑制促凋亡基因的信號(hào)傳遞等發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用。Bax/Bcl-2是一對(duì)凋亡與抗凋亡的基因表達(dá)的蛋白，二者表達(dá)的平衡結(jié)果將決定細(xì)胞的凋亡狀態(tài)〔12，13〕。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程的主要分子是Bax二聚體；在Bcl-2存在時(shí)，它優(yōu)先與Bax形成異二聚體，使細(xì)胞中游離的Bax形成二聚體從而促進(jìn)凋亡過程。本研究結(jié)果表明細(xì)胞凋亡參與了HIRI，AG可以通過抗細(xì)胞凋亡對(duì)HIRI起保護(hù)作用，而AG+DMOG組效果更好，這也說明AG通過抗細(xì)胞凋亡來減輕HIRI是通過HIF-1α的參與實(shí)現(xiàn)的。

HIF-1是一種能與促紅細(xì)胞生成素(EPO)基因結(jié)合的核轉(zhuǎn)錄因子〔14〕。HIF-1由α和β兩個(gè)亞基組成的DNA結(jié)合性蛋白分子。HIF-1α受氧分壓的調(diào)控，在常氧條件下，HIF-1α在脯氨酸羥化酶作用下被蛋白酶體降解，半衰期約5 min；在低氧條件下，HIF-1α的降解受到抑制，以至于HIF-1α表達(dá)增加，進(jìn)而激活下游多種靶基因而發(fā)揮生物學(xué)作用。目前研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α在輕度低氧(1%～3%)情況下發(fā)揮抑制凋亡作用，而當(dāng)重度低氧(0.0%～0.5%)環(huán)境中大量表達(dá)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔15，16〕。本研究結(jié)果表明AG是通過上調(diào)HIF-1α表達(dá)對(duì)早期大鼠HIRI起保護(hù)作用。