鄭帥 楊敏 白彝華 肖明鮮 張馨心 馬麗 胡紹蘭

(昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科，云南 昆明 650101)

糖尿病腎臟疾病(DKD)是糖尿病(DM)最重要的并發(fā)癥之一〔1〕。目前已成為終末期腎臟病(ESRD)的主要發(fā)病原因〔2〕。已有研究發(fā)現(xiàn),1型DM和2型DM發(fā)病均與機(jī)體免疫狀態(tài)異常有關(guān)。T細(xì)胞浸潤導(dǎo)致的胰島β細(xì)胞功能受損可誘導(dǎo)1型DM的形成,而2型DM則與免疫及炎癥反應(yīng)引起的胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞分泌功能減退有關(guān)，并可能是疾病持續(xù)性進(jìn)展的關(guān)鍵〔3〕。有報道,DKD發(fā)病前數(shù)年患者體內(nèi)就有炎癥反應(yīng)增強(qiáng)的跡象〔4〕。盡管機(jī)制不清,但多數(shù)學(xué)者認(rèn)為,炎癥反應(yīng)在DKD微血管病變、動脈硬化及與此相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中起到了關(guān)鍵作用。目前證實,機(jī)體在環(huán)境和基因雙重因素的作用下,免疫過度激活和持續(xù)的炎癥狀態(tài)可引起血糖升高、腎纖維化及血流動力學(xué)改變〔5〕。

上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是DKD的主要病理表現(xiàn)，它是腎纖維化的一個重要的過程也是機(jī)體免疫過度激活的重要表現(xiàn)。EMT參與腎纖維化的發(fā)展主要包括兩個方面：一方面通過改變上皮細(xì)胞基因蛋白的表達(dá)譜，下調(diào)上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白如 E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、角蛋白、閉鎖蛋白的表達(dá)，上調(diào)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白如波形蛋白(vimentin)、纖維連接蛋白、成纖維細(xì)胞特異蛋白(FSP-1)、α-平滑肌肌動蛋白(SMA)的表達(dá)。同時，α-SMA 在腎臟的表達(dá)水平可以反映腎間質(zhì)纖維化的嚴(yán)重程度；另一方面，間質(zhì)細(xì)胞被激活后分泌的大量基質(zhì)蛋白等細(xì)胞因子參與細(xì)胞外基質(zhì)的合成，促使細(xì)胞外基質(zhì)異常積聚和增多，進(jìn)一步促進(jìn)腎纖維化的發(fā)展〔6～8〕。研究表明〔9〕，EMT在腎臟疾病中發(fā)揮著重要作用，而干預(yù)EMT則能有效改善腎臟纖維化。而這一病理過程包含一系列的信號通路和多種細(xì)胞因子。Snail通路被認(rèn)為是介導(dǎo)EMT和其他細(xì)胞纖維化的一條重要通路，也是機(jī)體免疫過度應(yīng)激的一種重要表現(xiàn)。一些細(xì)胞學(xué)研究證明〔10〕，Snail因子會導(dǎo)致上皮細(xì)胞丟失黏附因子并出現(xiàn)機(jī)體免疫異常，最終導(dǎo)致EMT。因此，Snail1是DKD進(jìn)展的關(guān)鍵。

本研究旨在探討毛蕊花糖苷在延緩腎功能惡化中的免疫機(jī)制。高糖誘導(dǎo)腎病模型是經(jīng)典研究模型之一，被廣泛應(yīng)用于由于DKD引起機(jī)體過度免疫應(yīng)激而造成的腎纖維化的研究當(dāng)中。本研究通過STZ誘導(dǎo)大鼠引發(fā)DKD模型探討并證實毛蕊花糖苷是否存在延緩腎纖維化及抑制過度免疫應(yīng)激的作用。

1 材料與方法

1.1DKD大鼠模型的建立 體重150～200 g的SD大鼠35只，隨機(jī)分組。在適應(yīng)環(huán)境3 d后隨機(jī)分為5組：①C組：對照組(n=7)，②DKD組(n=7)，③A-1組:DKD+毛蕊花糖苷低劑量組(100 mmol/L，n=7)，④A-2組：DKD+毛蕊花糖苷中劑量組(150 mmol/L，n=7)，⑤A-3組：DKD+毛蕊花糖苷高劑量組(200 mmol/L，n=7)。其中除C組外給予STZ，STZ給藥方法參照文獻(xiàn)〔11〕。STZ誘導(dǎo)組大鼠給予高脂飼料飼養(yǎng)4 w后，給予STZ溶液(35 mg/kg)腹腔注射3 d，末次注射72 h后，尾靜脈采血測空腹血糖，2次空腹血糖超過16.7 mmol/L為造DM模型成功，留取正常組與造模組大鼠24 h尿液檢測24 h尿蛋白定量。毛蕊花糖苷粉用生理鹽水溶解，予以大鼠腹腔注射，1次/d，連續(xù)5 d，末次注射后20 d后處死大鼠，戊巴比妥麻醉后處死大鼠，取外周血，腎組織進(jìn)行下一步檢測。

1.2Western印跡 取適量蛋白上清沸水煮變性。每孔上樣30 μg蛋白，marker上樣5 μl，濃縮膠電壓90 V，30 min；分離膠電壓120 V，60 min。測量觀察膠的大小，將濾紙放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中。將聚偏氟乙烯(PVDF)膜做好標(biāo)記后，然后轉(zhuǎn)移至轉(zhuǎn)膜緩沖液中。轉(zhuǎn)膜60 min。將轉(zhuǎn)膜結(jié)束的膜取出，置于事先配置好的封閉液中〔5%脫脂奶粉(1g脫脂奶粉+20 ml TBST)〕。封閉結(jié)束后，用TBST，室溫漂洗3次。將一抗用稀釋劑稀釋，用TBST洗液洗膜3次。將二抗用稀釋劑稀釋。用TBST洗膜3次。顯色，曝光。

1.3免疫組化步驟 切片脫蠟，后磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，隨后按選好的免疫組織化學(xué)染色方法進(jìn)行染色。然后PBS洗3 min×3次。每張切片加一抗、二抗。顯色、蘇木素復(fù)染和分化，最后脫水、封片。

1.4RT-PCR檢測腎組織中α-SMA，Snail1的表達(dá) 應(yīng)用TrizolRNA提取液提取腎組織中總RNA；采用HiScript?Ⅱ Reverse Transcriptase(Vazyme公司)試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄，依據(jù)Vazyme公司熒光定量試劑盒-ChamQTM SYBR?qPCR Master Mix操作進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：2× ChamQ SYBR qPCR混合物：10 μl；PCR上游引物(10 μmol/L，生工)：0.4 μl;PCR下游引物(10 μmol/L，生工)：0.4 μl；50× ROX Reference Dye：0.4 μl；Template DNA：2 μl；無核酸酶水：至20 μl，所用引物序列如下：a-SMA上游：ACTGGGACGACATGGA-AAAG，下游：CATCTCCAGAGTCCAGCACA；Snail1下游：AGCCCA-ACTATAGCGAGCTG，下游：CCAGGAGAGAGT CCCAGATG。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1毛蕊花糖苷對大鼠的新陳代謝及生化指標(biāo)的作用 與C組相比，DKD組血肌酐、24 h尿蛋白明顯增高，A-1組、A-2組、A3組后血肌酐、24 h尿蛋白較DKD組明顯下降(均P<0.05)。與C組相比，DKD組血糖明顯升高(P<0.05)，而與DKD組相比，A-1組、A-2組、A3組血糖差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 大鼠新陳代謝及相關(guān)生化指標(biāo)

2.2毛蕊花糖苷通過下調(diào)α-SMA表達(dá)對大鼠腎小管的作用 與C組比較，DKD組α-SMA蛋白和RNA水平明顯增高；A-1組、A-2組、A-3組與DKD組比較，α-SMA蛋白和mRNA水平顯著降低,且濃度越高表達(dá)水平越低(均P<0.05)。見表2，圖1，圖2。

表2 各組α-SMA mRNA和蛋白表達(dá)水平比較

圖1 Western印跡檢測各組大鼠的α-SMA蛋白

2.3毛蕊花糖苷通過抑制Snail1表達(dá)對大鼠腎小管的作用 與C組相比，DKD組Snail1蛋白及mRNA水平明顯升高；A-1組、A-2組、A-3組Snail1蛋白及mRNA水平較DKD組明顯降低(P<0.05)。見圖3、表3、圖4。

圖2 各組α-SMA免疫組化(DAB，×100)

圖3 Western印跡檢測各組大鼠的Snail1蛋白

表3 各組Snail1 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較

圖4 各組Snail1免疫組化(DAB，×100)

3 討 論

由于生活方式和飲食的改變，DM事件的發(fā)生率正逐年增長，現(xiàn)在大約有7%的中國成年人是糖尿病患者，數(shù)量約為1.14億人，在患DM 10～20年的患者，近1/3的人將發(fā)展為DKD〔12，13〕。DKD的發(fā)病機(jī)制及其進(jìn)行性腎損害的機(jī)制至今尚未完全明了。目前，DKD考慮與血糖代謝紊亂、腎血流動力學(xué)異常、高血壓、免疫、遺傳等多種因素有關(guān)。DM患者因長期高血糖易造成微血管內(nèi)皮病變,引發(fā)腎實質(zhì)缺血、缺氧,導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激增強(qiáng),誘發(fā)大量炎癥因子釋放,引發(fā)血管炎癥反應(yīng)。過度免疫應(yīng)激可導(dǎo)致免疫復(fù)合物沉積、腎小球濾過功能降低,導(dǎo)致小管EMT,最終導(dǎo)致腎臟損傷。而腎小球硬化是多種原因?qū)е履I小球損傷和病變的共同結(jié)局,也是腎功能衰竭的主要病理基礎(chǔ)。炎癥和免疫功能異常可導(dǎo)致、加重腎臟損傷,導(dǎo)致DKD的發(fā)生〔11〕。及時采取有效的措施降低機(jī)體炎癥反應(yīng),減少尿白蛋白,保護(hù)腎臟功能是臨床治療DKD的關(guān)鍵。毛蕊花糖苷，又名麥角甾苷、毛蕊花苷，有較好的藥用歷史和基礎(chǔ)。它是一種以β葡萄糖為母核的含有酯酰及氧苷鍵的天然糖苷，是咖啡酸和羥基酪醇與糖苷連接的一部分，且擁有廣泛的藥理活性，如腎功能的保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗細(xì)胞凋亡等作用〔14〕。因此，本研究評估了在STZ誘導(dǎo)的DKD大鼠中毛蕊花糖苷的治療作用及其中可能的免疫機(jī)制。

相關(guān)研究表明，腎臟組織中α-SMA是活化的成纖維細(xì)胞的常用蛋白標(biāo)志物，α-SMA陽性的肌成纖維細(xì)胞是主要的基質(zhì)合成細(xì)胞〔15〕。在正常腎臟組織中，α-SMA在動脈平滑肌細(xì)胞中表達(dá)，它是平滑肌細(xì)胞的標(biāo)志蛋白，是間質(zhì)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為α-SMA的肌成纖維細(xì)胞關(guān)鍵。它是腎間質(zhì)成纖維的關(guān)鍵，也是導(dǎo)致腎纖維化的重要機(jī)制。因此，α-SMA可以作為腎間質(zhì)纖維化嚴(yán)重程度的重要參考指標(biāo)。而在DKD組中α-SMA明顯增加，說明DKD會導(dǎo)致腎間質(zhì)中成纖維細(xì)胞被大量活化，繼而導(dǎo)致腎纖維化。本研究可以觀察到DKD大鼠腎組織Snail1蛋白激活。相關(guān)報道提示〔16〕，細(xì)胞外基質(zhì)增生和腎小管損傷的進(jìn)展與Snail1通路有關(guān)。Snail 超家族具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，由Snail1(Snail)，Snail2(Slug)和Snail3(Smuc)組成，在誘導(dǎo)EMT、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞生存等方面具有關(guān)鍵作用〔17〕。Snail1及其下游的信號通路對于腎臟EMT發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。Snail1可以誘導(dǎo)間充質(zhì)、侵襲相關(guān)基因表型FN的表達(dá)，與此同時它是重要的E-cadherin轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)抑制基因，可以通過下調(diào)其他表皮分子，如緊密連接蛋白、閉合蛋白及附膜蛋白，抑制E-caherin的表達(dá)，最終參與EMT的調(diào)節(jié)。Snail1能夠下調(diào)中胚層和中外胚層的基因表達(dá)，在結(jié)合E-cadherin基因的啟動子區(qū)，抑制上皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)，誘導(dǎo)上皮細(xì)胞彼此遷移，轉(zhuǎn)變?yōu)殚g充質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)而通過EMT促進(jìn)中胚層的形成〔18〕。此外，補體系統(tǒng)參與DKD的發(fā)生發(fā)展，在DKD病理損傷過程中起重要作用，高糖誘導(dǎo)腎組織中C3aR、C5aR增高，導(dǎo)致EMT進(jìn)而出現(xiàn)腎臟纖維化伴炎細(xì)胞浸潤〔19〕。毛蕊花糖苷可以通過降低Snail從而降低DKD的補體中的C3aR及C5aR。Li等〔20〕發(fā)現(xiàn)，Snail1過表達(dá)抑制了小管上皮細(xì)胞的E-cadherin、胎盤鈣黏素(P-cadherin)及足細(xì)胞的腎病蛋白(Nephrin)的表達(dá)。Boutet等〔21〕通過體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，成年轉(zhuǎn)基因小鼠的Snail1活化可以誘導(dǎo)EMT發(fā)生和腎的纖維化。Wettstein等〔22〕研究發(fā)現(xiàn)，熱休克蛋白(HSP)27可以與Snail結(jié)合并導(dǎo)致EMT的發(fā)生。Adeshara等〔23〕的實驗表明通過Snail1通路激活導(dǎo)致的細(xì)胞改變符合細(xì)胞EMT的改變。Snail1在2型DM患者腎組織中高表達(dá)，可能參與了DKD發(fā)生、發(fā)展過程。多種信號通路參與了Snail1介導(dǎo)的EMT〔24〕。Snail1通路是干預(yù)DKD腎纖維化的節(jié)點也是重要的藥物靶點。本研究結(jié)果表明毛蕊花糖苷對DKD引起的腎臟纖維化有較好的療效。