劉震坤 張兆鵬 胡博 白金萍 郭軍鵬

(1吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130021；2長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué))

骨質(zhì)疏松(OP)是由激素失調(diào)、營(yíng)養(yǎng)不良、免疫功能紊亂、遺傳等引起的骨退行性疾病，但究竟何種因素是主要原因及其作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究證實(shí)〔1〕。因此，OP已被WHO列為三大老年病之一。治療原則是早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防、早治療，盡量避免骨折等嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生。早期發(fā)現(xiàn)與預(yù)防及發(fā)病后的綜合性治療是OP防治的關(guān)鍵〔2〕?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)OP病因、發(fā)病機(jī)制和治療進(jìn)行了大量研究，但防治效果仍不理想〔3〕。OP的癥狀和體征與中醫(yī)“骨痿”“骨枯”“骨痹”等描述比較相似，主要由腎精虧虛、脾胃虛弱等引起，治則以補(bǔ)腎、填精、益髓為根本〔4～7〕。人參是補(bǔ)虛中藥典型代表，臨床常用其強(qiáng)身健體、延緩衰老。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，篩選人參有效成分和抗OP靶點(diǎn)基因，構(gòu)建人參抗OP靶點(diǎn)基因和其編碼蛋白的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖，富集分析了人參有效成分治療OP的核心靶點(diǎn)基因及信號(hào)通路，為人參的現(xiàn)代化研究與開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1人參中有效成分的篩選和靶點(diǎn)的預(yù)測(cè) 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析和預(yù)測(cè)平臺(tái)(TCMSP)檢索“人參(Ginseng)”，以口服利用度(OB)>30%，藥物類藥性(DL)>0.18為篩選條件，對(duì)人參有效成分進(jìn)行篩選。然后借助TCMSP在線藥物成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)和Perl語言，對(duì)人參主要成分的作用靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用UniProt數(shù)據(jù)庫對(duì)篩選出的有效靶點(diǎn)進(jìn)行基因名的添加。如果在數(shù)據(jù)庫中找不到相應(yīng)的靶點(diǎn)基因名，則視為不存在或無效靶點(diǎn)。

1.2獲取OP靶點(diǎn)基因 在GeneCards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫檢索“Osteoporosis(骨質(zhì)疏松)”，整理所得疾病靶點(diǎn)相關(guān)基因，得到OP靶點(diǎn)基因。

1.3人參靶點(diǎn)基因與OP靶點(diǎn)基因交集 通過R語言軟件獲得中藥-OP共同靶點(diǎn)基因，結(jié)果以Venn圖呈現(xiàn)。

1.4人參-OP靶點(diǎn)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 借助Perl語言映射人參-OP共同靶點(diǎn)基因，應(yīng)用Cytoscape可視化軟件得到人參-OP調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，其中各個(gè)節(jié)點(diǎn)包括人參、人參有效成分、人參靶點(diǎn)基因、OP靶點(diǎn)基因、人參-OP共同靶點(diǎn)基因。

1.5構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖 通過STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建人參-OP靶點(diǎn)基因編碼蛋白與其他蛋白相互作用的網(wǎng)絡(luò)(PPI)。利用R語言處理STRING數(shù)據(jù)庫所得文件，得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)相關(guān)核心基因的條形圖，同時(shí)獲得核心靶點(diǎn)基因名稱。

1.6GO和KEGG通路富集分析 用R語言將中藥-疾病共同靶點(diǎn)基因進(jìn)行處理計(jì)算，通過DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO富集分析，對(duì)共同靶點(diǎn)基因從位置、功能和參與生物學(xué)過程等方面進(jìn)行分類和闡釋，靶點(diǎn)基因參與的生物學(xué)過程以坐標(biāo)氣泡圖呈現(xiàn)。KEGG通路富集分析結(jié)果取P<0.05前Top20的信號(hào)通路。

2 結(jié) 果

2.1人參有效成分及相關(guān)靶點(diǎn)篩選 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索，根據(jù)OB和DL參數(shù)篩選人參主要有效成分，共計(jì)22種，見表1。

2.2中藥靶點(diǎn)基因和疾病靶點(diǎn)基因交集 由Venn圖得到4 659個(gè)疾病相關(guān)靶點(diǎn)基因，52個(gè)中藥相關(guān)靶點(diǎn)基因，共同作用靶點(diǎn)基因34個(gè)。

2.3中藥-疾病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 用Cytoscape可視化軟件可得到中藥疾病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1。八邊形代表OP，箭頭代表中藥人參，六邊形代表人參的有效成分，圓形代表人參-OP共同靶點(diǎn)基因。

表1 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選人參主要有效成分

圖1 中藥-疾病-靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

2.4人參-OP靶點(diǎn)基因編碼蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析 PPI中與其他節(jié)點(diǎn)聯(lián)系較多的節(jié)點(diǎn)，即是核心靶點(diǎn)基因蛋白。條形圖顯示主要有：絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)8、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)3、RELA基因、細(xì)胞間黏附分子(ICAM)1、細(xì)胞色素P450超家族(CYP)基因等，見圖2、3。

圖2 人參治療OP的靶點(diǎn)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

2.5GO富集分析 GO富集分析GO富集顯示人參治療骨質(zhì)疏松核心靶點(diǎn)基因在生物活性方面主要集中在：有機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)、細(xì)胞死亡的調(diào)節(jié)(包括凋亡等)；在細(xì)胞成分方面主要集中在細(xì)胞質(zhì)中的成分；在細(xì)胞核功能方面主要集中在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性方面，見圖4。

圖3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)核心基因條圖

圖4 GO富集坐標(biāo)氣泡圖

2.6KEGG通路富集分析 人參治療OP的信號(hào)通路主要涉及：腫瘤壞死因子(TNF)信號(hào)通路、核因子(NF)-κB信號(hào)通路、癌癥相關(guān)信號(hào)通路、乙型肝炎相關(guān)信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、化學(xué)致癌相關(guān)信號(hào)通路、弓形蟲NOD樣受體信號(hào)通路等，見圖5和6。

圖5 KEGG功能富集分析柱狀圖

圖6 KEGG富集氣泡圖

3 討 論

本研究從TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選獲得人參治療OP的有效活性成分22個(gè)，人參-OP共同作用靶點(diǎn)基因34個(gè)，其中核心靶點(diǎn)基因有MAPK家族基因、CYP家族基因、caspase-3基因、RELA基因、ICAM1基因等，GO和KEGG Pathway富集分析發(fā)現(xiàn)這些基因主要通過TNF信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、癌癥相關(guān)信號(hào)通路等信號(hào)通路影響核受體活性、類固醇激素受體活性、肽鏈內(nèi)切酶活性而影響OP的發(fā)生和發(fā)展。TNF-α與其受體結(jié)合通過多條信號(hào)通路參與細(xì)胞生理功能的調(diào)節(jié)〔8〕。TNF-α對(duì)骨代謝具有雙向調(diào)節(jié)作用，主要取決于TNF-α濃度和應(yīng)答反應(yīng)的細(xì)胞所處分化階段。TNF-α與RANKL能夠通過不同信號(hào)通路激活NF-κB而促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化和成熟。TNF-α通過抑制Runx2和成骨細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子、上調(diào)Smurf1表達(dá)而抑制成骨細(xì)胞與前體細(xì)胞的分化和成熟〔9〕。有研究表明，低濃度TNF-α能夠誘導(dǎo)BMSCs中BMP-2的表達(dá)，加快成骨細(xì)胞的產(chǎn)生，提高堿性磷酸酶(ALP)水平而促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的礦化，對(duì)OP的治療起促進(jìn)作用〔10〕。MAPK是成骨細(xì)胞分化的正調(diào)節(jié)因子，能夠增強(qiáng)ALP的表達(dá)，促進(jìn)骨組織鈣化。MAPK信號(hào)通路還能夠激活成骨細(xì)胞分化必需因子Runx2的表達(dá)而促進(jìn)骨形成〔11〕。

綜上，人參有效成分治療OP并不是通過單一基因或者單一信號(hào)通路的作用，而是多個(gè)基因和多個(gè)信號(hào)通路共同作用的結(jié)果。本研究篩選和富集了人參治療OP可能的靶基因和信號(hào)通路，為今后研究人參治療OP提供新的方向和思路。