秦冰 李莉 劉芳翡 胡亞瓊

(1河南醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，河南 鄭州 451191；2河南醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科)

老年失眠是臨床常見(jiàn)的老年睡眠障礙，炎癥反應(yīng)是其主要危險(xiǎn)因素之一，而引起失眠的主要因素有生理因素、疾病因素、精神因素、心理社會(huì)因素、環(huán)境因素、藥物因素等。老年失眠是導(dǎo)致抑郁的重要因素，最終可能會(huì)導(dǎo)致大腦認(rèn)知功能損傷，對(duì)老年人身心健康造成威脅，使其生活質(zhì)量下降，不良結(jié)局發(fā)生率升高〔1,2〕。因此早期診斷和治療對(duì)于降低老年失眠發(fā)生率十分重要。多種微小RNA(miRNA)參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)。研究表明，miR-155能影響腦脊髓炎小鼠輔助性T細(xì)胞亞群(Th)1和Th17細(xì)胞分化，從而改變炎癥因子表達(dá)水平，影響腦脊髓炎病程〔3〕。miR-147作為miR家族中重要一員，更能參與炎癥反應(yīng)〔4〕。Th在機(jī)體免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)中都能發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用〔5〕。其中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群(Treg)與Th17有相互拮抗的生理功能，因此炎癥反應(yīng)發(fā)生在機(jī)體內(nèi)時(shí)，Treg/Th17比例會(huì)發(fā)生變化〔6〕。miR-147、Treg/Th17與老年失眠炎癥反應(yīng)都有一定聯(lián)系，但目前關(guān)于兩者在老年失眠患者血清中表達(dá)水平相關(guān)性的研究較少。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)失眠老人血清中miR-147、Treg/Th17水平，探討miR-147與Treg/Th17水平失衡的關(guān)系，為老年失眠的預(yù)防和評(píng)估提供重要依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年3月至2019年7月因失眠于河南醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校附屬醫(yī)院接受治療的86例老年失眠患者(失眠組)，納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合中國(guó)睡眠研究會(huì)提出的《中國(guó)失眠癥診斷和治療指南》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)〔7〕；②年齡≥60歲；③近1個(gè)月內(nèi)未服用中藥治療者；④臨床資料齊全者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他疾病所致的繼發(fā)性失眠者；②伴有肝、腎、肺等臟器功能不全者；③有風(fēng)濕類(lèi)疾病、其他心肺疾病及精神異常者；④有藥物濫用史患者。本試驗(yàn)經(jīng)河南醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，受試對(duì)象均由專(zhuān)業(yè)人員詳細(xì)告知家屬研究?jī)?nèi)容并自愿參加，并簽署知情同意書(shū)。其中男41例，女45例；年齡60～83歲，平均(71.13±6.17)歲，體重指數(shù)(24.15±1.24)kg/m2；同期選取84例健康體檢老人作為對(duì)照(對(duì)照組)，其中男37例，女47例；年齡60～82歲，平均(70.96±7.35)歲，體重指數(shù)(24.26±1.35)kg/m2。兩組一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

收集患者入院時(shí)一般資料，如性別、年齡、體重指數(shù)(BMI)及匹茲堡睡眠質(zhì)量指數(shù)量表(PSQI)評(píng)分〔8〕，其中該表有19個(gè)自評(píng)及5個(gè)他評(píng)項(xiàng)目，最低分0分，最高分21分，分?jǐn)?shù)高代表睡眠質(zhì)量差。

1.2主要試劑與儀器 RNA提取試劑盒(批號(hào)：DP419)購(gòu)自北京天根生化有限公司；AceQ qPCR SYBR? Green Mix試劑(批號(hào)：Q111-02)購(gòu)自南京vazyme生物公司；miScript SYBR? Green qPCR試劑盒(批號(hào)：330504)購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司；固定破膜劑(Fix&Perm)(批號(hào)：GAS-003)、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的鼠抗人干擾素(IFN)-γ單克隆抗體(批號(hào)：BSA-0851)、藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的鼠抗人白細(xì)胞介素(IL)-4單克隆抗體(批號(hào)：LS-C7854)均購(gòu)自美國(guó)Beckman公司。Bio-Rad iQ5型實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；FACSCalibur型流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.3樣品采集及保存 抽取兩組老人清晨空腹靜脈血，3 000 r/min離心15 min后收集血清，離心半徑8 cm，置于-80℃保存，待測(cè)。

1.4qRT-PCR法檢測(cè)血清中miR-147水平 采用qRT-PCR檢測(cè)兩組血清中miR-147水平。RNA提取試劑盒提取血清總RNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA。采用qRT-PCR儀對(duì)miR-147進(jìn)行擴(kuò)增。qRT-PCR體系共10 μl：miScript SYBR? Green Mix 5 μl，cDNA(50 ng/μl)1μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μl，ddH2O 3.0 μl。反應(yīng)條件：95℃，5 min；95℃、15 s，58℃、20 s，40個(gè)循環(huán)；72℃，10 min。miR-147及內(nèi)參U6的引物序列：miR-147正向引物:5′-AAACATGGAGCAGCCACACATC-3′，反向引物：5′-TCGAGATGTGTGGCTGCTCCATGTTT-3′；U6：正向引物:5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′,反向引物：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。采用2-ΔΔCt法對(duì)血清miR-147表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血清中Treg/Th17水平 RPMI1640〔不含小牛血清(FBS)〕培養(yǎng)基等體積稀釋100 μl血清，加入刺激劑10 μl，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～6 h?；靹颍尤隒D8-PC7和CD3-PC5各10 μl，室溫下避光孵育15 min；加入100 μl Fix&Perm中的固定液，室溫避光孵育15 min；加入3 ml PBS，1 200 r/min離心5 min，離心半徑10 cm，棄上清。每管中加入 100 μl Fix&Perm中的破膜和溶血液，各管加入IFN-γ-FITC和IL-4-PE 10 μl，室溫下避光孵育15 min。每管中加入3 ml PBS，1 200 r/min離心5 min，離心半徑10 cm，棄除上清；0.5 ml PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。每個(gè)樣本每次檢測(cè)1×104個(gè)細(xì)胞。

1.6血清炎性因子水平檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)兩組血清中IL-6、C-反應(yīng)蛋白(CRP)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1、IL-17水平，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、Pearson分析、Logistic回歸分析。

2 結(jié) 果

2.1兩組PSQI評(píng)分比較 兩組失眠組PSQI評(píng)分顯著高于對(duì)照組〔(15.46±3.24)分vs(5.27±1.14)分；t=27.224,P<0.05〕。

2.2兩組血清中miR-147、Th17、Treg及Treg/Th17水平比較 失眠組血清中miR-147、Th17、Treg及Treg/Th17水平均顯著高于對(duì)照組(P<0.001)。見(jiàn)表1。

表1 兩組血清中miR-147、Th17、Treg及Treg/Th17水平比較

2.3兩組血清炎性因子水平比較 失眠組IL-6、CRP、TGF-β1、IL-17水平均顯著高于對(duì)照組(P<0.001)。見(jiàn)表2。

表2 兩組血清炎性因子水平比較

2.4失眠老人血清中miR-147與Treg/Th17的相關(guān)性 失眠老人血清中miR-147與Treg/Th17水平呈正相關(guān)(r=0.536，P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 失眠老人血清中miR-147與Treg/Th17水平的相關(guān)性

2.5失眠老人血清miR-147、Treg/Th17與血清炎性因子水平相關(guān)性 失眠老人血清miR-147、Treg/Th17與IL-6、CRP、TGF-β1、IL-17水平均呈正相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 失眠老人血清miR-147、Treg/Th17與血清炎性因子水平相關(guān)性

2.6影響老人失眠的多因素分析 將老人是否發(fā)生失眠作為因變量，以miR-147、Treg/Th17、IL-6、CRP、TGF-β1、IL-17、PSQI評(píng)分為自變量進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示miR-147、Treg/Th17、IL-6是影響老人失眠的危險(xiǎn)因素。見(jiàn)表4。

表4 影響老人失眠的多因素分析

3 討 論

失眠指盡管有充足時(shí)間入睡，但仍存在持續(xù)難以入睡或睡眠質(zhì)量下降并使日間功能受損的各類(lèi)行為，其中炎癥反應(yīng)在其病情發(fā)展中有重要作用〔9〕。老年人失眠癥發(fā)病率遠(yuǎn)高于年輕人，且老年患者長(zhǎng)期失眠會(huì)出現(xiàn)思維能力下降、妄想、抑郁、緊張等嚴(yán)重精神障礙，并導(dǎo)致中樞神經(jīng)受損〔10～12〕。因此，尋找預(yù)測(cè)老年失眠傾向標(biāo)志物，是今后待解決的問(wèn)題。

許多miR是酪氨酸蛋白激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK/STAT)抗炎途徑中重要調(diào)控因子，而miR-147與此途徑中重要轉(zhuǎn)錄因子NF-κB有密切聯(lián)系〔13〕。miR-147可通過(guò)調(diào)控某些炎性細(xì)胞因子水平，激發(fā)炎癥反應(yīng)，同時(shí)導(dǎo)致抗炎反應(yīng)和促炎反應(yīng)處于動(dòng)態(tài)失衡，進(jìn)而影響老年人睡眠狀態(tài)〔14〕。林秋偉等〔15〕檢測(cè)分析心肌梗死患者血清中miR-147，miR-214等含量，探討其對(duì)病變程度及預(yù)后情況的判斷價(jià)值，最終得出結(jié)論：miRNA可能通過(guò)調(diào)節(jié)炎性因子的表達(dá)來(lái)參與疾病發(fā)生和病情發(fā)展。本研究提示老年失眠患者血清中miR-147水平高于健康老人，miR-147可能通過(guò)在失眠老人血清中高表達(dá)來(lái)影響某些炎性因子的表達(dá)，進(jìn)一步參與失眠的發(fā)生發(fā)展。

Th17和Treg是T細(xì)胞亞型中重要細(xì)胞，參與機(jī)體免疫反應(yīng)，而免疫反應(yīng)通常與炎癥反應(yīng)密切聯(lián)系〔16，17〕。有研究表明，Treg/Th17細(xì)胞平衡比例變化與神經(jīng)炎癥反應(yīng)有關(guān)，進(jìn)一步可能會(huì)引發(fā)失眠病癥。姜立剛等〔18〕通過(guò)對(duì)帕金森病患者外周血Treg/Th17水平進(jìn)行檢測(cè)分析，探討Treg/Th17平衡與相關(guān)細(xì)胞因子含量變化的意義，結(jié)果證明患者外周血中Treg/Th17水平失衡，且這種失衡與帕金森病神經(jīng)炎癥反應(yīng)可能有關(guān)。本研究結(jié)果提示失眠老人血清中Th17、Treg水平均升高，血清中Treg/Th17處于嚴(yán)重失衡狀態(tài)，從而引發(fā)炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步加重老人失眠病癥，老年失眠患者體內(nèi)炎癥水平相較于健康老人升高，miR-147、Treg/Th17相互作用影響老年失眠患者血清炎性因子IL-6、CRP、TGF-β1、IL-17水平，從而影響失眠，miR-147、Treg/Th17、IL-6水平變化影響失眠的發(fā)生，且隨三者水平升高，失眠發(fā)生概率也升高。

綜上所述，老年失眠患者血清中miR-147與Treg/Th17水平呈正相關(guān)，miR-147在血清中的表達(dá)水平對(duì)Treg/Th17狀態(tài)失衡有關(guān)。臨床上應(yīng)密切關(guān)注miR-147、Treg/Th17在老年失眠患者血清中的水平，以便及時(shí)做出正確的診斷方法并可及時(shí)治療。但哪些人群對(duì)失眠有易感性，miR-147因子水平是否和失眠易感性人群有關(guān)，都有待進(jìn)一步研究。