林臘梅 鄧丹芳 孫龍 王小琴

(1湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430074；2湖北省中醫(yī)院腎內(nèi)科 湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 湖北省中醫(yī)藥研究院)

隨著社會(huì)人口老年化的發(fā)展，研究如何延緩衰老及防治衰老伴隨的疾病已成為一個(gè)重要問題。自1997年一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)一種參與人體抑制衰老的基因Klotho以來，Klotho基因及其產(chǎn)物已被發(fā)現(xiàn)在保護(hù)腎臟及心腦血管，改善認(rèn)知功能障礙，抗腫瘤，調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、礦物質(zhì)代謝等方面發(fā)揮重要作用〔1～8〕。近幾年來國內(nèi)也有大量關(guān)于Klotho相關(guān)研究的報(bào)道，但面對(duì)海量的文獻(xiàn)逐一閱讀耗時(shí)耗力，選擇性閱讀又具有片面性、客觀性。Citespace是美籍華裔陳超美教授開發(fā)的一款多元、分時(shí)、動(dòng)態(tài)的可視化分析軟件，通過合理巧妙的空間布局，將科學(xué)發(fā)展歷程、研究熱點(diǎn)展示在圖譜上，各知識(shí)單元間的共現(xiàn)聚類分析來了解科學(xué)知識(shí)的結(jié)構(gòu)、規(guī)律和分布情況〔9〕。本文通過Citespace分析我國關(guān)于Klotho相關(guān)研究的發(fā)展過程、研究熱點(diǎn)及趨勢，可為我國廣大研究者提供研究方向。

1 資料與方法

1.1選擇數(shù)據(jù)庫 中國知網(wǎng)。檢索條件：因Klotho被翻譯為克老素，故檢索主題詞為：Klotho OR 克老素；檢索時(shí)間為建庫時(shí)間至2019.6.11。

1.2Excel轉(zhuǎn)換 納入的文獻(xiàn)經(jīng)自定義導(dǎo)出，導(dǎo)出格式的xls，利用Excel進(jìn)行發(fā)文趨勢、項(xiàng)目基金支持情況及發(fā)表期刊分析。

1.3Refworks轉(zhuǎn)換 文獻(xiàn)經(jīng)Refworks導(dǎo)出，導(dǎo)出格式為的 download_***.txt，利用CitespaceV進(jìn)行作者、機(jī)構(gòu)、關(guān)鍵詞的可視化分析。

2 結(jié) 果

2.1文獻(xiàn)總量及文獻(xiàn)來源情況 共收集文獻(xiàn)783篇，排除不符合主題、數(shù)據(jù)不全、會(huì)議通知等文獻(xiàn)，共納入554篇，其中期刊359篇，碩博論文182篇，會(huì)議13篇。

2.2發(fā)文趨勢 國內(nèi)關(guān)于Klotho相關(guān)研究的文獻(xiàn)2001～2019年發(fā)文量分別為：1篇、0篇、1篇、1篇、1篇、7篇、6篇、15篇、11篇、34篇、28篇、24篇、32篇、58篇、60篇、54篇、98篇、87篇和26篇，中國知網(wǎng)中關(guān)于Klotho相關(guān)研究的文獻(xiàn)最早發(fā)表于2001年，2001～2005年年發(fā)文量較少(≤1篇)。2006年后發(fā)文量呈逐漸上升趨勢，最高峰在2017年，年發(fā)文量達(dá)98篇(17.7%)。2019年文獻(xiàn)只收集到6月11日，故不能判斷2019年發(fā)文量下降。

2.3基金支持情況 納入文獻(xiàn)未受基金支持文獻(xiàn)為306篇(55.2%)。受基金支持的文獻(xiàn)248篇(44.8%)，支持基金中以國家自然科學(xué)基金為主，文獻(xiàn)量為105篇(19%)。其他發(fā)文量≥3篇的項(xiàng)目基金分別為黑龍江省教育廳科技項(xiàng)目、四川省科技計(jì)劃項(xiàng)目、國家臨床重點(diǎn)專科建設(shè)項(xiàng)目、云南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目、常州市社會(huì)發(fā)展基金資助項(xiàng)目、湖北省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目、江蘇省衛(wèi)生計(jì)生委面上科研課題、科技部“973計(jì)劃”項(xiàng)目子課題資助項(xiàng)目、陜西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目、四川省衛(wèi)計(jì)委課題。其他為發(fā)文量<3篇的基金項(xiàng)目，發(fā)文量為104篇(18.8%)。

2.4發(fā)表期刊 納入文獻(xiàn)共發(fā)表于167種期刊，發(fā)文量最多的期刊為中國老年學(xué)雜志(31篇)。其次依次為山東醫(yī)藥(10篇)、重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(9篇)、中國動(dòng)脈硬化雜志(9篇)、腎臟病與透析腎移植雜志(8篇)、中華老年心腦血管雜志(7篇)、中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志(7篇)、醫(yī)學(xué)綜述(7篇)、重慶醫(yī)學(xué)(6篇)、中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)(5篇)、中國血液凈化(5篇)、中國全科醫(yī)學(xué)(5篇)、西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)(5篇)、實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志(5篇)、南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版本)(5篇)、江蘇醫(yī)藥(5篇)。發(fā)文量≤4篇期刊發(fā)文總量425篇，占總文獻(xiàn)量的76.7%。

2.5可視化分析

2.5.1圖譜判讀 圖譜中的節(jié)點(diǎn)大小表示作者、機(jī)構(gòu)發(fā)表文獻(xiàn)的數(shù)量，節(jié)點(diǎn)之間的連線反應(yīng)合作強(qiáng)度。平均輪廓值(Mean Silhouette)大于0.5認(rèn)為聚類是合理的，大于0.7聚類是高效的；網(wǎng)絡(luò)模塊度(Modularity)大于0.3被認(rèn)為是可信服的〔10〕。

2.5.2作者分析 納入的文獻(xiàn)經(jīng)5.3R4版CitespaceV處理，參數(shù)設(shè)置：時(shí)間切片(Time Slicing)：因文獻(xiàn)最早發(fā)表于2001年，故時(shí)間設(shè)置為2001～2019年，每2年為1個(gè)時(shí)間切片；文本處理(Text Processing)：默認(rèn)設(shè)置；節(jié)點(diǎn)類型(Node Types)：作者(Author)；提取節(jié)點(diǎn)閾值(Selection Criteria)：修剪選項(xiàng)(Top50 per slice；Pruning)：關(guān)鍵路徑(Pathfinder)、修剪合并后網(wǎng)絡(luò)(Pruning the merged network)，余設(shè)置為默認(rèn)設(shè)置。

高產(chǎn)作者在一定程度上代表相關(guān)領(lǐng)域主要研究者及團(tuán)隊(duì)核心人物。經(jīng)Citespace處理，納入的作者(發(fā)文量≥2篇)共243人，發(fā)文量≥8篇的作者共10位，占總納入作者的4.1%。發(fā)文量最高的是來自重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院的馬厚勛(22篇)。高產(chǎn)作者中馬厚勛、田小春(10篇)、吳平(13篇)、劉曉林(10篇)來自重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，其余為中南大學(xué)湘雅醫(yī)院周巧玲(12篇)、解放軍昆明總醫(yī)院魏玲(10篇)、四川大學(xué)華西醫(yī)院鄧玨琳(9篇)、湖北省中醫(yī)院王小琴(9篇)、海南省人民醫(yī)院林書典(8篇)、重慶市急救醫(yī)療中心李寶善(8篇)。

圖1：N=243,E=363，Density=0.012 3，Modularity=0.954，Mean Silhouette=0.616 6，認(rèn)為該聚類是合理、可信服的。國內(nèi)關(guān)于Klotho相關(guān)領(lǐng)域作者從2005年后成多個(gè)穩(wěn)定的研究團(tuán)體，其中聯(lián)系最緊密、最穩(wěn)定的團(tuán)隊(duì)為來自馬厚勛、田小春、吳平、劉曉林、李寶善團(tuán)隊(duì)，主要研究Klotho基因單核苷酸多態(tài)性及組合與衰老相關(guān)性疾病的關(guān)系；其次分別是鄧玨琳、蔡盈盈、汪漢、田鵬、房晨鵬團(tuán)隊(duì)，主要研究Klotho基因及其表達(dá)產(chǎn)物與心血管系統(tǒng)相關(guān)研究；王小琴、鄒新蓉、王嵐、王長江、詹理睿、陳立、萬亞琴團(tuán)隊(duì)，主要研究Klotho基因/FGF23/Egr1信號(hào)通路研究溫補(bǔ)脾腎通腑瀉濁法對(duì)糖尿病腎病鈣磷代謝的影響；林書典、詹鋒、張延、劉穎團(tuán)隊(duì)，主要研究Klotho基因調(diào)控及其在腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化中的作用；魏玲、潘興華、尹娜、朱向情、李慧萍團(tuán)隊(duì)，主要研究Klotho基因及其蛋白與心血管疾病的關(guān)系；張寄南、高磊、何國平、金鳴峰團(tuán)隊(duì)，主要研究Klotho基因與心血管相關(guān)性聯(lián)系。

圖1 Klotho相關(guān)研究領(lǐng)域作者共現(xiàn)聚類圖

2.5.3機(jī)構(gòu)分析 參數(shù)設(shè)置：Time Slicing：2001～2019年，每1年為一個(gè)時(shí)間切片；Node Types：機(jī)構(gòu)(Institution)；Selection Criteria：Top100 per slice；Pruning：None；余設(shè)置同作者參數(shù)設(shè)置。機(jī)構(gòu)發(fā)文量在一定程度上代表該機(jī)構(gòu)某一科學(xué)領(lǐng)域的科研能力。合并同義詞或二級(jí)學(xué)科：重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院老年病科、重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院老年科；中南大學(xué)湘雅醫(yī)院腎內(nèi)科、中南大學(xué)湘雅醫(yī)院腎病科；南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化醫(yī)學(xué)中心、南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化醫(yī)學(xué)中心南京醫(yī)科大學(xué)消化內(nèi)鏡中心。因中南大學(xué)湘雅醫(yī)院腎內(nèi)科、中南大學(xué)湘雅醫(yī)院急診科同為中南大學(xué)湘雅醫(yī)院機(jī)構(gòu)，合并后最高產(chǎn)機(jī)構(gòu)為重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院老年病科(19篇)，其次依次為中南大學(xué)湘雅醫(yī)院(11篇)、四川大學(xué)華西醫(yī)院老年科(4篇)、江蘇大學(xué)附屬武進(jìn)醫(yī)院心內(nèi)科(4篇)、南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化醫(yī)學(xué)中心(4篇)、海南省人民醫(yī)院腎病風(fēng)濕科(4篇)、湖北省中醫(yī)院(3篇)、湖北中醫(yī)藥大學(xué)老年醫(yī)學(xué)研究所(3篇)、湖北省榮軍醫(yī)院腎內(nèi)科(3篇)。

經(jīng)Citespace處理后得到Klotho相關(guān)領(lǐng)域機(jī)構(gòu)共現(xiàn)聚類圖，N=34,E=10，Density(網(wǎng)絡(luò)密度)=0.017 8，Modularity=0.935，但Mean Silhouette只為0.375，部分機(jī)構(gòu)之間雖有合作，如：四川大學(xué)華西醫(yī)院老年科與成都市第三人民醫(yī)院心內(nèi)科、湖北中醫(yī)藥大學(xué)老年醫(yī)學(xué)研究所與湖北省榮軍醫(yī)院腎內(nèi)科，但合作關(guān)系不夠緊密，不能形成明顯聚類。大部分為醫(yī)院內(nèi)部科室間合作及單個(gè)科研機(jī)構(gòu)。見圖2。

圖2 Klotho相關(guān)研究領(lǐng)域機(jī)構(gòu)共現(xiàn)聚類圖

2.5.4研究熱點(diǎn)分析 參數(shù)設(shè)置：Time Slicing：2001～2019年，每4年為1個(gè)時(shí)間切片；默認(rèn)設(shè)置；Node Types：關(guān)鍵詞(Keyword)；余設(shè)置同作者參數(shù)設(shè)置。

關(guān)鍵詞是對(duì)文章的精煉與高度概括，代表科學(xué)研究的熱點(diǎn)〔9〕。表1是出現(xiàn)頻次≥10次的關(guān)鍵詞，出現(xiàn)頻次排名前8名的關(guān)鍵詞為Klotho蛋白、Klotho基因、成纖維細(xì)胞生長因子23、氧化應(yīng)激、單核苷酸多態(tài)性、慢性腎臟病、衰老、糖尿病腎病。中介中心性(Centrality)是測度節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中重要性的一個(gè)指標(biāo)，有些關(guān)鍵詞雖出現(xiàn)頻次低，但具有高度中心性。中心性排名前8名的關(guān)鍵詞：基因表達(dá)(1.12)、高血壓(0.75)、成纖維細(xì)胞生長因子(0.58)、纈沙坦(0.57)、腎小管上皮細(xì)胞(0.55)、冠狀動(dòng)脈(0.54)、血管緊張素Ⅱ(0.52)、維持性血液透析(0.41)。見圖3。

表1 Klotho相關(guān)研究高頻關(guān)鍵詞(頻次≥10次)

圖3 Klotho相關(guān)研究關(guān)鍵詞共現(xiàn)聚類圖

經(jīng)Citespace分析關(guān)鍵詞共形成12個(gè)聚類，如表2、圖4所示，#0規(guī)模最大。#8聚類成員相似性越高。#10為年代距離現(xiàn)在最近的聚類，包含急性腎損傷、細(xì)胞凋亡、絲裂原激活的蛋白激酶、心臟手術(shù)、心室重構(gòu)等主題。

由圖4關(guān)鍵詞形成的時(shí)線圖可以將Klotho領(lǐng)域研究關(guān)鍵詞分為3個(gè)時(shí)間段：2001～2005年高頻關(guān)鍵詞為基因表達(dá)、衰老；2006～2015年出現(xiàn)高頻關(guān)鍵詞為Klotho基因、Klotho蛋白、成纖維細(xì)胞生長因子23、氧化應(yīng)激、單核苷酸多態(tài)性、慢性腎臟病、糖尿病腎病、高血壓、基因多態(tài)性、凋亡、可溶性Klotho蛋白、血管鈣化、動(dòng)脈粥樣硬化、急性腎損傷、冠心病、糖尿病、老年、鈣磷代謝、多態(tài)性、小鼠、甲基化、心力衰竭、血液透析；2016年至今出現(xiàn)高頻關(guān)鍵詞分別為增殖、急性腦梗死、終末期腎病、β-catenin、腎元顆粒、腹膜透析、頸動(dòng)脈粥樣硬化、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、黃芪。由上可知早期Klotho領(lǐng)域研究熱點(diǎn)為Klotho基因及其與衰老相關(guān)的研究；中期進(jìn)一步研究Klotho基因多態(tài)性、Klotho基因及相關(guān)產(chǎn)物與成纖維細(xì)胞生長因子23的關(guān)系及Klotho基因及蛋白與衰老相關(guān)疾病慢性腎臟病、糖尿病、冠心病、高血壓之間的關(guān)系；近期研究熱點(diǎn)集中Klotho/Wnt/β-catenin信號(hào)通路在慢性腎臟病中的作用及通過中藥調(diào)節(jié)FGF-Klotho內(nèi)分泌軸來治療疾病。

表2 Klotho相關(guān)研究關(guān)鍵詞聚類標(biāo)簽

圖4 2001～2019年Klotho相關(guān)領(lǐng)域關(guān)鍵詞時(shí)線圖

2.5.5研究前沿分析 關(guān)鍵詞突現(xiàn)是指關(guān)鍵詞在某一時(shí)間內(nèi)頻次迅速上升，代表科學(xué)研究熱點(diǎn)及前沿〔11〕。如圖5所示，2001～2011年突現(xiàn)詞為衰老、基因表達(dá)；2006～2013年突現(xiàn)詞為Klotho基因、福辛普利、血管緊張素Ⅱ、小鼠、高血壓、老年、單核苷酸多態(tài)性。2016～2019年突現(xiàn)詞為成纖維細(xì)胞因子23、慢性腎臟病、糖尿病腎病。說明成纖維細(xì)胞因子23、慢性腎臟病、糖尿病腎病是Klotho相關(guān)領(lǐng)域研究前沿。

圖5 Klotho相關(guān)研究關(guān)鍵詞共現(xiàn)聚類圖

3 討 論

隨著老齡化社會(huì)到來，研究人類特有的衰老機(jī)制，并將研究成果轉(zhuǎn)化應(yīng)用于防治與衰老相關(guān)疾病，以延長健康壽命，已變得越來越重要〔12〕。Klotho最初被認(rèn)為是一種抗衰老基因，當(dāng)其在小鼠體內(nèi)過度表達(dá)時(shí)延長壽命；表達(dá)降低時(shí)會(huì)加速衰老。自1997年Klotho基因被發(fā)現(xiàn)后，各國學(xué)者從多角度開展Klotho相關(guān)研究。國內(nèi)關(guān)于Klotho相關(guān)研究可分為兩個(gè)階段，①萌芽期：2001～2005年處于萌芽階段，學(xué)者們開始關(guān)注Klotho基因生理結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)效應(yīng)研究〔13〕；②快速發(fā)展期：隨著越來越多的學(xué)者關(guān)注Klotho相關(guān)研究，從2006年開始發(fā)文量快速增長，2011～2016年雖有起伏，但仍保持較高的發(fā)文量，平均年發(fā)文量約43篇。自2009年國家自然科學(xué)基金委員會(huì)成立了醫(yī)學(xué)科學(xué)部以后，國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目著力提高我國醫(yī)學(xué)科學(xué)基礎(chǔ)研究和應(yīng)用基礎(chǔ)研究水平〔14〕，2016 年開始試點(diǎn)實(shí)施基礎(chǔ)科學(xué)中心項(xiàng)目〔15〕。國家及地方也重視支持關(guān)于Klotho相關(guān)領(lǐng)域的研究，加大項(xiàng)目基金的投入，受基金支持的文獻(xiàn)占總文獻(xiàn)的44.8%。

Klotho基因由5個(gè)外顯子組成和4個(gè)內(nèi)含子組成，編碼長1 014個(gè)氨基酸Ⅰ型單次跨膜蛋白，主要表達(dá)于腎臟遠(yuǎn)曲小管和大腦脈絡(luò)叢，少數(shù)表達(dá)于垂體、甲狀旁腺、胰腺、卵巢、睪丸和胎盤等內(nèi)分泌器官〔1,16〕。目前發(fā)現(xiàn)的Klotho蛋白包括α-Klotho,β-Klotho及γ-Klotho 3種蛋白，各自發(fā)揮不同功能。

人類FGF基因由22個(gè)成員組成，被分為7個(gè)亞族,根據(jù)其作用機(jī)制被分為3個(gè)亞科(胞內(nèi)、旁分泌和內(nèi)分泌FGFs)。由于胞內(nèi)FGFs(包含F(xiàn)GF11～14)不典型，不需要與FGF受體結(jié)合而發(fā)揮作用，目前主要研究的兩個(gè)亞科為旁分泌FGFs和內(nèi)分泌FGFs。旁分泌FGFs包含15個(gè)成員，通過肝素/硫酸乙酰肝素與FGFR的胞外域結(jié)合和活化FGFRs的酪氨酸激酶信號(hào)而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。內(nèi)分泌FGFs由FGF19、FGF21和FGF23組成，具有抑制肝細(xì)胞內(nèi)膽汁酸合成、促進(jìn)脂肪細(xì)胞的脂肪分解、抑制磷酸鹽再吸收及腎小管細(xì)胞中維生素D的生物合成作用，需要跨膜蛋白Klotho基因家族作為共受體結(jié)合同源性FGF受體發(fā)揮〔17,18〕。從而開啟關(guān)于FGF、FGFR、Klotho內(nèi)分泌系統(tǒng)的研究，包括FGF23-Klotho介導(dǎo)的骨-腎-甲狀旁腺內(nèi)分泌軸；FGF15/19-β klotho介導(dǎo)的腸-肝-膽內(nèi)分泌軸；FGF21-β klotho介導(dǎo)的肝-脂肪內(nèi)分泌軸等〔18～22〕。

研究發(fā)現(xiàn)小鼠缺乏Klotho或FGF23不僅可引起高磷血癥，也出現(xiàn)一系列衰老的表現(xiàn)，包括生長遲緩、性腺功能減退、胸腺退化、皮膚萎縮、肌肉萎縮、血管鈣化、骨質(zhì)疏松、肺氣腫、認(rèn)知障礙、聽力障礙、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性〔1,23〕。Klotho與FGF23這種特殊的生理結(jié)構(gòu)與病理表現(xiàn)使學(xué)者更加關(guān)注Klotho與FGF23之間的關(guān)系。FGF23是由骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞合成分泌的細(xì)胞因子,與α-Klotho/FGFRs復(fù)合物結(jié)合傳遞信息，參與體內(nèi)鈣磷代謝及維生素D的合成。FGF23-Klotho信號(hào)通路成為近些年國外研究的熱點(diǎn)，通路異常導(dǎo)致多種內(nèi)分泌疾病的發(fā)生，如心血管疾病、內(nèi)分泌疾病、腫瘤、腦血管疾病，尤其與慢性腎臟病密切相關(guān)，可能因腎臟是FGF23的主要靶器官，且分泌大量的α-Klotho〔8〕。

糖尿病腎病是糖尿病微血管病的主要并發(fā)癥之一，現(xiàn)有的治療手段及危險(xiǎn)因素的控制也無法逆轉(zhuǎn)糖尿病腎病向終末期腎病的發(fā)展，尋找新的糖尿病腎病治療靶點(diǎn)已成國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。Klotho作為一種抗衰老基因，是FGF的共受體，可調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、增殖、維生素D代謝及鈣磷代謝，參與血管鈣化和腎纖維化的發(fā)生發(fā)展〔24〕。Klotho及其介導(dǎo)的信號(hào)通路可能是治療糖尿病腎病的潛在靶點(diǎn)〔25～28〕。

結(jié)合高頻關(guān)鍵詞、關(guān)鍵詞聚類時(shí)線圖、關(guān)鍵詞突現(xiàn)詞分析，國內(nèi)近期關(guān)于Klotho研究熱點(diǎn)集中于參與腎臟相關(guān)疾病的發(fā)生的兩條信號(hào)通路。①FGF-Klotho內(nèi)分泌軸。我國關(guān)于FGF-Klotho內(nèi)分泌軸研究包括Klotho/FGF23/Egr1、Klotho/FGFR1/FGF2信號(hào)通路，主要研究團(tuán)隊(duì)為王小琴團(tuán)隊(duì)，通過中醫(yī)藥干預(yù)FGF-Klotho內(nèi)分泌軸來改善糖尿病腎病鈣磷代謝。②Klotho/Wnt/β-catenin信號(hào)通路：Klotho調(diào)控Wnt/β聯(lián)蛋白(β-catenin)信號(hào)通路在腎間質(zhì)纖維化發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，通過干預(yù)Klotho/Wnt/β-catenin信號(hào)通路可延緩腎臟纖維化。未來國內(nèi)更加關(guān)注Klotho與FGF23、慢性腎臟病、糖尿病腎病的研究。