夏申宏 李子廣 邵璐 生海燕

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，安徽 蚌埠 233000)

由于環(huán)境污染等因素，肺癌在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率均較高，嚴(yán)重威脅公眾的生命安全〔1〕。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是最常見的肺癌類型之一，約占肺癌患者的80%〔2〕。臨床顯示，多數(shù)NSCLC患者前往醫(yī)院就診時，疾病已進(jìn)展為中晚期階段，據(jù)統(tǒng)計(jì)，該病的5年生存率極低，僅有20%左右，死亡患者中以老年人口為主〔3，4〕。目前，盡管臨床可通過手術(shù)、放化療等手段來對老年NSCLC患者進(jìn)行治療，以期達(dá)到清除病灶、延緩患者生命周期的目的，但部分患者接受手術(shù)、放化療等治療后仍可能會出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，預(yù)后效果并不理想〔5，6〕。隨著分子遺傳學(xué)、分子生物學(xué)的深入研究，國內(nèi)外學(xué)者對肺癌的病因及發(fā)生機(jī)制也逐步有了更深入的認(rèn)識，許多致癌因素均可通過失活抑癌基因或激活原癌基因而使細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化和癌變?，F(xiàn)今，積極尋找有效的分子標(biāo)記物對早期診斷、靶向治療及判斷預(yù)后具有十分積極的意義。文獻(xiàn)報(bào)道〔7～9〕，縫隙連接蛋白(Cx)37是縫隙連接蛋白中的一種，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移、凋亡的能力；G蛋白耦聯(lián)受體(GPR)120則是機(jī)體中十分重要的一種G蛋白耦聯(lián)受體(GPCRs)，近年來被發(fā)現(xiàn)可在乳腺癌等惡性腫瘤組織中異常表達(dá)，二者與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移可能有密切關(guān)系。然而，對于Cx37、GPR120蛋白在NSCLC中的表達(dá)及在NSCLC進(jìn)展中作用的研究較少見。本研究觀察Cx37、GPR120蛋白在老年NSCLC患者癌及癌旁組織中表達(dá)，并分析其與老年NSCLC患者各臨床病理因素及生存預(yù)后間的關(guān)系，為老年NSCLC患者的個體化靶向治療提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1一般資料 蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院2017年1月至2018年9月確診為NSCLC老年患者的癌組織、同例患者的癌旁5 cm新鮮組織對應(yīng)蠟塊86例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)病理證實(shí)為NSCLC，年齡不低于60歲；②術(shù)后石蠟標(biāo)準(zhǔn)保存完好；③術(shù)前未行放、化療等抗腫瘤治療；④臨床資料、隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴其他惡性腫瘤；②伴心、肝、腎等重要臟器嚴(yán)重?fù)p害者；③伴自身免疫性疾病者；④伴精神疾病者。其中，男55例，女31例；年齡60～79歲，中位年齡66歲；病理類型：腺癌51例，鱗癌25例，其他10例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期51例，Ⅲ期35例。本研究經(jīng)醫(yī)院道德倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2檢測試劑 鼠抗人Cx37單克隆抗體(MAB466Hu21)購自武漢云克隆科技股份有限公司，Anti-GPCR GPR120兔抗人多克隆抗體(ab230869)購自美國Abcam生物公司，DAB、SP檢測試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3檢測方法 采用切片機(jī)將石蠟標(biāo)本4 μm厚切片，經(jīng)脫蠟、脫苯、水化后采用免疫組化SP法檢測Cx37、GPR120蛋白表達(dá)，一抗Cx37、GPR120的稀釋比均為1∶100。Cx37蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色；GPR120蛋白則主要定位于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色或黃色。免疫組化結(jié)果判定〔10〕：①陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度評分：未著色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，黃色計(jì)2分，棕黃色計(jì)3分；②陽性細(xì)胞占比：隨機(jī)選擇5個400倍視野，陽性細(xì)胞占比在0～10%計(jì)0分，11%～30%計(jì)1分，31%～60%計(jì)2分，61%～100%計(jì)3分。兩項(xiàng)評分結(jié)果相乘>3分認(rèn)定為陽性表達(dá)。操作均由同一位病理科醫(yī)師完成。

1.4隨訪 以查閱患者復(fù)查資料、電話、郵件、上門等形式進(jìn)行隨訪，隨訪期為2年，每3個月隨訪1次，記錄患者生存情況。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；生存過程描述采用Kaplan-Meimer生存曲線法，采用Log-rank法對比生存率。

2 結(jié) 果

2.1Cx37、GPR120蛋白表達(dá) Cx37在老年NSCLC患者癌組織中的陽性表達(dá)率(31.40%)明顯低于癌旁組織(68.60%，χ2=23.814，P<0.001)；GPR120蛋白在老年NSCLC患者癌組織中陽性表達(dá)率(59.30%)明顯高于癌旁組織(22.09%，χ2=24.668,P<0.001)。

2.2Cx37、GPR蛋白表達(dá)與NSCLC臨床特征的關(guān)系 在不同性別、年齡、吸煙、病理類型及腫瘤直徑的NSCLC患者中，Cx37、GPR蛋白在NSCLC癌組織中表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。當(dāng)患者TNM分期較高、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度較低時，Cx37蛋白陽性表達(dá)率明顯降低(P<0.05)。當(dāng)患者TNM分期較高、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時，GPR120蛋白陽性表達(dá)率明顯增高(P<0.05)。見表1。

2.3Cx37、GPR120蛋白表達(dá)與老年NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系 27例死亡，2年存活率為68.60%。采用Log-rank檢驗(yàn)顯示，Cx37蛋白表達(dá)陽性患者組存活率顯著高于陰性患者組(85.19% vs 61.02%;χ2=5.019,P=0.025)，GPR120蛋白表達(dá)陽性患者組存活率均顯著低于陰性患者組(58.86% vs 85.71%;χ2=8.463,P=0.003)。見圖1。

表1 Cx37、GPR蛋白陽性表達(dá)與NSCLC臨床特征的關(guān)系(n)

圖1 Cx37、GPR120蛋白表達(dá)與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系

3 討 論

縫隙連接是除了骨骼肌細(xì)胞和血細(xì)胞間之外，廣泛存在于其他組織細(xì)胞間的一種細(xì)胞連接形式。對于腫瘤的生長而言，維持腫瘤微環(huán)境情況良好至關(guān)重要，而腫瘤細(xì)胞間正是通過細(xì)胞間縫隙連接來實(shí)現(xiàn)各腫瘤細(xì)胞間的直接信息傳遞?？p隙連接是由膜上的連接子結(jié)構(gòu)單元所構(gòu)成的，這種特殊的通道蛋白被稱為連接蛋白，其不僅可以參與細(xì)胞間物質(zhì)交換的過程中，起到維持細(xì)胞間的信息傳遞，調(diào)控細(xì)胞分化、增殖，保障組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)性的作用，還可參與腫瘤細(xì)胞間上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化〔11，12〕。有文獻(xiàn)報(bào)道〔13〕，腫瘤細(xì)胞中Cx會缺失或降低，但在其周旁正常細(xì)胞的Cx則功能正常，改善Cx功能或是上調(diào)Cx表達(dá)對于抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有積極意義。研究顯示〔14〕，在肺組織中主要存在由Cx32、Cx37、Cx43等組成的縫隙連接。目前有關(guān)Cx43與腫瘤間關(guān)系的研究較多，周愛軍等〔15〕指出，甲狀腺癌組織中Cx43蛋白陽性表達(dá)率明顯低于正常組和良性組，且與患者的包膜侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、腫瘤大小有關(guān)；李國等〔16〕研究顯示，在肺腺癌組織中無論Cx43蛋白或mRNA，其陽性表達(dá)率均明顯低于正常肺組織中，且Cx43蛋白表達(dá)以胞質(zhì)為主，推測Cx43蛋白及mRNA陽性表達(dá)率降低是肺腺癌發(fā)生的原因之一。本研究結(jié)果提示Cx37在NSCLC發(fā)生、發(fā)展中可能起到抑癌作用。目前對于Cx37蛋白如何調(diào)控癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制尚未明確，推測其可能是通過介導(dǎo)細(xì)胞縫隙連接通訊對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用，同時降低腫瘤細(xì)胞遷徙及侵襲力〔17〕。

近些年，GPR120作為GPRS家族的重要成員之一正逐漸受到研究人員的重視，其被認(rèn)為不僅可參與調(diào)節(jié)激素分泌、脂質(zhì)生成等一系列脂質(zhì)代謝平衡過程，還與細(xì)胞增殖、遷移等能力關(guān)系密切，在腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移中起至關(guān)重要的作用〔18～20〕。研究顯示〔21，22〕，GPR120在胰腺癌、結(jié)直腸癌等消化系統(tǒng)腫瘤中的表達(dá)水平明顯提升，且能上調(diào)腫瘤細(xì)胞的增殖及遷移能力，可能是一種促腫瘤受體，對于促進(jìn)腫瘤的惡性發(fā)展具有重要意義。孟府陶等〔23〕研究結(jié)果表明，GPR120在膽管癌組織中的表達(dá)水平較癌旁正常膽管黏膜上皮組織中差異明顯，且其水平與膽管癌患者的TNM分期、腫瘤組織分化程度、神經(jīng)侵犯、淋巴轉(zhuǎn)移等多種臨床病理因素具有一定聯(lián)系，推測GPR120蛋白在膽管癌的發(fā)生、發(fā)展及生物學(xué)行為中均起到一定的正性上調(diào)作用。目前對于GPR120在NSCLC中的具體作用及參與機(jī)制尚不清楚，但在多項(xiàng)基礎(chǔ)研究中顯示〔24，25〕，GPR120信號可通過誘導(dǎo)分泌白細(xì)胞介素-8、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及前列腺素E2等促血管生成因子來發(fā)揮促進(jìn)瘤內(nèi)血管形成的作用，且此環(huán)節(jié)主要通過GPR120活化的PI3K/Akt-NF-κB信號通路的開放來實(shí)現(xiàn)，推測在NSCLC中GPR20蛋白高表達(dá)可促使VEGF表達(dá)上調(diào)，使NSCLC 腫瘤細(xì)胞的生長、遷移及侵襲能力有所增強(qiáng)，癌血管生成加速，最終導(dǎo)致腫瘤組織向更深、更遠(yuǎn)處浸潤轉(zhuǎn)移。

本研究結(jié)果表明Cx37、GPR120蛋白表達(dá)水平與老年NSCLC患者生存期密切相關(guān)，均可能有預(yù)測NSCLC預(yù)后的潛力。

綜上，Cx37蛋白在老年NSCLC患者癌組織中低表達(dá)，而GPR120蛋白則在癌組織中高表達(dá)，且二者表達(dá)水平均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、臨床TNM分期及2年存活率密切相關(guān)，二者的表達(dá)可能與NSCLC的發(fā)生及其惡性轉(zhuǎn)化和侵襲轉(zhuǎn)移之間存在重要的因果聯(lián)系，Cx37可能起到抑癌作用，而GPR120可能起到促癌作用，二者均有希望成為老年NSCLC患者臨床藥物研發(fā)治療的新靶點(diǎn)及預(yù)后判斷的一項(xiàng)分子標(biāo)志物。