孫雪梅，呂心蕊，儲 偉，朱曉筱，周蘭蘭

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，安徽 合肥 230022；2.深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)護學(xué)院，廣東 深圳 518055)

腎病綜合征(nephrotic syndrome，NS)是一種由多種病因引發(fā)，以腎小球基底膜通透性升高為主的原發(fā)性腎臟疾病，這種疾病的臨床癥狀是高尿蛋白、高度水腫、高脂血癥和低蛋白血癥，對身體危害較大[1-2]。研究顯示，在腎臟疾病中，當(dāng)腎小球濾過的通透性增大時，會導(dǎo)致體內(nèi)大量蛋白質(zhì)隨尿液排出。高尿蛋白不僅是腎臟受損的一個指標，還是腎病發(fā)生發(fā)展的一個重要因素[3]。高蛋白尿與腎小球足細胞足突間裂孔隔膜受損及相關(guān)蛋白的表達異常導(dǎo)致腎小球濾過屏障的破壞密切相關(guān)。Nephrin是首個被發(fā)現(xiàn)且證實與濾過屏障相關(guān)的足細胞蛋白[4]。瞬時性受體電位通道6(transient receptor potential 6，TRPC6)是跨膜蛋白通道蛋白，主要分布在腎小球外層的足細胞中，同時在內(nèi)皮細胞和系膜上也有表達。TRPC6作為非選擇性的陽離子通道，主要介導(dǎo)鈣離子的內(nèi)流，并激活下游信號。有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)足細胞受損會導(dǎo)致TRPC6蛋白的升高[5-6]，nephrin蛋白和TRPC6蛋白兩者間有共定位并且受同一種酶的調(diào)節(jié)，本實驗進一步研究nephrin蛋白和TRPC6蛋白在腎病發(fā)展過程中的作用。

目前，腎病綜合征的臨床治療主要用糖皮質(zhì)激素((glucocorticoid，GC)及其他免疫抑制劑，雖能控制病情，但長期應(yīng)用可能會導(dǎo)致感染、高血糖及股骨頭壞死等嚴重并發(fā)癥[7-8]。地塞米松(dexamethasone，Dex)是GC類藥物，因其抗炎、抗過敏、休克、抗毒等療效強大，極易產(chǎn)生與治療目的無關(guān)的反應(yīng)，限制其臨床的應(yīng)用。如何能在確保其發(fā)揮最大治療效果的前提下盡可能降低毒副作用，成為擺在臨床及藥物研制者面前的一道難題。地塞米松緩釋劑(sustained-release of dexamethasone，SR Dex)作為一種新型的長效藥[9]，采用腎囊內(nèi)植入給藥，可使藥物持續(xù)恒速釋放，使病灶部位血藥濃度持續(xù)穩(wěn)定在治療范圍內(nèi)，因而可能具有非常好的治療效果。前期研究結(jié)果顯示，SR Dex對阿霉素腎病大鼠具有良好的保護作用[10]。本文進一步研究了SR Dex對藏紅花紅O家兔腎病模型的保護作用及機制，旨在為其今后的臨床應(yīng)用提供充足的理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及飼養(yǎng)雄性普通級新西蘭家兔，購自江蘇省南京江寧區(qū)青龍山動物場，生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2012-0008，體質(zhì)量(2.0-2.5)kg。家兔(每只/籠)正常攝取水和食物，(21-23)℃溫度和40%-70%濕度的飼養(yǎng)環(huán)境中飼養(yǎng)3 d后實驗。

1.2 主要藥品試劑與儀器地塞米松植入劑及受試藥的輔料，由安徽四維藥業(yè)提供，臨用前裝入消毒的植入劑專用植藥針。醋酸地塞米松，購自浙江仙琚制藥公司。臧紅花紅O(SafraninO)：購自Simga公司。nephrin(bs-4866R，1 ∶100)抗體和TRPC6(bs-2393R,1 ∶100)抗體均購自北京博奧森生物科技有限公司。高速冷凍離心機：德國Leica。ZH-B6型家兔代謝籠：購自正華生物儀器設(shè)備公司。Spectra Max 190全波長酶標儀：Molecular Devices。RM2255全自動切片系統(tǒng)：德國Leica。7500Real-Time PCR儀：Applied Biosystems。

1.3 家兔臧紅花紅O腎病模型制備[11-12]及腎囊注射術(shù)臧紅花紅O腎病模型采用連續(xù)二次兔耳緣靜脈注射1%臧紅花紅O方法，首次注射劑量15mg/只，3 h后再次注射15mg/只。家兔耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉(30 mg·kg-1)麻醉，然后在無菌條件下從背部做切口，分別暴露兩側(cè)腎脂肪囊，用植入受試藥的專用植藥針腎囊內(nèi)注射，逐層縫合，縫合處滴少許10 U單位青霉素鈉溶液。

1.4 實驗分組及給藥家兔按體重隨機分為：對照組、假手術(shù)組、腎病模型組。造模1周后，腎病模型組分為模型組，受試藥輔料組、受試藥高中低劑量組、地塞米松陽性對照組。模型組只做腎囊穿刺，受試藥輔料組注射空白對照粒子(0.74 mg·kg-1)，受試藥組注射不同劑量的藥物(1.48、0.74、0.37 mg·kg-1)，假手術(shù)組除不注射給藥外，其他操作相同。陽性對照組采用灌胃給藥(0.4 mg·kg-1，q.d.)，持續(xù)給藥至第8周。

1.5 腎病家兔血液和尿液生化指標檢測取家兔的尿液和血液檢測尿素氮和血肌酐的含量，來評估腎臟功能的損傷程度。其中尿液檢測的時間點為：造模前、造模1周后、用藥后每周1次。血液檢測的時間點為：造模前、造模1周后、用藥后每周2次。

1.5.124 h尿蛋白檢測(urinary protein,mg·d-1) 收集24 h內(nèi)的尿液，收集尿液時禁食。從收集的尿液總量中取3 mL，在3 000 r·min-1的條件下離心5 min，取上清液測含量。采用雙縮脲法進行測定，將測得結(jié)果乘以24 h內(nèi)總尿液量，即得24 h尿蛋白的量。

1.5.2血肌酐(creatinine，Cr)和尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)的測定 耳緣動脈取血法采集血液，至于EP管中，室溫靜置1 h，在4 000 r·min-1的條件下離心10 min，取上清進行測量。采用苦味酸肌酐反應(yīng)測血清中肌酐的含量，酸性試劑反應(yīng)測尿素氮的含量，然后分別在510 nm和540 nm的條件下分別測OD值，用標準曲線法，分別計算求出血肌酐和尿素氮的量。

1.6 腎組織病理學(xué)檢測家兔麻醉后處死，取出腎組織分別進行PAS染色和天狼猩紅(sirius red，SR)染色，染色的具體實驗操作詳見試劑盒說明書指導(dǎo)，試劑盒購自Abcam公司。

1.7 免疫組化法(immunohistochemistry，IHC)檢測腎組織中Nephrin和TRPC6蛋白的表達家兔麻醉后處死，取出腎臟用免疫組化試劑盒檢測Nephrin、TRPC6蛋白表達，具體實驗操作詳見試劑盒說明書指導(dǎo)，試劑盒購自Simga公司。在顯微鏡下(400x)進行拍照，隨機取5個視野，用ImageJ進行分析，測平均光密度。

1.8 Real-time PCR檢測腎組織中Nephrin、TRPC6 的mRNA水平家兔麻醉后處死，取腎組織用TRIzol Reagent提取總RNA，TRIzol購自美國Invitrogen公司。基因序列如下：β-actin，F(xiàn)：5′-TTCCTTCC TGGGTATGGAAT-3′和R：5′-GAGGAGCAATGATCT TGATC-3′。Nephrin，F(xiàn)：5′-AGCCAGGAGCGTCTTTC TC-3′和R：5′-ACAGCACATTGAGGCGGTA-3′。TRPC6，F(xiàn)：5′-TTCCTGTTCCCTTCAACCTG-3′和R：5′-TCTGCATCCTCTTGGAAACC-3′。操作步驟嚴格按照Tli RNaseH Plus試劑盒說明書進行。

2 結(jié)果

2.1 SR Dex對藏紅花紅O腎病家兔24 h尿蛋白的影響如Tab 1所示，與對照組相比，模型組、輔料組在造模1周后，家兔24 h內(nèi)的尿蛋白顯著增加，直至實驗第9周差異均有顯著性(P<0.01)。與模型組相比，SR Dex不同劑量組在第3-8周時尿蛋白降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；陽性對照組在第4-8周時尿蛋白降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 SR Dex對藏紅花紅O腎病家兔血肌酐和血尿素氮的影響如Tab 2所示，與對照組相比，模型組、輔料組在造模后第1-9周血肌酐和尿素氮的含量均顯著增加，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型組相比，SR Dex不同劑量組在第2-8周血肌酐的量均減少，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；SR Dex高劑量組在第1-8周尿素氮的含量明顯降低(P<0.05)，SR Dex中、低劑量組在第3-8周尿素氮降低(P<0.01)。陽性對照組血肌酐和尿素氮的含量分別在第2-8周和第3-8周下降，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

Tab 1 Effect of SR Dex on urinary protein in safranine O-induced nephritis rabbits n=10)

續(xù)Tab 1

Tab 2 Effect of SR Dex on serum creatinine and urea nitrogen in safranine O-induced nephritis rabbits n=10)

續(xù)Tab 2

2.3 SR Dex對藏紅花紅O腎病家兔腎組織病理學(xué)的影響如Fig1所示，與對照組比較，模型組、輔料組中腎小球上皮系膜面積變大，基底膜明顯加厚。SR Dex不同劑量組和陽性對照組均可不同程度的減輕腎組織病理損傷。

Fig 1 Effect of SR Dex on renal tissue histopathology in safranine O-induced nephritic rabbits n=3)A:control;B:Sham;C:model;D:Accessory;E-G:SR Dex 0.37,0.74,1.48 mg·kg-1;H:Dex 0.4 mg·kg-1.

如Fig2所示，與對照組比較，模型組和輔料組間質(zhì)纖維深染，腎小球的脂類沉積增重。SR Dex不同劑量組和陽性對照組均可不同程度的緩解間質(zhì)纖維深染和脂類沉積。

2.4 SR Dex對藏紅花紅O腎病家兔腎組織中nephrin表達的影響如Fig3所示，對照組、假手術(shù)組中nephrin呈棕色黃染顆粒狀。與對照組相比，模型組和輔料組nephrin分布減少，染色強度減弱，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型組相比，SR Dex不同劑量組和陽性對照組可不同程度的增加nephrin蛋白的含量，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。

Fig 2 Effect of SR Dex on renal tissue histopatholopy in safranine O-induced nephritis rabbits (SR×200) n=3)A:control;B:Sham;C:model;D:Accessory;E-G:SR Dex 0.37,0.74,1.48 mg·kg-1;H:Dex 0.4 mg·kg-1.

Fig 3 Effect of SR Dex on nephrin protein expression of renal tissues in safranine O-induced nephritic rabbits (IHC×200) n=4)A:control;B:Sham;C:model;D:Accessory;E-G:SR Dex 0.37,0.74,1.48 mg·kg-1;H:Dex 0.4 mg·kg-1.**P<0.01 vs control;#P<0.05,##P<0.01 vs model

2.5 SR Dex對藏紅花紅O腎病家兔腎組織中TRPC6表達的影響如Fig4所示，對照組、假手術(shù)組TRPC6呈棕色黃染顆粒狀。與對照組相比，模型組和輔料組TRPC6含量明顯增多，表現(xiàn)為棕色顆粒狀，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)。與模型組相比，SR Dex不同劑量組和陽性對照組均可抑制TRPC6的表達，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。

Fig 4 Effect of SR Dex on TRPC6 protein expression of renal tissues in safranine O-induced nephritic rabbits (IHC×200) n=4)A:control;B:Sham;C:model;D:Accessory;E-G:SR Dex 0.37,0.74,1.48 mg·kg-1;H:Dex 0.4 mg·kg-1.*P<0.05,**P<0.01 vs control;#P<0.05,##P<0.01 vs model

2.6 SR Dex對藏紅花紅O腎病家兔腎組織中nephrin蛋白mRNA水平的影響如Fig5所示，與對照組相比，模型組、輔料組中nephrin蛋白mRNA的量顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型組相比，SR Dex不同劑量組和陽性藥對照組nephrin蛋白mRNA的量均增加，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。

Fig 5 Effect of SR Dex on level of nephrin mRNA expression of renal tissues in safranine O-induced nephritic rabbits n=3)**P<0.01 vs control;#P<0.05,##P<0.01 vs model

2.7 SR Dex對藏紅花紅O腎病家兔腎組織中TRPC6蛋白mRNA水平的影響如Fig6所示，與對照組相比，模型組、輔料組中TRPC6 蛋白mRNA的量顯著增多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型組相比，SR Dex不同劑量組和陽性藥對照組中TRPC6蛋白mRNA的量明顯減少，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。

Fig 6 Effect of SR Dex on level of TRPC6 mRNA expression of renal tissues in safranine O-induced nephritic rabbits n=3)*P<0.05,**P<0.01 vs control;#P<0.05,##P<0.01 vs model

3 討論

本實驗采用耳緣靜脈注射臧紅花紅O的方法建立家兔腎病模型[11-12]，藏紅花紅O是一種有毒性的染料，其大量靜脈注射可造成家兔腎小管上皮的壞死，這一作用與腎小球腎病的臨床癥狀很像。此外，臧紅花紅O腎病模型還作為研究足細胞損傷檢測的模型。本研究使用雄性家兔進行造模，造模成功率高。實驗結(jié)果表明，在造模3 h后，家兔的尿液變成紅色；在造模24 h后，家兔食欲不振，發(fā)生腹瀉，尿蛋白量增加，血肌酐、尿素氮的量也明顯增加。家兔腎組織病理結(jié)果顯示，造模后出現(xiàn)腎小管上皮壞死，腎小球部分萎縮，伴隨著炎性細胞的浸潤等表現(xiàn)。本實驗結(jié)果顯示，SR Dex一次性腎囊植入可降低腎病家兔24 h尿蛋白的量。下調(diào)腎病家兔血肌酐和尿素氮的含量。同時腎臟病理組織學(xué)結(jié)果也顯示，SR Dex各劑量組可不同程度的改善腎小球上皮細胞的增生、腎小球基底膜的增厚以及腎小球內(nèi)脂類沉積。研究結(jié)果顯示，SR Dex一次性腎囊植入對藏紅花紅O所致腎病家兔具有較好的保護作用。

值得注意的是，本實驗結(jié)果顯示用藥前2周尿蛋白數(shù)值無明顯降低，究其原因可能與以下因素有關(guān)。尿蛋白檢測結(jié)果顯示，腎病模型組在1-9周造模期間，尿蛋白一直在持續(xù)升高，與文獻研究結(jié)果一致[11-12]，說明臧紅花紅O腎病模型隨時間延續(xù)，損害逐漸加重。也就是說造模前2周處于疾病的上升階段，不管是用藥組還是模型組腎病家兔的尿蛋白都是升高的。而本研究受試藥是緩釋劑，Tab 1中2 w為用藥1周時腎病家兔的尿蛋白量，此時藥物的作用還未凸顯。從結(jié)果數(shù)據(jù)來看，在用藥兩周后(Tab 1中3 w)開始發(fā)揮治療作用，腎病家兔的尿蛋白開始下降，且隨著用藥時間逐步延長，尿蛋白數(shù)值逐漸下降，說明藥物可以明顯降低尿蛋白?？傊?，研究結(jié)果顯示受試藥可有效降低腎損指標，且維持時間較長。

足細胞位于腎小球上皮外層，胞體較大，呈多突狀，又稱足突。足突之間連接成裂孔隔膜，這些裂孔隔膜是保證腎小球正常濾過的屏障[13]。據(jù)文獻報道，腎小球濾過系統(tǒng)的損傷后會產(chǎn)生大量蛋白尿，高蛋白尿的產(chǎn)生可能與足突之間裂孔隔膜的完整性受損有關(guān)。足突之間裂孔隔膜中nephrin、TRPC6蛋白表達與分布對穩(wěn)定裂孔隔膜結(jié)構(gòu)的完整性很重要。nephrin是首個被發(fā)現(xiàn)并已經(jīng)證實的足細胞分泌蛋白[4]，位于19q13.1染色體上，其中NPHS1的突變會導(dǎo)致蛋白尿的產(chǎn)生[14]。TRPC6是在2005年被發(fā)現(xiàn)，因其與腎臟疾病之間的關(guān)系很快受到大家的關(guān)注。TRPC6位于裂孔隔膜，是裂孔隔膜相關(guān)蛋白，還是與蛋白尿有關(guān)的通道蛋白[15]，其主要功能為介導(dǎo)鈣離子內(nèi)流增多，并通過調(diào)控下游信號發(fā)揮功能。足細胞骨架結(jié)構(gòu)蛋白的變化可能與TRPC6介導(dǎo)的鈣內(nèi)流相關(guān)。本結(jié)果顯示，SR Dex可提高造模后nephrin的表達，降低TRPC6的表達，與類似文獻研究一致[16-18]。所以對TRPC6通道的阻斷或許會成為治療腎臟疾病的新靶點。

綜上所述，SR Dex腎囊內(nèi)注射給藥對藏紅花紅O腎病損傷具有很好保護作用，其作用機制可能與調(diào)節(jié)腎臟nephrin和TRPC6蛋白表達，增強足細胞濾過屏障功能有關(guān)。本實驗結(jié)果為臨床更有效的應(yīng)用該類藥物提供了實驗基礎(chǔ)。